Mesurer la sécrétion relative d'insuline à l'aide d'une mère porteuse co-sécrétée par Luciferase

Résumé

Ce protocole décrit comment effectuer des essais rapides de luciferase à faible coût à débit moyen à l'aide d'une luciferase Gaussia liée à l'insuline comme un proxy pour la sécrétion d'insuline à partir de cellules bêta. L'analyse peut être effectuée avec la plupart des lecteurs de plaques de luminescence et des pipettes multicanaux.

Résumé

L'exécution d'essais à base d'anticorps pour la collecte d'insuline sécrétée après l'échantillon nécessite généralement quelques heures à un jour de temps d'analyse et peut être coûteux, selon l'analyse spécifique. Les tests de luciferase sécrétés accélèrent les résultats et réduisent considérablement le coût d'analyse par échantillon. Ici nous présentons une approche relativement sous-utilisée pour évaluer l'activité sécrétrice d'insuline des cellules pancréatiques en utilisant la luciferase de Gaussia génétiquement insérée dans le C-peptide. Pendant le traitement protéolytique de la proinsuline, le C-peptide est excisé libérant la luciferase dans la vésicule sécrétrice d'insuline où elle est co-sécrétée avec l'insuline. Les résultats peuvent être obtenus dans les minutes qui suivent la collecte de l'échantillon en raison de la vitesse des tests de luciferase. Une limitation de l'analyse est qu'il s'agit d'une mesure relative de la sécrétion d'insuline et non d'une quantitation absolue. Cependant, ce protocole est économique, évolutif, et peut être exécuté en utilisant la plupart des lecteurs standard de plaque de luminescence. Les pipettes analogiques et numériques multicanaux facilitent plusieurs étapes de l'analyse. De nombreuses variations expérimentales peuvent être testées simultanément. Une fois qu'un ensemble ciblé de conditions sont décidés, les concentrations d'insuline devraient être mesurées directement utilisant des essais basés sur des anticorps avec des courbes standard pour confirmer les résultats d'essai de luciferase.

Introduction

La méthode présentée ici permet de sécrétion d'insuline à partir d'une lignée de cellules bêta génétiquement modifiées pour être évalué rapidement et à un prix abordable dans le format 96-bien-plaque. La clé de ce protocole est une version modifiée de l'insuline avec la luciferase Gaussia naturellement sécrétée (GLuc, 18 kDa) insérée (voir Figure 1) dans le C-peptide pour générer de l'insuline-Gaussia (InsGLuc)^1,2. D'autres protéines plus grandes, telles que le GFP (25 kDa), ont été insérées avec succès dans le Peptide C de l'insuline et ont montré le traitement post-traductionnel prévu de la proinsuline-GFP à l'insuline et au GFP-C-peptide^3,4. Pour l'astodonte dans ce protocole, GLuc a été codon-optimisé pour l'expression des mammifères et deux mutations ont été introduites pour améliorer la cinétique de lueur-comme^5,6. Les combinaisons multiples et les répliques des conditions de traitement peuvent être facilement testées dans le format 96-bien-plaque et les résultats de sécrétion peuvent être obtenus immédiatement après l'expérience.

Un avantage majeur, comme précédemment noté², est le faible coût de cette mesure de sécrétion à base de luciférase (lt; 0,01 $/puits) qui la différencie des coûts relativement plus élevés et des aspects techniques des essais immunosorbent liés aux enzymes (ELISA) ( 2 $/bien) et la fluorescence homogène résolue dans le temps (HTRF) ou tout autre anticorps à base de résonance de La Furster (FRET) (à partir de 1 $/bien) est à l'étude. Par rapport à ces essais à base d'anticorps, qui mesurent la concentration d'insuline en faisant référence à une courbe standard, l'analyse InsGLuc mesure l'activité sécrétrice comme comparaison relative aux puits de contrôle de la plaque. Pour cette raison, chaque expérience nécessite l'inclusion de contrôles appropriés. Cette distinction est un compromis pour permettre des mesures rapides et peu coûteuses. Cependant, la sécrétion InsGLuc a été démontrée pour être fortement corrélée avec la sécrétion d'insuline telle que mesurée par ELISA^1,2. Cette technologie a été mise à l'échelle pour le dépistage à haut débit^1,2,7 et a conduit à l'identification de nouveaux modulateurs de la sécrétion d'insuline, y compris un inhibiteur du canal de potassium à rayons de tension⁷ ainsi qu'un inhibiteur naturel du produit de la fonction cellulaire, la chromomycine A₂⁸. L'utilisation d'InsGLuc est plus appropriée pour les chercheurs qui prévoient de tester continuellement de nombreuses conditions de traitement différentes pour leur impact sur la sécrétion d'insuline. Dans les expériences de suivi, il est nécessaire de répéter les résultats clés dans une lignée cellulaire parentale, et de manière optimale dans les îlots murins ou humains, et de mesurer la sécrétion d'insuline à l'aide d'un test à base d'anticorps.

Protocole

1. Préparation des réactifs, des supports et des tampons (tableau 1)

1. Préparer le milieu complet MIN6 dans 500 mL de pénicilline à haute teneur en glucose (4,5 g/L) avec le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec les additifs suivants : 15 % de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 292 g/mL L-gluta, et 50 m - mercaptoéthanol.
   REMARQUE : La ligne stable de cellules dans ce cas est maintenue dans 250 'g/mL de l'antibiotique de G418.
2. Préparer le tampon de bicarbonate Krebs-Ringer (KRBH) en faisant une solution contenant 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, et 1 mg/mL radioimmunoassay-grade bovine serum albumin (BSA). Le glucose doit être ajouté lorsque spécifié à partir d'un stock de 2 M.
   REMARQUE : KRBH est employé pour incuber les cellules avec et sans stimulation afin d'évaluer la sécrétion d'insuline et/ou de luciferase de Gaussia.
3. Préparer la solution d'actions coelenterazine (CTZ) comme suit. Préparer le méthanol acidifié en ajoutant 106 l de HCl concentré à 10 ml de méthanol. Ensuite, dissoudre le CTZ lyophilisé dans du méthanol acidifié à 1 mg/mL et entreposer à -80 oC dans des tubes à bouchon s'acmoment.
   REMARQUE : Ces stocks conservent une activité suffisante dans les analyses de luciferase de routine, même après 1 an de stockage approprié.
4. Préparer Gaussia luciferase (GLuc) tampon d'assay basé sur la littérature⁹ ainsi que des informations de brevet¹⁰ pour aider à la demi-vie de l'assay de luciferase Gaussia dans 96 format de plaque de puits. Utilisez la formule: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glycérol, 1 mg/mL Na₂PO₄, 300 mM d'ascorbate de sodium, 200 mM Na₂SO₃ dans l'eau. Congeler les stocks à -20 oC. Après la décongélation, entreposer le tampon à 4 oC.
5. Pour préparer la solution de travail de la luciferase Gaussia, ajoutez 4,2 L/mL de la solution de stock CTZ de 1 mg/ml (2,36 mm) au tampon d'assay GLuc. Il en résulte une solution de travail 2x de 10 M CTZ qui aura une concentration finale de 5 M dans l'analyse.

2. Culture des cellules InsGLuc MIN6 et ensemencement pour les analyses de sécrétion

1. Pour la culture des cellules MIN6, trypsiniser et semer les cellules une fois par semaine en utilisant des techniques standard de culture cellulaire. Changer les médias sur les cellules tous les deux à trois jours. Inclure dans les médias des antibiotiques de sélection appropriés, tels que 250 g/mL de G418.
   1. Pour fournir un nombre suffisant de cellules par semaine pour des expériences, maintenir les cellules dans les flacons T75. L'ensemencement de 6 x 10⁶ cellules par T75 dans 10 ml de support donnera généralement 30 x 10⁶ à 40 x 10⁶ cellules au total par T75 après 7 jours de culture.
2. Pour préparer les cellules pour le placage dans des plaques de 96 puits, lavez un T75 confluent de cellules InsGLuc MIN6 deux fois avec du PBS et ajoutez 2 ml de trypsine. Incuber à 37 oC pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules se dissocient du flacon. Déterminer la concentration cellulaire par millilitre.
   1. Diluer les cellules dans un support complet à 1 x 10⁶ cellules/mL pour donner lieu à 1 x 10⁵ cellules dans 100 L par puits dans une plaque de 96 puits. Les cellules doivent être suffisamment confluentes pour l'attaque après 3 à 4 jours.
      REMARQUE : Pour prolonger la période de culture, la moitié de la concentration cellulaire peut être plaquée. Les changements médiatiques ne sont pas nécessaires avant le jour de l'élection, sauf si les cellules doivent être soumises à des traitements expérimentaux.

3. Test de sécrétion de luciférase Gaussia stimulée par le glucose

1. Le jour de l'assay préparer suffisamment de KRBH pour l'expérience (étape 1.2). Un minimum de 50 ml de KRBH par plaque de 96 puits est nécessaire, donc préparer au moins 75 ml pour assurer un tampon suffisant pour l'expérience. Préparer tampon supplémentaire si différentes combinaisons de conditions de traitement médicamenteux exigera KRBH pour la dilution.
2. Préparer un réservoir avec KRBH sans glucose. Décant le milieu de 96-puits plaque(s) en inversant rapidement la plaque sur un évier de laboratoire, puis bien tachère fermement sur une pile de serviettes en papier pour enlever l'excès de milieu.
3. À l'aide d'une pipette électronique ou manuelle à 8 canaux, pipette 100 L /well KRBH du réservoir à travers la plaque de 96 puits.s. Répétez l'opération pour un total de deux lavages.
4. (Étape facultative des traitements composés aigus) Si vous n'effectuez pas de traitements médicamenteux, passez par les étapes 3.5 et 3.6 sans modification. Pour tester les effets de petites molécules sur la sécrétion d'insuline, des composés peuvent être ajoutés aux cellules pendant la période de préincubation, la période de stimulation, ou les deux.
   1. Une technique consiste à ajouter des composés en lot à l'KRBH dans des tubes de 1,5 ml et à utiliser une pipette numérique réglable à 8 canaux pour transférer le médicament-KRBH des tubes aux cellules dans des plaques de 96 puits.
      REMARQUE : Si une pipette réglable n'est pas disponible, une réplique de 96 puits de drogue-KRBH peut être faite et une pipette standard à 8 canaux peut être utilisée pour transférer la mémoire tampon. D'autres modifications au paradigme de traitement peuvent être apportées pour traiter les cellules pendant 24 h dans les médias avant l'analyse, comme décrit précédemment^1,8.
5. Ajouter 100 l de KRBH contenant la concentration désirée de glucose ou de composés et placer le plat dans l'incubateur de 37 oC pendant 1 h.
   REMARQUE : Selon la disposition expérimentale, il est extrêmement utile d'avoir une pipette multicanal électronique qui permet de faire la transition des distances de canal d'une colonne de huit tubes de 1,5 mL aux 8 rangées d'une plaque de 96 puits.
6. Après le 1 h de préincubation, décanter le tampon dans l'évier et éponger fermement sur du papier essuie-tout. Ajouter 100 l de KRBH sans glucose par puits pour laver le fond accumulé de la luciferase Gaussia. Décant la plaque à nouveau et ajouter le contrôle et les conditions de stimulation à la plaque à 100 L par puits. Placer le plat dans l'incubateur à 37oC pendant 1 h.
7. Recueillir soigneusement 50 L de supernatant à l'aide d'une pipette multicanal, en changeant les pointes entre les conditions de traitement au besoin, et transférer le supernatant à une plaque blanche opaque propre 96-bien d'analyse.
   REMARQUE : Des plaques à fond clair à parois blanches peuvent être utilisées si nécessaire, bien qu'une quantité importante de signal de luciferase soit perdue.
8. Après la collecte de 50 L de supernatant KRBH, l'échantillon peut être évalué immédiatement. Si nécessaire, sceller et stocker les échantillons à 4 oC pendant quelques jours (activité GLuc demi-vie de 6 jours) ou -20 oC pour un mois^11,12.

4. Assay de luciferase secret de Gaussia

1. Pour préparer la solution de travail d'assay GLuc, pipette la quantité requise de solution de stock CTZ (4,2 l/mL) dans le tampon d'aspiration GLuc. Pour éviter le réchauffement de la CTZ, pipette le CTZ rapidement au congélateur de -80 oC ou de garder le tube sur la glace sèche.
2. À l'aide d'une pipette multicanal électronique, ajoutez rapidement 50 l de la solution de travail d'analyse GLuc par puits dans le plat de 96 puits contenant les supernatants KRBH collectés. S'il y a des gouttelettes sur les côtés des puits, faites-tourner brièvement la plaque dans une centrifugeuse à seau à balançoire sur table.
3. Lisez la luminescence dans un lecteur de plaque approprié en quelques minutes et lisez chaque puits avec un temps d'intégration de 0,1 s.

Résultats

Pour évaluer la performance de l'analyse dans des conditions de contrôle, une simple courbe dose-réponse au glucose ou une stimulation utilisant le paradigme du diazoxide peut être complétée. Dans le cas de l'ancien, pré-incubation des cellules pendant 1 h dans des conditions sans glucose suivie par le traitement pendant 1 h avec des concentrations croissantes de glucose devrait avoir comme conséquence très peu d'activité sécrétrice à et au-dessous de 5 mM, alors que la sécr...

Discussion

Ici nous présentons une méthode pour évaluer rapidement les réponses de sécrétion d'insuline glucose-stimulées des cellules de MIN6. Pour les meilleures réponses dans l'essai, il est important de semer les cellules MIN6 à la densité appropriée et leur permettre de devenir 85-95% confluent. Cela améliore les réponses cellulaires au glucose en raison de l'amélioration des contacts cellulaires et de la synchronisation, qui se produit à la fois dans les îlots primaires^17,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710