JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。

要約

分泌されたインスリンサンプルコレクションに対する抗体ベースのアッセイを行うには、通常、アッセイ時間の1日に数時間を要し、特定のアッセイに応じて高価になる可能性があります。分泌されたルシフェラーゼアッセイは、結果を促進し、サンプルあたりのアッセイコストを大幅に下げる。ここでは、C-ペプチド内に遺伝的に挿入されたガウシア・ルシフェラーゼを用いて膵β細胞からのインスリン分泌活性を測定する比較的使用されていないアプローチを提示する。プロインスリンのタンパク化処理中に、C-ペプチドは、インスリンと共分泌されるインスリン分泌性小胞内のルシフェラーゼを放出して取り除く。結果はルシフェラーゼアッセイの速度のためにサンプル収集後数分以内に得ることができる。アッセイの限界は、インスリン分泌の相対測定であり、絶対定量ではないことです。しかし、このプロトコルは経済的でスケーラブルであり、ほとんどの標準的な発光板リーダーを使用して実行することができます。アナログおよびデジタルマルチチャンネルピペットは、アッセイの複数のステップを容易にします。多くの異なる実験バリエーションを同時にテストすることができます。焦点を絞った条件が決定されたら、標準曲線を用いた抗体ベースのアッセイを使用してインスリン濃度を直接測定し、ルシフェラーゼアッセイ結果を確認する必要があります。

概要

ここで提示される方法は、遺伝子組み換えβ細胞株からのインスリン分泌を96ウェルプレート形式で迅速かつ手頃な価格でアッセイすることを可能にする。このプロトコルの鍵は、自然に分泌されたガウシア・ルシフェラーゼ(GLuc,~18 kDa)をCペプチドに挿入してインスリン・ガウシア(InsGLuc)1、2を生成するインスリンの改変バージョンである(図1参照)。GFP(〜25kDa)のような他のより大きなタンパク質は、インスリンのC-ペプチドに正常に挿入され、プロインスリン-GFPからインスリンおよびGFP-C-ペプチド3、4への予想される翻訳後処理を示した。このプロトコルのアッセイでは、GLucは哺乳類発現に対してコドン最適化されており、2つの変異が輝きのような運動学5、6を増強するために導入されている。治療条件の複数の組み合わせおよび複製は96ウェルプレート形式で容易にテストすることができ、分泌結果は実験の直後に得ることができる。

前述の2として、主な利点は、このルシフェラーゼベースの分泌測定(< $0.01/ウェル)の低コストであり、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の比較的高いコストと技術的側面と区別します(> $2/well) および均質な時間分解蛍光 (HTRF) またはその他のフェルスター共鳴エネルギー伝達 (FRET) ベースの抗体 (> $1/well) アッセイ.標準曲線を参照してインスリンの濃度を測定するこれらの抗体ベースのアッセイと比較して、InsGLucアッセイは、プレート上のウェルを制御するための相対的な比較として分泌活性を測定します。そのため、すべての実験には適切なコントロールが必要です。この区別は、迅速かつ安価な測定を可能にするトレードオフです。しかしながら、InsGLuc分泌は、ELISA1,2によって測定されたインスリン分泌と高度に相関することが実証されている。この技術は、ハイスループットスクリーニング1、2、7のためにスケールアップされ、電圧ゲートカリウムチャネル阻害剤7を含むインスリン分泌の新規モジュレーターの同定につながっています7β細胞機能の天然物阻害剤と同様に、染色体A28.InsGLuc の使用は、インスリン分泌への影響について多くの異なる治療条件を継続的にテストする予定の研究者に最も適しています。フォローアップ実験では、親のβ細胞株で重要な知見を繰り返し、マウスやヒトの島で最適に、抗体ベースのアッセイを用いてインスリン分泌を測定する必要があります。

プロトコル

1. 試薬、媒体及びバッファーの調製(表1)

  1. 高グルコース(4.5g/L)ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の500mLでMIN6完全培地を調製:15%胎児ウシ血清(FBS)、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、29μg/mMβ-メルカプトエタノール。
    注:この場合の安定した細胞株は、G418抗生物質の250 μg/mLで維持される。
  2. 5mM KCl、120mM NaCl、15mM HEPES(pH 7.4)、24mM NaHCO 3、1mM MgCl2、2mM CaCl 2、および1mg/mL放射性免疫アッセイ級ウシ血清(BSA)を含む溶液を作製することにより、クレブスリンガー重炭酸塩バッファー(KRBH)を調製する。ブドウ糖は、2Mストックから指定されたところに添加される。
    注:KRBHは、インスリンおよび/またはガウシアルシフェラーゼ分泌を評価するために刺激の有無にかかわらず細胞をインキュベートするために使用されます。
  3. コエレンテラジン(CTZ)ストック溶液を以下のように調記する。濃縮HClの106μLをメタノールの10mLに添加して酸性化メタノールを調出す。次に、1mg/mLで酸性メタノールに凍結乾燥CTZを溶解し、スクリューキャップチューブに-80°Cで保存します。
    注:これらの株式は、適切な貯蔵の1年後であっても、ルーチンルシフェラーゼアッセイで十分な活性を保持します。
  4. 文献9に基づくガウシアルシフェラーゼ(GLuc)アッセイバッファーと特許情報10を調製し、96ウェルプレート形式でガウシアルシフェラーゼアッセイの半減期を支援する。式を使用する: 25 mM トリス pH 8, 1 mM EDTA, 5% グリセロール, 1 mg/mL Na2PO4,300 mM アスコルベート, 200 mM Na2SO3水中.-20 °Cで株式を凍結します。解凍後、バッファを4°Cに保管してください。
  5. ガウジアルシフェラーゼ作動溶液を調付するには、1mg/mL(2.36 mM)CTZストック溶液の4.2 μL/mLをGLucアッセイバッファーに添加します。これはアッセイの5 μMの最終的な集中がある10 μM CTZの2倍の働く解決をもたらす。

2. InsGLuc MIN6細胞の培養と分泌アッセイの播種

  1. MIN6細胞を培養するには、標準的な細胞培養技術を用いて、細胞を週に1回試用し、種をまく。2 ~3 日ごとにセル上のメディアを変更します。G418の250 μg/mLなどの適切な選択抗生物質をメディアに含めます。
    1. 実験のために毎週十分な数の細胞を提供するために、T75フラスコの細胞を維持する。培養の10 mLでT75当たり6 x 106細胞を播種すると、通常、培養7日後にT75当たりの合計30 x 10 6~40 x 106細胞が得られます。
  2. 96ウェルプレートにめっき用の細胞を調製するには、InsGLuc MIN6細胞のコンフルエントT75をPBSで2回洗浄し、2mLのトリプシンを添加する。37°Cで~5分間、または細胞がフラスコから解離するまでインキュベートします。ミリリットル当たりの細胞濃度を決定します。
    1. 完全な培地中の細胞を1 x 106セル/mLに希釈し、96ウェルプレートでウェル当たり100 μLで1x105細胞を得ます。細胞は、3-4日後のアッセイに対して十分に結合している必要があります。
      注:培養期間を延長するために、細胞濃度の半分をめっきすることができる。細胞が実験的治療を受ける場合を除き、アッセイの日までにメディアの変更は必要ありません。

3. グルコース刺激ガウシアルシフェラーゼ分泌アッセイ

  1. アッセイの日に実験に十分なKRBHを準備する(ステップ1.2)。96ウェルプレート当たり50mL以上のKRBHが必要となるため、実験に十分なバッファを確保するために少なくとも75 mLを準備してください。薬物治療条件の異なる組み合わせが希釈のためにKRBHを必要とする場合は、余分なバッファを準備します。
  2. グルコースフリーKRBHで貯水池を準備します。実験室の流しの上にプレートを素早く反転させ、余分な媒体を取り除くためにペーパータオルの積み重ねにしっかりと拭くことによって、96ウェルプレートから媒体をデカントします。
  3. 電子または手動の8チャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートを横切る貯水池からピペット100 μL /ウェルKRBH。合計 2 回の洗い流しを繰り返します。
  4. (急性化合物治療の任意ステップ)薬物治療を行わない場合は、変更せずに手順3.5および3.6に進みます。インスリン分泌に対する小分子の影響をテストするために、化合物は、前インキュベーション期間中、刺激期間、またはその両方の間に細胞に添加することができる。
    1. 1つの技術は、1.5 mLチューブでKRBHにバッチで化合物を追加し、調整可能な8チャンネルデジタルピペットを使用して、96ウェルプレートのチューブから細胞に薬物-KRBHを転送することです。
      注:調整可能なピペットが利用できない場合は、薬物KRBHのレプリカ96ウェルプレートを作ることができ、標準的な8チャンネルピペットを使用してバッファを転送することができます。治療パラダイムへのさらなる改変は、アッセイ前の培養物中の24時間の細胞を治療するために行うことができ、前述の1、8。
  5. グルコースまたは化合物の所望の濃度を含むKRBHの100 μLを追加し、1時間37°Cインキュベーターに皿を置きます。
    注:実験レイアウトに応じて、8つの1.5mLチューブの列から96ウェルプレートの8列にチャンネル距離を遷移できる電子マルチチャンネルピペットを持つことは非常に便利です。
  6. プリインキュベーションの1時間後、バッファーをシンクにデカントし、ペーパータオルにしっかりとブロットします。ガウシア・ルシフェラーゼの蓄積された背景を洗い流すために、ウェルあたり100 μLのグルコースフリーKRBHをウェルあたり追加します。プレートを再度デカントし、ウェルあたり100 μLでプレートに制御および刺激条件を追加します。37°Cのインキュベーターに1時間置きます。
  7. マルチチャンネルピペットを使用して50μLの上清を慎重に収集し、必要に応じて治療条件間でチップを変更し、上清をきれいな不透明な白い96ウェルアッセイプレートに移します。
    注:白壁のクリアボトムプレートは、必要に応じて使用できますが、かなりの量のルシフェラーゼ信号が失われます。
  8. KRBH上清の50μLの収集後、試料を直ちにアッセイすることができる。必要に応じて、サンプルを数日間4°C(GLuc活性半減期〜6日間)または-20°Cで1ヶ月11、12までシールして保存する。

4. 分泌ガウシアルシフェラーゼアッセイ

  1. GLucアッセイ作動液を調付けるには、必要量のCTZストック溶液(4.2 μL/mL)をGLucアッセイバッファにピペットします。CTZの温暖化を防ぐには、-80°Cの冷凍庫でCTZを素早くピペットするか、チューブをドライアイスに保管してください。
  2. 電子マルチチャンネルピペットを使用して、収集されたKRBH上清を含む96ウェル皿全体で、GLucアッセイ作動液の50 μLをウェルあたり迅速に追加します。井戸の側面に液滴がある場合は、テーブルトップのスイングバケツ遠心分離機でプレートを簡単に回転させます。
  3. 数分以内に適切なプレートリーダーで発光を読み、0.1 sの積分時間で各ウェルを読みます。

結果

制御条件下でのアッセイの性能を測定するために、単純なグルコース用量応答曲線またはジアゾキシドパラダイムを用いる刺激を完了することができる。前者の場合、グルコースフリー条件で1時間の細胞を事前にインキュベートし、その後、グルコース濃度を増加させた状態で1時間の治療を行う場合、5mM以下での分泌活性はごくわずかで、分泌の増加は8以上に観察?...

ディスカッション

本明細損では、MIN6β細胞からのグルコース刺激インスリン分泌応答を迅速に評価する方法を提示する。アッセイで最良の応答を得るためには、MIN6細胞を適切な密度で播種し、それらが85-95%のコンフルエントになることを可能にすることが重要です。これは、一次島17、18、19、20、21およびMIN6の両方で起

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者は、貴重な仕事と議論のためにコブ研究所のすべての現在および元メンバーに感謝し、行政支援のためのディオンヌウェア。マイケル・カルワットは、若年性糖尿病研究財団SRA-2019-702-Q-Rによってサポートされています。この作業は、NIH R37 DK34128とウェルチ財団グラントI1243を通じてメラニー・コブに可能になりました。この作業の初期の部分は、マイケル・カルワットにNIH F32 DK100113によってもサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cellsParental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEMSigmaD64294.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivatedSigmaF4135
Penicillin/StreptomycinThermo-Fisher ScientificSV30010
beta-mercaptoethanolThermo-Fisher ScientificBP 176-100
glutamineThermo-Fisher ScientificBP379-100
Trypsin-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasksFisher Scientific07-202-000
96 well tissue culture platesCelltreat229196
Reagent reservoirs (50 mL)Corning4870
NameCompanyCatalog NumberComments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompanyCatalog NumberComments
Optional drugs for stimulation experiments
DiazoxideSigmaD9035Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)SigmaE4375Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)SigmaP1585Stock solution: 100 µM in DMSO
NameCompanyCatalog NumberComments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
GlycerolThermo-Fisher ScientificG334
Sodium BromideThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris baseRPIT60040-1000.0Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic AcidFisher ScientificAAA1775922US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3SigmaS0505-250GUS Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)Nanolight / Prolume3035MGStock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well MicroplatePerkin Elmer6005290Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalentBioTek8041000A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)Integra4724An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipetteTransferpette S 20-200 µL2703710

参考文献

  1. Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
  2. Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
  3. Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
  4. Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
  5. Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
  6. Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
  7. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , (2018).
  8. Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
  9. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
  10. Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , (2010).
  11. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
  12. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  13. Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
  14. Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
  15. Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
  16. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
  17. Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
  18. Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
  19. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
  20. Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
  21. Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
  22. Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
  23. Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  24. Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
  25. Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
  26. Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
  27. Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved