Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man schnelle low-cost Luziferase-Assays bei mittlerem Durchsatz mit einer Insulin-verknüpften Gaußsia-Luziferase als Proxy für Insulinsekretion aus Beta-Zellen durchführt. Der Assay kann mit den meisten Lumineszenzplattenlesern und Mehrkanalpipetten durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Die Durchführung von Antikörper-basierten Assays für die sekrete Insulin-Nachprobensammlung erfordert in der Regel ein paar Stunden bis zu einem Tag Assay-Zeit und kann teuer sein, je nach dem spezifischen Assay. Abgesonderte Luziferase-Assays beschleunigen die Ergebnisse und senken die Assay-Kosten pro Probe erheblich. Hier stellen wir einen relativ ungenutzten Ansatz zur Messung der insulinsekretotischen Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen mit Gaussia luciferase vor, die genetisch in das C-Peptid eingefügt wurde. Während der proteolytischen Verarbeitung von Proinsulin wird das C-Peptid ausgeschnitten und die Luziferase innerhalb des Insulinsekretotische vesikelfrei freigesetzt, wo es mit Insulin mitsekretiert wird. Die Ergebnisse können innerhalb von Minuten nach der Probenentnahme aufgrund der Geschwindigkeit von Luziferase-Assays erhalten werden. Eine Einschränkung des Assays ist, dass es sich um eine relative Messung der Insulinsekretion handelt und nicht um eine absolute Quantifizierung. Dieses Protokoll ist jedoch wirtschaftlich, skalierbar und kann mit den meisten Standard-Leuchtplattenlesern durchgeführt werden. Analoge und digitale Mehrkanalpipetten ermöglichen mehrere Schritte des Assays. Viele verschiedene experimentelle Variationen können gleichzeitig getestet werden. Sobald eine fokussierte Reihe von Bedingungen entschieden ist, sollten Insulinkonzentrationen direkt mit Antikörper-basierten Assays mit Standardkurven gemessen werden, um die Ergebnisse des Luziferase-Assays zu bestätigen.

Einleitung

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Insulinsekretion aus einer genetisch veränderten Beta-Zelllinie schnell und kostengünstig im 96-Well-Platten-Format zu erhalten. Der Schlüssel zu diesem Protokoll ist eine modifizierte Version von Insulin mit der natürlich sezernierten Gaussia-Luziferase (GLuc, 18 kDa) in das C-Peptid eingeführt, um Insulin-Gaussia (InsGLuc)^1,2zu erzeugen. Andere größere Proteine, wie GFP (ca. 25 kDa), wurden erfolgreich in das C-Peptid von Insulin eingeführt und zeigten die erwartete posttranslationale Verarbeitung von Proinsulin-GFP zu Insulin und GFP-C-Peptid^3,4. Für den Assay in diesem Protokoll wurde GLuc für die Expression von Säugetieren kodonoptimiert und zwei Mutationen wurden eingeführt, um die glühende Kinetik^5,6zu verbessern. Mehrere Kombinationen und Replikationen von Behandlungsbedingungen können einfach im 96-Well-Plattenformat getestet werden und die Sekretionsergebnisse können unmittelbar nach dem Experiment erzielt werden.

Ein großer Vorteil, wie bereits erwähnt², sind die niedrigen Kosten dieser auf Luziferase basierenden Sekretionsmessung (< 0,01 USD/well), die sie von den relativ höheren Kosten und technischen Aspekten enzymgebundener Immunsorbent-Assays (ELISAs) ( > 2 USD/well) und homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) oder andere Aufenthalten von Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)-basierten Antikörpern (> 1/well) Im Vergleich zu diesen Antikörper-basierten Assays, die die Insulinkonzentration durch Bezugnahme auf eine Standardkurve messen, misst der InsGLuc-Assay die sekretorische Aktivität als relativen Vergleich zu Kontrollbrunnen auf der Platte. Aus diesem Grund erfordert jedes Experiment die Einbeziehung ordnungsgemäßer Kontrollen. Diese Unterscheidung ist ein Kompromiss, um schnelle und kostengünstige Messungen zu ermöglichen. Jedoch, InsGLuc Sekretion wurde gezeigt, dass stark mit Insulin-Sekretion gemessen mit ELISA^1,2. Diese Technologie wurde für das Hochdurchsatzscreening^1,2,7 skaliert und hat zur Identifizierung neuartiger Modulatoren der Insulinsekretion einschließlich eines spannungsgebundenen Kaliumkanalinhibitors^{7 geführt.} sowie ein natürlicher Produktinhibitor der Zellfunktion, Chromomycin A₂⁸. Die Verwendung von InsGLuc ist am besten geeignet für Forscher, die planen, kontinuierlich viele verschiedene Behandlungsbedingungen auf ihre Auswirkungen auf die Insulinsekretion zu testen. In Folgeexperimenten ist es notwendig, wichtige Befunde in einer elterlichen Zelllinie und optimalerweise in murinen oder menschlichen Inseln zu wiederholen und die Insulinsekretion mit einem Antikörper-basierten Assay zu messen.

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien, Medien und Puffern (Tabelle 1)

1. Bereiten Sie MIN6-Komplettmedium in 500 ml hochglukosen (4,5 g/L) Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit folgenden Additiven vor: 15% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 292 g/ml L-Glutamin und 50 Mercaptoethanol.
   HINWEIS: Die stabile Zelllinie wird in diesem Fall in 250 g/ml G418-Antibiotikum gehalten.
2. Bereiten Sie Krebs-Ringer BicarbonatPuffer (KRBH) durch eine Lösung mit 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂und 1 mg/mL radioimmunoassay-grade Rinderserumalbumin (BSA). Glucose ist zuzuführen, wenn aus einem 2 M Bestand angegeben.
   HINWEIS: KRBH wird verwendet, um die Zellen mit und ohne Stimulation zu inkubieren, um Insulin und/oder Gaussia luziferase Sekretion zu bewerten.
3. Bereiten Sie die Coelenterazin (CTZ) Lagerlösung wie folgt vor. Bereiten Sie versauertes Methanol vor, indem Sie 106 l konzentriertem HCl auf 10 ml Methanol aufbringen. Als nächstes lyophilisiertes CTZ in angesäuertem Methanol bei 1 mg/ml auflösen und bei -80 °C in Schraubkappenrohren lagern.
   HINWEIS: Diese Bestände behalten ausreichende Aktivität in routinemäßigen Luziferase-Assays, auch nach 1 Jahr ordnungsgemäßer Lagerung.
4. Bereiten Sie Gaußier luziferase (GLuc) Assay Puffer auf der Grundlage der Literatur⁹ sowie Patentinformationen¹⁰ zur Unterstützung in der Halbwertszeit der Gaußsia luciferase Assay in 96 Well Plate Format. Verwenden Sie die Formel: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% Glycerin, 1 mg/mL Na₂PO₄, 300 mM Natriumascorbat, 200 mM Na₂SO₃ in Wasser. Lagerbestände bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen den Puffer bei 4 °C aufbewahren.
5. Zur Vorbereitung der Gaussia-Luziferase-Arbeitslösung fügen Sie dem GLuc-Assaypuffer 4,2 l/ml der 1 mg/ml (2,36 mM) CTZ-Lagerlösung hinzu. Daraus ergibt sich eine 2x-Arbeitslösung von 10 m CTZ, die eine Endkonzentration von 5 m im Assay aufweist.

2. Kultur der InsGLuc MIN6-Zellen und Aussaat für Sekretionstests

1. Um MIN6-Zellen zu kulturieren, versuchen Sie, die Zellen einmal pro Woche mithilfe von Standard-Zellkulturtechniken auszusäen. Ändern Sie die Medien in den Zellen alle zwei bis drei Tage. Fügen Sie geeignete selektionsiöse Selektionsantibiotika, wie z. B. 250 g/ml G418, in die Medien ein.
   1. Um eine ausreichende Anzahl von Zellen wöchentlich für Experimente bereitzustellen, halten Sie die Zellen in T75-Flaschen aufrecht. Die Aussaat von 6 x 10⁶ Zellen pro T75 in 10 ml Medien ergibt in der Regel 30 x 10⁶ bis 40 x 10⁶ Zellen insgesamt pro T75 nach 7 Tagen Kultur.
2. Um Zellen für die Beschichtung in 96-Well-Platten vorzubereiten, waschen Sie eine konfluente T75 von InsGLuc MIN6-Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für ca. 5 min oder bis sich die Zellen vom Kolben lösen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration pro Milliliter.
   1. Verdünnen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf 1 x 10⁶ Zellen/ml, so dass 1 x 10⁵ Zellen in 100 l pro Brunnen in einer 96-Well-Platte entstehen. Die Zellen sollten für den Test nach 3–4 Tagen ausreichend konfluent sein.
      HINWEIS: Um die Kulturperiode zu verlängern, kann die Hälfte der Zellkonzentration plattiert werden. Medienveränderungen sind vor dem Tag des Testes nicht erforderlich, es sei denn, die Zellen sollen experimentellen Behandlungen unterzogen werden.

3. Glukose-stimulierte Gaußkoluzife-Sekretion-Test

1. Am Tag des Assays bereiten Sie genügend KRBH für das Experiment vor (Schritt 1.2). Mindestens 50 ml KRBH pro 96-Well-Platte sind erforderlich, daher bereiten Sie mindestens 75 ml vor, um einen ausreichenden Puffer für das Experiment zu gewährleisten. Bereiten Sie zusätzlichen Puffer vor, wenn verschiedene Kombinationen von medikamentösen Behandlungsbedingungen KRBH für die Verdünnung erfordern.
2. Bereiten Sie ein Reservoir mit glukosefreiem KRBH vor. Dekantieren Sie das Medium von 96-Well-Platten, indem Sie die Platte schnell über eine Laborspüle umkehren und dann fest auf einem Stapel Papiertücher bumchen, um überschüssiges Medium zu entfernen.
3. Mit einer elektronischen oder manuellen 8-Kanal-Pipette, Pipette 100 l /well KRBH aus dem Reservoir über die 96-Well-Platte(n). Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wähbe.
4. (Optionaler Schritt der Akutbehandlung) Wenn Sie keine medikamentösen Behandlungen durchführen, fahren Sie mit den Schritten 3.5 und 3.6 ohne Änderung fort. Um die Auswirkungen kleiner Moleküle auf die Insulinsekretion zu testen, können den Zellen während der Vorinkubationszeit, der Stimulationsphase oder beidem Verbindungen zugesetzt werden.
   1. Eine Technik besteht darin, dem KRBH in 1,5 ml-Rohren Chargen verbindungen hinzuzufügen und eine einstellbare 8-Kanal-Digitalpipette zu verwenden, um das Medikament-KRBH von den Röhren auf Zellen in 96-Well-Platten zu übertragen.
      HINWEIS: Wenn keine verstellbare Pipette verfügbar ist, kann eine Replik 96-Well-Platte von Drug-KRBH hergestellt werden und eine Standard 8-Kanal-Pipette kann verwendet werden, um Puffer zu übertragen. Weitere Änderungen am Behandlungsparadigma können vorgenommen werden, um Zellen für 24 h in Medien vor dem Test zu behandeln, wie zuvor beschrieben^1,8.
5. Fügen Sie 100 l KRBH mit der gewünschten Glukose- oder -konzentration hinzu und legen Sie die Schale 1 h im 37 °C-Inkubator.
   HINWEIS: Je nach experimentellem Layout ist es äußerst hilfreich, eine elektronische Mehrkanalpipette zu haben, die den Übergang der Kanalabstände von einer Säule von acht 1,5-ml-Rohren zu den 8 Reihen einer 96-Well-Platte ermöglicht.
6. Nach der 1 h Der Inkubation den Puffer in die Spüle dekantieren und fest auf dem Papiertuch bumen. Fügen Sie 100 L glukosefreien KRBH pro Brunnen hinzu, um den angesammelten Hintergrund der Gaußsia-Luziferase wegzuwaschen. Decant die Platte wieder und fügen Sie Kontroll- und Stimulatorische Bedingungen auf die Platte bei 100 l pro Brunnen. Legen Sie die Schale in den 37°C Inkubator für 1 h.
7. Sammeln Sie vorsichtig 50 l Überstand mit einer Mehrkanalpipette, wechseln Sie bei Bedarf die Spitzen zwischen den Behandlungsbedingungen, und übertragen Sie den Überstand auf eine saubere, undurchsichtige weiße 96-Well-Assay-Platte.
   HINWEIS: Weißwandige Klarbodenplatten können bei Bedarf verwendet werden, obwohl eine erhebliche Menge an Luziferase-Signal verloren geht.
8. Nach der Entnahme von 50 l KRBH-Überstand kann die Probe sofort untersucht werden. Bei Bedarf Proben bei 4 °C für ein paar Tage (GLuc-Aktivität Halbwertszeit von 6 Tagen) oder -20 °C für bis zu einem Monat versiegeln und lagern^11,12.

4. Abgesonderte Gaußierluzifase-Assay

1. Um die GLuc-Assay-Arbeitslösung vorzubereiten, pipette die benötigte Menge an CTZ-Lagerlösung (4,2 l/ml) in den GLuc-Assaypuffer. Um eine Erwärmung des CTZ zu verhindern, pipetten Sie den CTZ schnell am -80 °C Gefrierschrank oder halten Sie das Rohr auf Trockeneis.
2. Mit einer elektronischen Mehrkanalpipette können Sie schnell 50 L der GLuc-Assay-Arbeitslösung pro Brunnen über die 96-Well-Schale mit den gesammelten KRBH-Überwasserstoffen hinzufügen. Wenn sich tröpft an den Seiten von Brunnen Tröpfchen befinden, drehen Sie die Platte kurz in einer Tisch-Schaukel-Eimer-Zentrifuge.
3. Lesen Sie die Lumineszenz in einem geeigneten Plattenleser innerhalb weniger Minuten und lesen Sie jeden gut mit einer 0,1 s Integrationszeit.

Ergebnisse

Um die Leistung des Assays unter Kontrollbedingungen zu messen, kann eine einfache Glukose-Dosis-Wirkungs-Kurve oder eine Stimulation mit dem Diazoxid-Paradigma abgeschlossen werden. Im Falle ersterer sollte die Vorinkubation der Zellen für 1 h unter glukosefreien Bedingungen, gefolgt von der Behandlung von 1 h mit steigenden Glukosekonzentrationen, zu einer sehr geringen sekretotigen Aktivität bei und unter 5 mM führen, während eine erhöhte Sekretion über 8 mM Glukose (

Diskussion

Hierbei stellen wir eine Methode zur schnellen Bewertung der Glukose-stimulierten Insulinsekretionsreaktionen aus MIN6-Zellen vor. Für die besten Antworten im Test ist es wichtig, die MIN6-Zellen bei der richtigen Dichte auszusäen und sie zu 85-95% konfluent zu machen. Dies verbessert die Zellreaktionen auf Glukose aufgrund verbesserter Zell-Zell-Kontakte und Synchronisation, die sowohl in primären Inselchen^17,18,19,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710