げっ歯類における大動脈デベンディングによる左心室逆改造の研究

要約

ここでは、大動脈収縮の確立されたマウスモデルにおける外科的大動脈デベンディングのステップバイステッププロトコルについて説明する。この手順は、左心室逆リモデリングと肥大の回帰の基礎となるメカニズムを研究するだけでなく、心筋回復を加速させる可能性のある新しい治療オプションをテストすることができます。

要約

左心室(LV)逆リモデリング(RR)をよりよく理解するために、大動脈バンディング誘発LVリモデリングの後、マウスが大動脈収縮の除去時にRRを受けるというげっ歯類モデルについて説明する。本論文では、マウスにおいて低侵襲の外科的大動脈デバディングを行うためのステップバイステップの手順について述べた。心エコー検査は、その後、LVリモデリングおよびRR中の心臓肥大および機能不全の程度を評価し、大動脈断層切り替えのための最良のタイミングを決定するために使用された。プロトコルの最後に、心機能の終末血力学的評価を行い、組織学的研究のためにサンプルを採取した。我々は、デベンディングが70〜80%の外科的生存率に関連していることを示した。さらに、退出後2週間後に、心室後負荷の有意な減少が心室肥大の退縮を引き起こす(〜20%)そして線維症(〜26%)、左心室充填および末方拡張期圧(E/e'およびLVEDP)の正常化によって評価される拡張期機能不全の回復。大動脈デベンディングは、げっ歯類のLV RRを研究するのに有用な実験モデルです。心筋回復の程度は被験者間で可変であり、したがって、大動脈弁置換のような臨床的文脈で生じるRRの多様性を模倣する。我々は、大動脈バンディング/デバンディングモデルは、RRのメカニズム、すなわち心臓肥大の退行および拡張機能不全の回復に関する新たな洞察を解明するための貴重なツールを表していると結論付ける。

概要

マウスにおける横方向または上昇大大体の収縮は、圧力過負荷誘発心肥大、拡張期および収縮期機能不全および心不全^{1、2、3、4}に対する広く使用される実験モデルである。大動脈収縮は、初期状態で補った左心室(LV)の同心性肥大を招き、壁応力¹を正常化する。しかしながら、長期の心臓過負荷などの特定の状況下では、この肥大は壁ストレスを減少させるのに不十分であり、拡張期および収縮期機能不全(病理学的肥大⁾⁵を引き起こす。並行して、細胞外マトリックス(ECM)の変化は、線維症として知られているプロセスでコラーゲン沈着および架橋をもたらし、これは置換線維症および反応性線維症に細分することができる。線維症は、ほとんどの場合、不可逆的であり、過負荷リリーフ^6、7後の心筋回復を妥協する。しかしながら、最近の心臓磁気共鳴画像法の研究では、反応性線維症^が長期8で退行することが明らかになった。全体として、線維症、肥大および心臓機能不全は、心不全(HF)に向かって急速に進行する心筋リモデリングとして知られているプロセスの一部である。

心筋リモデリングの特徴を理解することは、その進行を制限または逆転させる主要な目的となっており、後者はリバースリモデリング(RR)と呼ばれます。用語RRは、所定の介入によって慢性的に逆転した任意の心筋変化、そのような薬理学的療法(例えば、高血圧薬)、弁手術(例えば、大動脈狭窄症)または心室補助装置(例えば、慢性HF)を含む。しかし、RRは、多くの場合、優勢な肥大または収縮期/拡張期機能不全のために不完全である。したがって、RRの基礎となるメカニズムおよび新しい治療戦略の明確化はまだ欠落しており、これは主にこれらの患者のほとんどにおいてRR中のヒト心筋組織へのアクセスと研究が不可能であることによるものである。

この制限を克服するために、げっ歯類モデルはHF進行に関与するシグナル伝達経路の理解を進める上で重要な役割を果たしてきました。具体的には、大動脈狭窄を有するマウスの大動脈デバンディングは、これら2つの段階で異なる時点での心筋サンプルの収集を可能にする、逆筋LVリモデリング⁹および^RR10,11の下にある分子メカニズムを研究するのに有用なモデルを表す。さらに、RRを促進/加速できる潜在的な新規ターゲットをテストするための優れた実験的設定を提供します。例えば、大動脈狭窄の文脈では、このモデルは、RR6、12の(in)完全性の根底にある膨大な多様性の心筋応答に関与する分子メカニズムに関する情報を提供するかもしれないし、弁置換のための最適なタイミングは、現在の知識の大きな欠点を表す。実際、この介入の最適なタイミングは、主に大動脈勾配の大きさに基づいて定義されているため、議論の対象です。いくつかの研究は、線維症と拡張期機能不全が既^{に存在することが}多いので、この時点は心筋回復には遅すぎるかもしれないと提唱しています。

私たちの知る限りでは、これは、弁置換前後または抗高血圧薬の発症前後の大動脈狭窄または高血圧などの条件で起こっている心筋リモデリングとRRの両方のプロセスを再現する唯一の動物モデルです。

上記の課題に取り組むために、マウスとラットの両方で実施できる外科用動物モデルについて説明し、これら2つの種の違いに対処する。これらの手術を行う際の主な手順と詳細について説明します。最後に、RRの直前とRR全体でLVで起こっている最も重要な変更を報告します。

プロトコル

すべての動物実験は、実験動物のケアと使用のためのガイド(NIH出版第85-23号、改訂2011)および動物福祉に関するポルトガルの法律(DL 129/92、DL 197/96;P 1131/97)。管轄の地方自治体は、この実験プロトコル(018833)を承認しました。7週齢の雄C57B1/J6マウスは、定期的な12/12時間の明暗サイクル環境、22°Cの温度と60%の湿度で水にアクセスし、標準的な食事のアドリビタムで、適切なケージに維持されました。

1. 手術場の準備

1. 70%アルコールで操作部位を消毒し、手術領域の上に使い捨て手術室のテーブルカバーを置きます。
2. 手術前にすべての器具を殺菌してください。
   注:この手順は、マイクロ外科用ハサミ、2細かい湾曲した鉗子、3つの細かいストレート鉗子、メス、小さな鉗子、斜めのディスセクターはさみ、針ホルダー、超微細結紮助剤、2の止結剤、そして最後に磁気固定子の引き込みシステムを強く推奨する(図1A)。
3. 大間への容易なアプローチのために90°に26 G鈍い針の先端をカーブ。26G針は直径0.45mmの大動脈狭幅を作成する(図1B)。
4. 暖房パッドの温度を37±0.1 °Cに調整してください。

2. マウスの調製と挿管

1. 若いC57B1/J6マウス(20-25g)を、コーンチューブ内で0.5~1.0 L/min 100%O2で8%セボフルランを吸入して麻酔をします。
2. つま先ピンチ離脱反射を使用して麻酔の深さを確認してください。
3. 傾斜プレートの下底の不用さにマウスを置き、耳内挿管に進みます。
4. マウスを加熱パッドに移動し、耳通りの管を人工呼吸器に素早く接続して、機械換気を開始します。
5. 換気装置のパラメータを160呼吸/分の周波数と10 mL/kgの潮流量に調整します。

3. 手術の準備(バンディング手術とデバンディング手術の両方)

1. マウスの中胸レベルにネックラインから脱毛クリームを剃り、塗布します。
2. 角膜から乾燥を防ぐために、動物の目に眼科ゲルを適用します。
3. 直腸プローブとオキシメーターを足または尾に置き、それぞれ温度と血液酸素化、心拍数を監視します。
   注:麻酔は、重要な低体温を誘発し、従って、心拍数の急激な低下を避けるために、手術中に正常な体温を維持することが重要である。
4. セボフルラン(2.0〜3.0%)で麻酔を維持する。つま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の正しいレベルを確認してください。
5. マウスを右横の褥瘡に入れ、手術中に動物を正しい位置に保つためにテープで磁気固定子引き込みシステムに手足を固定する(図2、図3A)。
6. 70%のアルコールでマウスの胸を消毒し、続いてプロビドネ-ヨウ素溶液を消毒します。

4. 昇順大動脈バンディング手術

メモ: プロトコルの詳細については^、2、^{3、4、13を}参照してください。

1. 使い捨てブレードを使用して、腋窩レベルのすぐ下の左側に小さな(約0.5cm)の皮膚切開を行い、皮膚を解剖します。
2. 肋骨が見えるまで、胸筋と他の筋肉層を穏やかに解剖し、分離する。細かい鉗子を使用し、筋肉を切断しないでください。
3. 顕微鏡下で、肋間空間を特定し、微細な鉗子で第2^と 第3^の 肋間空間の間に小さな切開を開きます。
4. 胸部リトラクタを配置してリブを引き込む(図2A)。
5. 小さな鉗子を使用して、大オルタの上昇が見えるまで、胸腺葉を穏やかに解剖し、分離します。
   注意:コットンアプリケーターは、出血の場合に便利でなければなりません。温かい生殖不能食節は、著しい出血の場合に皮下に与えられるべきです(例えば、乳腺動脈)。
6. 小さな鉗子を使って大オルタを優しく解剖する。
   注:大オルタは、周囲に脂肪やその他の癒着がなく、小さなカーブ鉗子で血管を簡単に囲む可能性がある場合に解剖されると考えられます。
7. 大動脈解離後、結紮助剤と湾曲した鉗子を用いて大動脈の周囲に7-0ポリプロピレン合字を配置する(図2B)。
8. 鈍い26G針を大間(先端はマウスの頭部に向けて向いている)に平行に配置する(図2B)。20-25 gの体重のマウスの場合、この針は再現性の65-70%大動脈収縮を誘発する。
9. 大間と26G針の周りに2つの鉗子の助けを借りて2つの緩い結び目を作る(図2B)。
10. 1stノットを締め、その後すぐに2^番目のノットを締めます。収縮の正しい位置を簡単に確認し、速やかに大動脈血流を回復するために針を取り除く。最後に、3^番目の結び目(BAグループ)を作ります。
11. 胸腺と筋肉を初期位置に再配置します。
12. 狭窄手順と同じシャム手順を実行しますが、大間(SHAM基)の周りに縫合糸を緩く保ちます。
13. 縫合糸の端を切り、胸のレトラクタを取り外します。
    注: 短い縫合端の端部は大動脈圧で結び目が緩む確率を高める一方、長い端は縫合糸と左心房の間に付着が起こり得るので、デバディング手順を危険にする。
14. 可能な限り最も少ない数のステッチを使用して、単純な中断または連続縫合糸で6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して胸壁を閉じます。2sが肺を再膨張させるために人工呼吸器の流出をつまんで、最後の胸の結び目を最後のインスピレーションで膨らませて締めます。
15. 連続縫合パターンで6-0シルク/ポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。
    注:より新しい人工呼吸器を使用する場合は、インスピレーションで一時停止するようにプログラムすることができます(セットアップ-高度な一時停止-インスピレーション)

5. 術後ケア

1. 皮膚縫合部位にプロビドネ-ヨウ素溶液を塗布する。
2. 適切な鎮痛のために、ブプレノルフィンを皮下0.1mg/kg、1日2回、動物が完全に回復するまで投与する(通常、手術後2〜3日)。
3. 手術中に著しい出血が起きた場合の脱水を防ぐために、腹腔内に無菌生理的な生理を注入する。
4. 麻酔をオフにし(マウスを脱挿せずに)、動物が反射神経を回復するまで待ち(ウィスカーの動きは覚醒信号です)、自発的に呼吸を始めます。
5. 気管カニューレを取り外します。
6. 37°Cでインキュベーターで動物を回復させてください。
7. 完全な回復後、12時間の明暗サイクルルームに動物を戻します。

6. 大動脈の骨抜き手術

1. 7週間後、BA動物の半分で大石のデバンディングを行い、SHAMマウスの半分から緩い縫合糸を取り除き、それぞれ2つの新しいグループ(DEBING(DEB)とデバンディングSHAMA(DESHAM)を生み出します。デシャムは DEB グループの制御を表します (図 4)。
2. 上記の手順 2.1 ~ 3.6 を繰り返します。
3. 組織、接着、および大器官の周りの線維化を、その狭窄が見えるまで穏やかに解剖する。
4. 慎重に大オルタを解剖し、大間から縫合糸を分離します。縫合糸を斜みのあるワンプローブスプリングハサミで切ります(図3B)。
5. 可能なステッチの最小数を使用して、単純な中断または連続縫合糸で6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して胸壁を閉じます。
   注:気胸を避けるために肺が膨張したときに最後の胸の縫合糸を締めてみてください。
6. 連続縫合パターンで6-0シルク/ポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。
7. 5で述べたように、すべての術後のケア手順を実行します。
8. 2週間後に動物を犠牲にしてください。

7. 心エコー検査は、生体内の心機能および左心室肥大を評価する

1. 2~3週間ごとに心エコー検査を行い、肥大および心機能の進行に従います。
2. 動物を麻酔し、鼻コーンで5%セボフルランを吸入することによって、記載されている。麻酔レベルを2.5%に下げることで調整してください。
3. ネックラインから中胸レベルに脱毛クリームを塗ります。
4. 動物を加熱パッドの上に置き、ECG電極を置きます。良好な心電図のトレースを保証し、300〜350拍/分の間の心拍数を維持します。
5. 温度(37°C)を監視します。
6. エコーゲルを塗布し、動物を左横デキュビタスに配置します。
7. 心エコーを開始し、設定を調整します。
8. 超音波プローブを胸郭の上に置きます。
9. バンディング手術とデバンディング手術後7週間と2週間でバンド全体の圧力勾配を評価します。プローブをLVの長い軸に置き、大オルタの上にビームを置きます。ボタンPWを押して、パルス波ドップラー心エコー検査を有効にします。7週間のバンディングの後、大動脈勾配はバンド動物で>25 mmHgになります。
10. バンディングおよびデバンディングの有効性を解剖学的に可視化する上昇大オルタ収縮の有無を示す大オルタの2次元のガイド付き画像を記録する。
    注: カラーモードが使用可能な場合、収縮レベルで乱流を可視化することができます。
11. プローブをLV短軸、乳頭筋レベルに配置し、Mモードトレースを押して、LV前壁(LVAW)、LV直径(LVD)およびLV後壁(LVPW)をダイズストール(D)および収縮期(S)で可視化することによって肥大を評価する(図5)。
12. 収縮期関数を評価し、前述の^14,15のように放出分数と分数短縮を計算する。
13. 1)僧帽弁リーフレットのすぐ上の頂点4室の叙語的なビューを使用して、初期および後期の僧帽流速度(E波とA波)のパルス波ドップラーのピークを決定することによって拡張期関数を評価する。2)パルスTDIおよびアプリカル4チャンバーの素端図を用いて、横方向の僧帽環状心筋初期の拡張期(E')およびピーク収縮期(S')速度を記録する(図5)。
14. 各パラメーター評価に対して、3 つ以上の連続したハートビートを記録します。これらの値は、その後平均化されます。

8. 血行力学的評価

1. プロトコルの最後(図4)では、末端血行力評価の前に、7に記載されているように、最終的な心エコー検査を行う。
2. ステップ 2.1 ~ 3.6 を繰り返します。
3. 右頸静脈をカニュレートし、滅菌生理食糸を64 mL/kg/hで浸透させる。
4. 動物を左側に少し回転させ、xiphoid付録のレベルで皮膚切開を行います。
5. 鉗子またははさみで筋肉から皮膚を分離します。
6. 左肋骨間をxiphoidの付録レベルで横切りする。
7. 心臓を完全に露出させるために左横胸部の胸部を行う。
   注:出血や肺の損傷を避けるために、胸腔に綿棒を挿入し、肺を軽く押しながら、切断する場所の右側と左側に2つの止血を挿入します。
8. P-Vループカテーテルを水浴中の37°Cで予熱します。
9. カテーテルをキャリブレーションします(セットアップ、チャンネル設定、圧力と音量、単位に対して正しいチャンネルを選択)。
10. カテーテルを遠心からLVに挿入し、大動脈弁と頂点の間にボリュームセンサが配置されていることを確認します。体積は心エコー検査で評価できます(図5)。圧力容積ループの可視化は、カテーテルの正しい位置を確認するのに役立ちます(図6)。
11. 圧力量ループの形状を大きく変えることなく、動物が20〜30分安定するようにします。
12. 換気が終了期日に中断された状態で、ベースライン記録を取得する(図6)。1,000 Hzでデータを継続的に取得し、適切なソフトウェアによってその後、オフラインで分析されます。
13. ハイパートニック生理的な生理的なボーラス(10%、10 μL)後の並列コンダクタンスを計算します。
14. 麻酔をしながら、血液を排泄し、収集し、遠心分離することによって動物を犠牲にします。
15. 最後に、物品を食い物にして、心を集める。心臓、左、右心室を別々に重み付けし、その後の分子または組織学的研究のために、すぐに液体窒素またはホルマリンにサンプルを保存します。

ラットにおける大動脈バンディング/デバンディング手順

1. 22G針と6-0ポリプロピレン合字を使用して、大動脈を収縮させる若いウィスター(70-90g)で大動脈バンディングを行います。
2. セボフルランの3〜4%とブプレノルフィンの0.05mg/kgで適切な麻酔および鎮痛手順を確認してください。
3. 心エコー検査中、心拍数は常に300以上の心拍数/分(理想的には300〜350の間)を保証します。
4. ステップ8.9の前に、ラット大オルタを穏やかに解剖し、その周りにフロープローブを置き、心拍出量を測定する。大動脈フロープローブの使用は、ラットのゴールドスタンダード手順です。
5. 血行力学的評価のために、流体投与のために頸静脈または大腿静脈をカニューレ(32 mL/kg/h)する。
6. 圧力体積カテーテルSPR-1035をSPR-847またはSPR-838に交換し、そのサイズはラット心室の寸法に適しています。

結果

術後および後期生存
バンディング手順の周術期生存率は80%であり、最初の月の死亡率は典型的には<20%である。前述のように、骨抜き手術の成功は、以前の手術がどれほど侵襲的であったかによって大きく異なります。学習曲線の後、デベンディング手順中の死亡率は約25%です。この死亡率のアカウントは、大動脈または左心房破裂を含む手術処置中の主に死亡する(ラットで?...

ディスカッション

本明細書で提案されるモデルは、それぞれ大動脈バンディングおよびデバンディング後のLVリモデリングおよびRRのプロセスを模倣する。したがって、有害なLVリモデリングに関与する分子機構に関する我々の知識を進め、これらの患者の心筋回復を誘導することができる新しい治療戦略をテストするための優れた実験モデルを表しています。このプロトコルは、外科的外傷を軽減するために?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorption Spears	F.S.T	18105-03	To absorb fluids during the surgery
Blades	F.S.T	10011-00	To perform the skin incision
Buprenorphine	Buprelieve		Analgesia drug
Catutery	F.S.T	18010-00	To prevent exsanguination
Catutery tips	F.S.T	18010-01	To prevent exsanguination
cotton swab	Johnson's		To absorb fluids during the surgery
Depilatory cream	Veet		To delipate the animal
Disposable operating room table cover	MEDKINE	DYND4030SB	To cover the surgical area
Echo probe	Siemens	Sequoia 15L8W	Ultrasound signal aquisition
Echocardiograph	Siemens	Acuson Sequoia C512	Ultrasound signal aquisition
End-tidal CO2 monitor	Kent Scientific	CapnoStat	To control expiration gas saturation
Forcep/Tweezers	F.S.T	11255-20	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11272-30	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11151-10	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11152-10	To dissect the tissues and aorta
Gas system	Penlon Sigma Delta		To anesthesia and mechanical ventilation
Hemostats	F.S.T	13010-12	To hold the suture before tight the aorta
Hemostats	F.S.T	13011-12	To hold the suture before tight the aorta
Ligation aids	F.S.T	18062-12	To place a suture around the aorta
Magnetic retractor	F.S.T	18200-20	To help keep the animal in a proper position
Needle holder	F.S.T	12503-15	To suture the animal
Needle 26G	B-BRAUN	4665457	To serve as a molde of aortic constriction diameter
Oxygen	Air Liquide		To anesthesia and mechanical ventilation
Polipropilene suture	Vycril	W8304/W8597	To suture the animal and to do the constriction
Povidone-iodine solution	Betadine®		Skin antiseptic
PowerLab	Millar instruments	ML880 PowerLab 16/30	PV loop Signal Aquisition
Pulse oximeter	Kent Scientific	MouseStat	To control heart rate and blood saturation
PVAN software	Millar Instruments		To analyse the haemodynamic data
PV loop cathether	Millar instruments	SPR-1035. 1.4 F	PV loop Signal Aquisition
Retractor	F.S.T	17000-01	To provide a better overview of the aorta
Scalpet handle	F.S.T	10003-12	To perform the skin incision
Scissors	F.S.T	15070-08	To cut the suture in debanding surgery
Scissors	F.S.T	14084-09	To cut other material during the surgery e.g. suture, papper
Sevoflurane	Baxter	533-CA2L9117
Temperature control module	Kent Scientific	RightTemp	To control animal corporal temperature
Ventilator	Kent Scientific	PhysioSuite	To ventilate the animal
Water-bath	Thermo Scientific™	TSGP02	To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers