מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

Abstract

ביצוע נוגדנים מבוססי נוגדן עבור אוסף המופרש לאחר הדגימה לאחר מכן דורש בדרך כלל כמה שעות עד יום של זמן הצורך והוא יכול להיות יקר, בהתאם לצורך הספציפי. לוציפראז מופרש מזרז את התוצאות ולהקטין את עלות הכדאיות לכל מדגם באופן משמעותי. כאן אנו מציגים גישה בשימוש מועט יחסית כדי לאמוד פעילות הפרשה אינסולין מתאי β הלבלב באמצעות Gaussia לוציפראז מוכנס גנטית בתוך C-פפטיד. במהלך העיבוד האנטי-נגד-חרדה של הפרואינסולין, הג-פפטיד משחרר את הלוציפראז בתוך הפרשת האינסולין ושלפוחית האנרגיה שבה הוא מופרש עם אינסולין. תוצאות ניתן לקבל בתוך דקות לאחר איסוף המדגם בגלל המהירות של לוציפראאז assays. הגבלה של התשובה היא שזהו מדידה יחסית של הפרשת אינסולין ולא כימות מוחלטת. עם זאת, פרוטוקול זה הוא חסכוני, מדרגי, וניתן לבצע באמצעות מרבית קוראי לוחיות האור הרגילות. פיפטות אנלוגי ודיגיטלי רב ערוצי להקל על מספר שלבים של השיטת. ניתן לבדוק במקביל וריאציות נסיוניות רבות. לאחר מערכת ממוקדת של תנאים הם החליטו על, ריכוזי אינסולין צריך להיות נמדד ישירות באמצעות נוגדן מבוסס בחני עם עקומות סטנדרטיות כדי לאשר את תוצאות שיטת ללוציפראז.

Introduction

השיטה המוצגת כאן מאפשרת הפרשת אינסולין מקו בטא שונה גנטית להיות מוכן במהירות ובאופן בלתי נשכח בפורמט 96-היטב-צלחת. המפתח לפרוטוקול זה הוא גרסה משתנה של אינסולין עם הגאוסיה המופרש באופן טבעי (gluc, ~ 18 kda) הוכנס ( ראה איור 1) לתוך ה-C פפטיד כדי ליצור אינסולין-גאוסייה (insgluc)^1,2. חלבונים גדולים אחרים, כגון gfp (~ 25 kda), הוכנסו בהצלחה לתוך C-פפטיד של אינסולין והציגו את העיבוד לאחר הניתוח הצפוי מתוך proinsulin-gfp לאינסולין ו gfp-C-פפטיד^3,4. עבור הצורך בפרוטוקול זה, gluc כבר ממוטב codon עבור ביטוי היונקים ושני מוטציות הוצגו כדי לשפר זוהר כמו הקינטיקה^5,6. ניתן לבדוק בקלות צירופים מרובים ושכפול של תנאי טיפול בתבנית 96-היטב, וניתן לקבל את תוצאות ההפרשה מיד לאחר הניסוי.

יתרון מרכזי, כפי שצוין בעבר², הוא העלות הנמוכה של מדידה זו הפרשה מבוסס לluciferase (< $0.01/טוב) אשר מבדיל אותו מן העלויות הגבוהות יחסית והיבטים טכניים של חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) ( > $2/ובכן) ו-פלואורסצנטית הומוגנית בזמן (HTRF) או אחרים Förster העברת אנרגיה (מבוסס) נוגדן (> $1/ובכן) assays. בהשוואה לאלה המבוססים על נוגדנים, אשר למדוד את הריכוז של האינסולין על ידי התייחסות עיקול סטנדרטי, שיטת InsGLuc מודד פעילות הפרשה כהשוואה יחסית לשלוט בארות על הצלחת. מסיבה זו, כל ניסוי דורש הכללה של שליטה נאותה. הבחנה זו היא עסקת חליפין כדי לאפשר מדידות מהירות וזולה. עם זאת, הפרשת insgluc הוכח להיות מתואם מאוד עם הפרשת אינסולין כפי שנמדד על ידי אליסה^1,2. טכנולוגיה זו הפכה להיות מדורגים עבור הקרנת תפוקה גבוהה^1,2,7 והובילה לזיהוי של מודולים הרומן של הפרשת אינסולין כולל מעכבי מגודרת מתח תעלת אשלגן⁷ כמו גם מעכב מוצר טבעי של β cell פונקציה, Chromomycin a₂⁸. השימוש ב-InsGLuc הוא המתאים ביותר עבור חוקרים המתכננים לבחון ללא הרף תנאי טיפול שונים להשפעה שלהם על הפרשת אינסולין. בניסויים מעקב יש צורך לחזור על ממצאים מרכזיים בתוך קו β הורים, ובצורה אופטימלית באיים מוריים או בני אדם, ולמדוד הפרשת אינסולין באמצעות שיטת נוגדן מבוססת.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים, מדיה ומאגרים (שולחן 1)

1. הכנת MIN6 מדיה מלאה ב 500 mL של גלוקוז גבוה (4.5 g/L) בינונית שונה של הנשר של Dulbecco (Dמאמ) עם התוספים הבאים: 15% סרום של העובר (FBS), 100 יחידות/מml 100, מסטרפטומיצין μg/mL, 292 μg/מ"ל L-גלוטמין, ו 50 μM . β-מרקפטואתנול
   הערה: קו התאים היציבים במקרה זה מתוחזק ב250 μg/mL של אנטיביוטיקה G418.
2. הכינו את ביקרבונט מאגר Krebs-צלצול (KRBH) על-ידי ביצוע פתרון המכיל 5 מ"מ KCl, 120 מ"מ הייגל, 15 מ"מ HEPES (pH 7.4), 24 mM נחקו₃, 1 מ"מ MgCl₂, 2 מ"מ cacl₂, ו 1 מ"ג/mL-מבצע רדיוחיסוני כיתה בכיתה סרום אלבומין. גלוקוז יש להוסיף היכן שצוין מ 2 מניות M.
   הערה: KRBH משמש לדגירה את התאים עם וללא גירוי כדי להעריך אינסולין ו/או הפרשה של גאוסייה לוציפראז.
3. הכינו את התמיסה של קומרכאזין (CTZ) כדלקמן. הכן acidified מתנול על-ידי הוספת 106 μL של HCl מרוכזת ל-10 mL של מתנול. לאחר מכן, התמוססות CTZ ב-acidified מתנול ב 1 מ"ג/mL ולאחסן ב-80 ° c ב-בורג צינורות כובע.
   הערה: מניות אלה לשמור על פעילות מספקת לוציפראז שגרתי, גם לאחר 1 שנה של אחסון נאות.
4. הכינו את גאוסיה לוציפראז (GLuc) מאגר הנתונים המבוסס על ספרות⁹ , כמו גם פטנט מידע¹⁰ כדי לסייע במחצית החיים של שיטת Gauferase של גאוסייה ב 96 בפורמט צלחת לוחית. השתמש בנוסחה: 25 מ"מ מסנן טריס pH 8, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1 מ"ג/mL Na₂פו₄, 300 מ ל נתרן Ascorbate, 200 mm na₂כל כך₃ במים. הקפאת מניות ב-20 ° c. לאחר הפשרה, לאחסן את המאגר ב 4 ° c.
5. כדי להכין את הפתרון העבודה של Gauferase, להוסיף 4.2 μL/mL של 1 מ"ג/mL (2.36 מ"מ) מניות CTZ פתרון מאגר שיטת GLuc. זה התוצאות בפתרון עבודה 2x של 10 μM CTZ אשר יהיה הריכוז הסופי של 5 μM בבחינה.

2. תרבות של InsGLuc MIN6 תאים וזריעה לפרשת הפרשה

1. לתרבות MIN6 תאים, טריזיסיזציה וזרע התאים פעם בשבוע באמצעות טכניקות רגילות של תרבות התא. שינוי מדיה בתאים כל 2-3 ימים. כלול אנטיביוטי בחירה מתאים, כגון 250 μg/mL של G418 במדיה.
   1. כדי לספק מספר מספיק של תאים שבועי לניסויים, לשמור על התאים ב T75 צלוחיות. זריעת 6 x 10⁶ תאים לכל T75 ב 10 מ ל של המדיה תניב בדרך כלל 30 x 10⁶ כדי 40 x 10⁶ תאים סך לכל T75 לאחר 7 ימים של תרבות.
2. כדי להכין תאים לציפוי לתוך 96-טוב צלחות, לשטוף confluent T75 של InsGLuc MIN6 תאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ ל טריפסין. מודקון ב 37 ° צ' עבור ~ 5 דקות או עד התאים הנתק מן הבקבוקון. קבע את ריכוז התא למילי-ליטר.
   1. לדלל את התאים במדיה המלאה 1 x 10⁶ תאים/mL כדי לגרום 1 x 10⁵ תאים ב 100 μl לכל טוב ב-96-באר צלחת. התאים צריכים להיות מאוד מספקת לצורך שיטת החיבור לאחר 3 – 4 ימים.
      הערה: כדי להאריך את תקופת התרבות, ניתן לציפוי מחצית מריכוז התא. שינויי מדיה אינם נדרשים לפני יום הטיפול, אלא אם כן התאים חשופים לטיפולים ניסיוניים.

3. גלוקוז-גירוי הפרשת גאוסיה לוציפראז

1. ביום המנה מכינים מספיק KRBH לניסוי (שלב 1.2). מינימום של 50 mL של KRBH per 96-ובכן הצלחת נדרש, ולכן להכין לפחות 75 mL כדי להבטיח מספיק מאגר עבור הניסוי. הכינו מאגר נוסף, אם צירופים שונים של תנאי טיפול בסמים ידרשו KRBH לדילול.
2. הכינו מאגר מים ללא גלוקוז. Decant המדיום מ 96-ובכן צלחת (s) על ידי היפוך במהירות את הצלחת מעל כיור מעבדה ולאחר מכן למחוק בחוזקה על ערימת מגבות נייר כדי להסיר עודף בינוני.
3. באמצעות צינורות אלקטרוניים או ידני של 8 ערוצים, פיפטה 100 μL/ובכן KRBH מן המאגר על פני הצלחת 96-באר (s). חזור על הסכום הכולל של שתי שטיפות.
4. (צעד אופציונלי של טיפולים בתרכובת חריפה) אם לא ביצוע טיפולים בסמים, המשך בשלבים 3.5 ו-3.6 ללא שינוי. כדי לבחון את ההשפעות של מולקולות קטנות על הפרשת אינסולין, ניתן להוסיף תרכובות לתאים במהלך תקופת הדגירה המוקדמת, תקופת הגירוי, או שניהם.
   1. טכניקה אחת היא להוסיף תרכובות אצווה כדי KRBH ב 1.5 mL ולהשתמש בצינורות הניתנים להתאמה דיגיטלית 8 ערוצים כדי להעביר את התרופה-KRBH מן הצינורות לתאים ב 96-באר צלחות.
      הערה: אם הצינור הניתן לכוונון אינו זמין, עותק משוכפל 96-ובכן צלחת של סמים-KRBH ניתן לעשות ומתקן שמונה ערוצים סטנדרטי ניתן להשתמש כדי להעביר את המאגר. שינויים נוספים בפרדיגמת הטיפול ניתן לטפל בתאים במשך 24 שעות במדיה לפני התיתינה, כפי שמתואר בעבר^1,8.
5. הוסף 100 μL של KRBH המכיל את הריכוז הרצוי של גלוקוז או תרכובות ומניחים את המנה בחממה 37 ° c עבור 1 h.
   הערה: בהתאם לפריסה הניסיונית, היא מועילה מאוד לקבל מעבר של צינור רב ערוצי אלקטרוני המאפשר מעבר מיגדרי של הערוץ מטור של שמונה 1.5-mL לשמונה שורות של צלחת 96-באר.
6. לאחר השעה 1 של הדגירה המוקדמת, לחזק את המאגר לתוך הכיור ולמחוק בחוזקה על מגבת נייר. הוסף 100 μL של גלוקוז חינם KRBH לכל טוב לשטוף את הרקע שנצבר של הלופראז גאוסייה. Decant הצלחת שוב ולהוסיף שליטה ומגירוי תנאים לצלחת ב 100 μL לכל טוב. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 ° c עבור 1 h.
7. לאסוף בקפידה 50 μL של supernatant באמצעות מצפטה רב-ערוצי, שינוי טיפים בין תנאי טיפול לפי הצורך, ולהעביר את supernatant לנקות אטום לבן אטומה ל96 בנת היטב.
   הערה: לוחיות השפל של הקירות הלבנים ברורים ניתן להשתמש אם יש צורך, למרות כמות משמעותית של אות לוציפראז יאבדו.
8. לאחר איסוף של 50 μL של KRBH supernatant, המדגם יכול להיות מיידי. במקרה הצורך, לחתום ולאחסן דגימות ב -4 ° c לכמה ימים (פעילות gluc מחצית חיים ~ 6 ימים) או-20 ° c עד חודש אחד^11,12.

4. הסדר הלוציסייה המופרש

1. כדי להכין את הפתרון העובד העבודה GLuc, פיפטה את הכמות הנדרשת של פתרון מלאי CTZ (4.2 μL/mL) לתוך מאגר שיטת GLuc. כדי למנוע התחממות CTZ, הצינורות במהירות ב-80 ° c מקפיא או לשמור את הצינור על קרח יבש.
2. באמצעות הצנרת האלקטרונית רב-ערוצי, להוסיף במהירות 50 μL של הפתרון העבודה GLuc לעבוד גם על פני הצלחת 96-באר המכילה את KRBH supernatants שנאספו. אם יש טיפות על הצדדים של בארות כלשהן, לקצר לסובב את הצלחת בצנטריפוגה הנדנדה השולחן הראש התנופה.
3. קרא את האור בקורא צלחת מתאים בתוך כמה דקות ולקרוא כל טוב עם זמן אינטגרציה 0.1 s.

תוצאות

כדי למדוד את הביצועים של הקבוע תחת תנאי בקרה, מינון פשוט של התגובה הגלוקוז במינון או גירוי באמצעות הפרדיגמה diazoxide ניתן להשלים. במקרה של לשעבר, מראש לקדם את התאים עבור 1 h בתנאים ללא גלוקוז ואחריו טיפול עבור 1 h עם ריכוזי גלוקוז הגוברת צריך לגרום לפעילות הפרשה מעט מאוד ב-5 מ"מ, ?...

Discussion

כאן אנו מציגים שיטה להעריך במהירות גלוקוז מגורה הפרשות אינסולין תגובות מתאי MIN6 β. לקבלת התגובות הטובות ביותר בסדר זה חשוב לזרוע את התאים MIN6 בצפיפות הנכונה ולאפשר להם להפוך 85-95% confluent. זה משפר את התגובות β cell לגלוקוז בגלל שיפור תא הקשר וסינכרון התאים, אשר מתרחשת הן באיים הראשיים¹⁷

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710