研究左心室反向改造由主动脉脱体在啮齿动物

摘要

在这里，我们描述了在成熟的主动脉收缩模型中手术主动脉脱体的分步协议。这个过程不仅允许研究左心室反向改造和肥大回归背后的机制，而且还可以测试可能加速心肌恢复的新疗法方案。

摘要

为了更好地了解左心室 （LV） 反向改造 （RR），我们描述了一个啮齿动物模型，其中，在主动脉带引起的 LV 改造后，小鼠在切除主动脉收缩后接受 RR。在本文中，我们描述了一个分步手术，在小鼠中执行微创手术主动脉去除。回声心动图随后用于评估LV改造和RR期间心脏肥大和功能障碍的程度，并确定主动脉脱体的最佳时机。在协议结束时，对心脏功能进行了末期血液动力学评估，并收集了样本进行组学研究。我们表明，去除与手术存活率70-80%有关。此外，在解散两周后，心室后负荷的显著减少会触发心室肥大的回归（+20%）和纤维化（+26%），通过左心室填充和末期舒张压力（E/e'和LVEDP）的正常化评估舒张功能障碍的恢复。主动脉去除是研究啮齿动物LV RR的有用实验模型。因此，心肌恢复的范围在受试者之间是可变的，这模仿了临床环境中发生的RR的多样性，如主动脉瓣置换。我们的结论是，主动脉带状/脱体模型是解开对RR机制的新见解的宝贵工具，即心脏肥大的回归和舒张功能障碍的恢复。

引言

小鼠横向或上升主动脉的收缩是压力过载引起的心脏肥大、舒张和收缩功能障碍以及心力衰竭^{1、2、3、4}的广泛应用的实验模型。主动脉收缩最初导致补偿左心室（LV）同心肥大，使壁应力^{正常化1。}然而，在某些情况下，如长时间心脏超负荷，这种肥大不足以减少壁应力，触发舒张和收缩功能障碍（病理肥大^）5。同时，细胞外基质 （ECM） 的变化导致胶原蛋白沉积和交叉链接的过程称为纤维化，可以细分为替代纤维化和反应性纤维化。纤维化是，在大多数情况下，不可逆转和妥协心肌恢复后超载救济^6，7。然而，最近的心脏磁共振成像研究表明，反应性纤维化能够长期倒退^。总之，纤维化、肥大和心脏功能障碍是心肌重塑过程的一部分，这个过程会迅速走向心力衰竭（HF）。

了解心肌重塑的特点已成为限制或扭转其进展的主要目标，后者称为反向改造 （RR）。RR 一词包括任何由给定干预长期逆转的心肌改变，如药理疗法（如抗高血压药物）、瓣膜手术（如主动脉狭窄）或心室辅助设备（如慢性 HF）。然而，由于普遍存在的肥大或收缩/舒张功能障碍，RR通常不完整。因此，RR 基本机制和新颖的治疗策略的澄清仍然缺失，这主要是因为大多数患者在 RR 期间无法访问和研究人类心肌组织。

为了克服这一限制，啮齿动物模型在促进我们对高频进展中涉及的信号通路的理解方面发挥了重要作用。具体来说，主动脉收缩小鼠的主动脉去除是研究不利LV改造9和RR^10，11背后的分子机制的有用模型，因为它允许在这两个阶段的不同时间点收集心肌样本。此外，它提供了一个优秀的实验设置，以测试潜在的新目标，可以促进/加速RR。例如，在主动脉狭窄的背景下，该模型可能提供有关 RR^6、12完整性基础下心肌反应的巨大多样性所涉及的分子机制的信息，以及瓣膜更换的最佳时机，这是当前知识的一个主要缺陷。事实上，这种干预的最佳时机是一个争论的话题，主要是因为它是根据主动脉梯度大小来定义的。一些研究主张，这个时间点可能为时已晚，心肌恢复，因为纤维化和舒张功能障碍往往已经存在^12。

据我们所知，这是唯一的动物模型，回顾心肌改造和RR的过程分别发生在主动脉狭窄或高血压等条件下的阀门更换或抗高血压药物的开始。

为了应对上述挑战，我们描述了一种可在小鼠和大鼠身上实施的手术动物模型，解决了这两个物种之间的差异。我们描述了进行这些手术时涉及的主要步骤和细节。最后，我们报告LV在RR之前和整个RR中发生的最重大变化。

研究方案

所有动物实验均符合《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，2011年修订）和葡萄牙动物福利法（DL 129/92，DL 197/96;P 1131/97）。地方当局主管部门批准了这项实验议定书（018833）。七周大的雄性C57B1/J6小鼠被关在适当的笼子里，有规律的12/12 h光暗循环环境，温度为22°C，湿度为60%，可获得水和标准饮食。

1. 手术场的准备

1. 用70%的酒精对手术部位进行消毒，并在手术区放置一次性手术室表盖。
2. 手术前对所有仪器进行消毒。
   注意:此程序需要微型手术剪刀、2 个精细弯曲钳、3 个细直钳、手术刀、小钳子、角断开剪刀、针架、超细结扎辅助器、2 个止血剂，最后强烈推荐磁固定器缩放系统（图 1A）。
3. 将 26 G 钝针的尖端弯曲至 90° 以更轻松地接近主动脉。26 G 针将产生直径为 0.45 毫米的主动脉变窄（图 1B）。
4. 将加热垫温度调整为 37 ± 0.1 °C。

2. 小鼠制备和受管

1. 麻醉年轻的C57B1/J6小鼠（20-25克），吸入8%的回氟兰，在锥管中吸入0.5 - 1.0 L/min 100%O_2。
2. 使用脚趾捏取回反射检查麻醉深度。
3. 将鼠标放在倾斜板上的后部再任职，然后进行骨膜内分。
4. 将鼠标移动到加热垫，并快速将骨管连接到呼吸机，启动机械通风。
5. 将呼吸机参数调整为 160 次呼吸/分钟频率和 10 mL/kg 的潮汐体积。

3. 手术准备（用于带状手术和脱发手术）

1. 剃须，并应用从领口到小鼠中胸水平的脱毛霜。
2. 将眼科凝胶涂抹在动物的眼睛上，以防止角膜干燥。
3. 将直肠探头和牛米分别放在爪子或尾巴上，以监测温度、血液氧化和心率。
   注意:麻醉诱发严重的体温过低，因此，在手术期间保持正常的体温很重要，以避免心率迅速下降。
4. 用呼吸氟氨蝶（2.0 - 3.0%）保持麻醉。检查麻醉的正确水平缺乏脚趾捏反射。
5. 将小鼠放在加热垫上的右侧十进制，用胶带固定四肢到磁固定器缩回系统，使动物在手术期间处于正确的位置（图2，图3A）。
6. 用70%的酒精消毒老鼠的胸部，然后是普罗维酮碘溶液。

4. 提升主动脉带状手术

注:有关详细的协议说明，请咨询 2、3、4、13。

1. 使用一次性刀片，在轴侧水平下方的左侧进行小切口（约 0.5 厘米），并解剖皮肤。
2. 轻轻地解剖和分离胸肌和其他肌肉层，直到肋骨变得可见。使用细钳，避免割伤肌肉。
3. 在显微镜下，识别间分体空间，并在第^{2 和第3}个间空间之间用细钳打开一个小切口。
4. 通过放置胸部缩回器（图2A）来缩回肋骨。
5. 使用小钳子轻轻地解剖和分离胸腺，直到上升的主动脉变得可见。
   注意:棉花施用器在出血时应方便。在发生严重出血（如乳腺动脉）时，应给予热无菌盐水皮下。
6. 使用小钳子轻轻解剖主动脉。
   注:当周围没有脂肪或其他粘附物时，Aorta 被认为是被解剖的，并且很容易用小曲线钳包围容器。
7. 主动脉解剖后，使用结节辅助和弯曲钳（图2B）在主动脉周围放置7-0聚丙烯连结。
8. 将钝的 26 G 针平行于主动脉（尖指向小鼠头部）（图 2B）。对于体重20-25克的小鼠，这种针引致可重复的65-70%主动脉收缩。
9. 在2个钳子（图2B）的帮助下，在主动脉和26G针周围打2个松散的结。
10. 拧紧第 1^节 ，之后很快收紧第² 节。简要确认收缩的正确位置，并快速取出针头以恢复主动脉血流。最后，制作^第3节 （BA组）。
11. 将胸腺和肌肉重新定位到初始位置。
12. 执行与收缩程序相同的虚假程序，但保持主动脉周围的缝合松动（SHAM 组）。
13. 切割缝合线的末端并取出胸部缩刀。
    注意:短缝合结束可能会增加结与主动脉压力松动的概率，而长端使脱体程序风险更大，因为缝合线和左中庭之间可能发生粘连。
14. 使用 6-0 聚丙烯缝合线关闭胸壁，使用尽可能少的缝合次数进行简单的中断或连续缝合。紧固最后一个胸结与肺膨胀结束灵感捏掉呼吸机的外流2s重新充气肺。
15. 以连续缝合模式以 6-0 丝/聚丙烯缝合皮肤。
    注:如果使用较新的呼吸机，可以编程以暂停灵感（设置高级暂停灵感）

5. 术后护理

1. 将普罗维酮碘溶液应用于皮肤缝合部位。
2. 对于适当的镇痛，每天两次以皮下0.1毫克/公斤的皮下管理丁丙诺啡，直到动物完全康复（通常在手术后2-3天）。
3. 在手术过程中大量出血时，在肾内注射无菌盐水，以防止脱水。
4. 关闭麻醉（无需去孵化小鼠），等到动物恢复反射（胡须运动是一个觉醒信号），并开始自发呼吸。
5. 取出气管。
6. 让动物在37°C的孵化器中恢复。
7. 完全恢复后，将动物返回到 12 小时的光/暗循环室。

6. 主动脉脱体手术

1. 七周后，在一半的BA动物中执行主动脉的去除，并从一半的SHAM小鼠身上取出松散的缝合线，分别产生2个新的组——解散（DEB）和解散SHAMA（DESHAM）。德沙姆代表 DEB 组的控制 （图 4）。
2. 重复上述所有步骤 2.1 到 3.6。
3. 轻轻地解剖主动脉周围的组织、粘附和纤维化，直到其收缩变得可见。
4. 仔细解剖主动脉，将缝合线与主动脉分离。用倾斜的单探弹簧剪刀切开缝合线（图3B）。
5. 使用 6-0 聚丙烯缝合线关闭胸壁，使用可能的最小针线的简单中断或连续缝合。
   注意:当肺部充气时，尽量收紧最后一条胸缝，以避免肺气管破裂。
6. 以连续缝合模式以 6-0 丝/聚丙烯缝合皮肤。
7. 执行 5 中提到的所有术后护理程序。
8. 两周后牺牲动物

7. 回声心动图，以评估心脏功能和左心室萎缩在体内

1. 每2-3周进行一次超声心动检查，以跟踪肥大和心脏功能的进展。
2. 麻醉动物，如前所述，通过吸入5%的鼻锥体。将麻醉水平降低到2.5%，调整麻醉水平。
3. 剃须，并应用脱毛霜从领口到胸部中等水平。
4. 将动物放在加热垫上，并将心电图电极放置。确保良好的心电图跟踪，并保持心率在 300 至 350 节拍/分钟之间。
5. 监测温度（+37°C）。
6. 应用回声凝胶，将动物放置在左侧十进制。
7. 启动超声心动图并调整设置。
8. 将超声波探头放置在胸腔上。
9. 分别在带状手术和脱发手术后 7 周和 2 周内评估整个带状的压力梯度。将探针定位在 LV 长轴上，并将光束置于主动脉上。按下按钮 PW 激活脉冲波多普勒回声心动图。经过七周的绑带，主动脉梯度将在带状动物中>25 mmHg。
10. 记录主动脉的二维引导图像，显示上升主动脉收缩的存在或缺失，以解剖学上可视化带状和去除功能的功效。
    注意:如果有颜色模式，则可以在收缩级别可视化湍流。
11. 通过将探针定位在 LV 短轴、状肌肉水平，并按 M 模式跟踪来可视化 LV 前壁（ LVAW ）、 LV 直径（ LVD ）和 LV 后壁（ LVPW ），在硅胶（ D ）和收缩（ S ）（图 5 ）中。
12. 评估收缩功能，计算弹射分数和分数缩短，如先前描述的^14，15。
13. 评估舒张功能1）确定脉冲波多普勒的早期和后期米斯特拉流速度（E和A波，分别）使用在线粒体传单上方的apical 4室的apical视图:2） 使用脉冲-TDI和 apical 4 室 apical 视图 （图 5）记录横向线环心肌早期舒张 （E'） 和峰值收缩 （S） 速度。
14. 记录每个参数评估至少连续三次心跳。这些值随后将进行平均值。

8. 血力学评估

1. 在协议的末尾（图4），执行最后的回声心动图，如7，在终端血动力学评估之前。
2. 重复步骤 2.1 到 3.6。
3. 以 64 mL/kg/h 的速度调节右壶静脉和无菌盐水。
4. 将动物稍微旋转到左侧，并在西菲德附录的水平上做皮肤切口。
5. 用钳子或剪刀将皮肤与肌肉分开。
6. 在西菲德附录级别的左肋之间做一个横向切口。
7. 执行左侧胸腔切除术，以充分暴露心脏。
   注意:为了避免出血和肺损伤，将棉签插入胸腔，轻轻推肺，同时在切口的左右两侧插入两个止血剂。
8. 在37°C的水浴中预热P-V循环导管。
9. 校准导管（设置、通道设置、选择正确的压力和体积通道、单位）。
10. 将导管插入 LV，确保音量传感器位于主动脉阀和顶点之间。卷可以通过回声心动图（图5）进行评估。压力体积环的可视化有助于确认导管的正确定位（图6）。
11. 允许动物稳定20-30分钟，而不会显著改变压力体积环的形状。
12. 在期末暂停通风后，获取基线记录（图6）。持续获取 1，000 Hz 的数据，然后通过适当的软件离线分析。
13. 计算高音盐水后并行传导（10%，10 μL）。
14. 麻醉时，通过驱魔牺牲动物，收集和离心血。
15. 最后，切除和收集心脏。分别对心脏、左心室和右心室进行权重，并立即将样品储存在液氮或甲醛中，供随后的分子或组织学研究。

9. 大鼠主动脉带/脱体程序

1. 使用 22 G 针和 6-0 聚丙烯连结在年轻的 Wistar （70-90 g） 中执行主动脉带，以收缩主动脉。
2. 确保适当的麻醉和镇痛程序，分别提供3-4%的葡萄干和0.05毫克/千克丁丙诺啡。
3. 在心电图过程中，确保心率始终高于 300 速率 /分钟（理想情况下在 300 到 350 之间）。
4. 在第8.9步之前，轻轻地解剖大鼠主动脉，在它周围放置一个流动探针来测量心脏输出。使用主动脉流探针是大鼠的黄金标准程序。
5. 对于血液调节评价，可以调节流体管理的壶状或股骨静脉（32 mL/kg/h）。
6. 用SPR-847或SPR-838替换压力体积导管SPR-1035，其尺寸更适合大鼠心室尺寸。

结果

术后和后期生存
带状手术的术外存活率为80%，第一个月的死亡率一般为20%<。如前所述，去除手术的成功在很大程度上取决于以前的手术的侵入性。经过学习曲线后，去除程序期间的死亡率约为 25%。对于这个死亡帐户大多是在手术过程中死亡，包括主动脉或左中庭破裂（在老鼠，生存率在两个外科手术更高）。

主动脉带和心肌重塑
主动脉收缩的...

讨论

本文提出的模型分别模拟了主动脉绑带和解散后LV改造和RR的过程。因此，它代表了一个很好的实验模型，以推进我们对与不利LV改造有关的分子机制的知识，并测试新的治疗策略，能够诱导这些患者的心肌恢复。该协议详细说明了如何创建主动脉带和脱体的啮齿动物模型的步骤，使用微创和高度保守的手术技术，以减少手术创伤。

协议最关键的步骤与主动脉带期间的手术攻?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorption Spears	F.S.T	18105-03	To absorb fluids during the surgery
Blades	F.S.T	10011-00	To perform the skin incision
Buprenorphine	Buprelieve		Analgesia drug
Catutery	F.S.T	18010-00	To prevent exsanguination
Catutery tips	F.S.T	18010-01	To prevent exsanguination
cotton swab	Johnson's		To absorb fluids during the surgery
Depilatory cream	Veet		To delipate the animal
Disposable operating room table cover	MEDKINE	DYND4030SB	To cover the surgical area
Echo probe	Siemens	Sequoia 15L8W	Ultrasound signal aquisition
Echocardiograph	Siemens	Acuson Sequoia C512	Ultrasound signal aquisition
End-tidal CO2 monitor	Kent Scientific	CapnoStat	To control expiration gas saturation
Forcep/Tweezers	F.S.T	11255-20	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11272-30	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11151-10	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11152-10	To dissect the tissues and aorta
Gas system	Penlon Sigma Delta		To anesthesia and mechanical ventilation
Hemostats	F.S.T	13010-12	To hold the suture before tight the aorta
Hemostats	F.S.T	13011-12	To hold the suture before tight the aorta
Ligation aids	F.S.T	18062-12	To place a suture around the aorta
Magnetic retractor	F.S.T	18200-20	To help keep the animal in a proper position
Needle holder	F.S.T	12503-15	To suture the animal
Needle 26G	B-BRAUN	4665457	To serve as a molde of aortic constriction diameter
Oxygen	Air Liquide		To anesthesia and mechanical ventilation
Polipropilene suture	Vycril	W8304/W8597	To suture the animal and to do the constriction
Povidone-iodine solution	Betadine®		Skin antiseptic
PowerLab	Millar instruments	ML880 PowerLab 16/30	PV loop Signal Aquisition
Pulse oximeter	Kent Scientific	MouseStat	To control heart rate and blood saturation
PVAN software	Millar Instruments		To analyse the haemodynamic data
PV loop cathether	Millar instruments	SPR-1035. 1.4 F	PV loop Signal Aquisition
Retractor	F.S.T	17000-01	To provide a better overview of the aorta
Scalpet handle	F.S.T	10003-12	To perform the skin incision
Scissors	F.S.T	15070-08	To cut the suture in debanding surgery
Scissors	F.S.T	14084-09	To cut other material during the surgery e.g. suture, papper
Sevoflurane	Baxter	533-CA2L9117
Temperature control module	Kent Scientific	RightTemp	To control animal corporal temperature
Ventilator	Kent Scientific	PhysioSuite	To ventilate the animal
Water-bath	Thermo Scientific™	TSGP02	To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers