Изучение обратного ремоделирования левого желудочка путем дебандинга аорты у грызунов

Резюме

Здесь мы описываем пошаговый протокол хирургического деформирования аорты в хорошо зарекомендовавшей себя мышиной модели сужения аорты. Эта процедура не только позволяет изучить механизмы, лежащие в основе обратного ремоделирования и регрессии гипертрофии левого желудочка, но и протестировать новые терапевтические варианты, которые могут ускорить восстановление миокарда.

Аннотация

Чтобы лучше понять обратное ремоделирование левого желудочка (LV), мы описываем модель грызунов, в которой после ремоделирования ЛЖ, вызванного полосаткой аорты, мыши подвергаются ОР при удалении сужения аорты. В этой статье мы описываем пошаговую процедуру для выполнения минимально инвазивной хирургической деформирования аорты у мышей. Эхокардиография впоследствии использовалась для оценки степени гипертрофии и дисфункции сердца при ремоделировании ЛЖ и ОР и для определения наилучших сроков деформирования аорты. В конце протокола была проведена терминальная гемодинамическая оценка сердечной функции, а также собраны образцы для гистологических исследований. Мы показали, что дебандинг связан с хирургической выживаемостью 70-80%. Более того, через две недели после дебандирования значительное снижение желудочковой после нагрузки запускает регрессию желудочковой гипертрофии (~20%) и фиброз (~26%), восстановление диастолической дисфункции, оцениваемой нормализацией наполнения левого желудочка и концевого диастолического давления (E/e' и LVEDP). Деформирование аорты является полезной экспериментальной моделью для изучения РН ЛЖ у грызунов. Степень восстановления миокарда варьируется между субъектами, поэтому имитирует разнообразие ОР, которое происходит в клиническом контексте, например, замена аортального клапана. Мы пришли к выводу, что модель полосирования/де-де-полосатки аорты представляет собой ценный инструмент для разгадывания новых идей о механизмах ОР, а именно регрессии сердечной гипертрофии и восстановлении диастолической дисфункции.

Введение

Сужение поперечной или восходящей аорты у мыши является широко используемой экспериментальной моделью для гипертрофии сердца, вызванной перегрузкой давления, диастолической и систолической дисфункции и сердечной недостаточности^1,2,3,4. Сужение аорты первоначально приводит к компенсированной концентрической гипертрофии левого желудочка (LV) для нормализации напряжения^{стенки 1.} Однако при определенных обстоятельствах, таких как длительная сердечная перегрузка, эта гипертрофия недостаточна для уменьшения напряжения стенки, вызывая диастолическую и систолическую дисфункцию (патологическую гипертрофию)^5. Параллельно изменения во внеклеточном матриксе (ECM) приводят к отложению коллагена и сшиванию в процессе, известном как фиброз, который можно подразделить на замещающий фиброз и реактивный фиброз. Фиброз в большинстве случаев необратим и ставит под угрозу восстановление миокарда после перегрузки^6,7. Тем не менее, недавние исследования магнитно-резонансной томографии сердца показали, что реактивный фиброз способен регрессировать в долгосрочной перспективе^8. В целом, фиброз, гипертрофия и сердечная дисфункция являются частью процесса, известного как ремоделирование миокарда, который быстро прогрессирует в сторону сердечной недостаточности (HF).

Понимание особенностей ремоделирования миокарда стало основной целью для ограничения или обращения вспять его прогрессирования, последнее известно как обратное ремоделирование (RR). Термин RR включает любое изменение миокарда, хронически обращенное вспять данным вмешательством, такую фармакологическую терапию (например, антигипертензивные препараты), хирургию клапанов (например, стеноз аорты) или желудочковые вспомогательные устройства (например, хронический HF). Тем не менее, ОР часто является неполным из-за преобладающей гипертрофии или систолической / диастолической дисфункции. Таким образом, уточнение механизмов, лежащих в основе ОР, и новых терапевтических стратегий по-прежнему отсутствует, что в основном связано с невозможностью доступа и изучения ткани миокарда человека во время ОР у большинства из этих пациентов.

Чтобы преодолеть это ограничение, модели грызунов сыграли значительную роль в продвижении нашего понимания сигнальных путей, участвующих в прогрессировании ВЧ. В частности, де-полосирование аорты мышей с сужением аорты представляет собой полезную модель для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе неблагоприятного ремоделирования ЛЖ 9 и^{RR 10,11,} поскольку оно позволяет сбор образцов миокарда в разные моменты^{времени} в этих двух фазах. Кроме того, он обеспечивает отличную экспериментальную установку для тестирования потенциальных новых целей, которые могут способствовать / ускорять RR. Например, в контексте аортального стеноза эта модель может предоставить информацию о молекулярных механизмах, участвующих в огромном разнообразии реакции миокарда, лежащей в основе (не)полноты RR^6,12,а также об оптимальных таймингах для замены клапана, что представляет собой серьезный недостаток современных знаний. Действительно, оптимальное время для этого вмешательства является предметом споров, главным образом потому, что оно определяется на основе величины градиентов аорты. Несколько исследований говорят о том, что этот момент времени может быть слишком поздним для восстановления миокарда, поскольку фиброз и диастолическая дисфункция часто уже присутствуют^12.

Насколько нам известно, это единственная животная модель, которая резюмирует процесс как ремоделирования миокарда, так и ОР, происходящий в таких состояниях, как стеноз аорты или гипертония до и после замены клапана или начала антигипертензивных препаратов, соответственно.

Стремясь решить проблемы, кратко изложенные выше, мы описываем хирургическую модель животных, которая может быть реализована как на мышах, так и на крысах, обращаясь к различиям между этими двумя видами. Мы описываем основные шаги и детали, связанные с проведением этих операций. Наконец, мы сообщаем о наиболее значительных изменениях, происходящих в РН непосредственно перед и на протяжении всего РР.

протокол

Все эксперименты на животных соответствуют Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (публикация NIH No 85–23, пересмотрено в 2011 году) и португальскому закону о благополучии животных (DL 129/92, DL 197/96; С. 1131/97). Компетентные местные органы власти утвердили этот экспериментальный протокол (018833). Семинедельные самцы мышей C57B1/J6 содержались в соответствующих клетках, с регулярной средой 12/12 ч светло-темного цикла, температурой 22 °C и влажностью 60% с доступом к воде и стандартной диетой ad libitum.

1. Подготовка хирургического поля

1. Продезинфицируйте место операции 70% спиртом и поместите одноразовое покрытие операционного стола над областью операции.
2. Стерилизуйте все инструменты перед операцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры требуются микрохирургические ножницы, 2 тонких изогнутых щипца, 3 тонких прямых щипца, скальпель, небольшие щипцы, угловой ножницы рассекателя, держатель иглы, ультратонкое средство лигирования, 2 гемостата и, наконец, система втягивания магнитного фиксатора(рисунок 1A).
3. Изогнут кончик притупленной иглы 26 г до 90° для более легкого приближения к аорте. Игла 26 G создаст сужение аорты диаметром 0,45 мм(рисунок 1B).
4. Отрегулируйте температуру грелки до 37 ± 0,1 °C.

2. Подготовка и интубация мышей

1. Обезболивают молодых мышей C57B1/J6 (20-25 г) путем вдыхания 8% севофлурана с 0,5 - 1,0 л/мин 100%_O2 в конусной трубке.
2. Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса снятия щипа на ноготь.
3. Поместите мышь в спинное лежание на наклонную пластину и приступайте к оротрахеальной интубации.
4. Переместите мышь на грелку и быстро подключите оротрахеальную трубку к вентилятору, чтобы инициировать механическую вентиляцию.
5. Отрегулируйте параметры вентилятора до частоты 160 вдохов/мин и приливного объема 10 мл/кг.

3. Подготовка к операции (как для бандажирования, так и для операций по дебандингу)

1. Побрейте и нанесите крем для депиляции от декольте до середины грудной клетки мышей.
2. Нанесите офтальмологический гель на глаза животных, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
3. Поместите ректальный зонд и оксиметр на лапу или хвост для мониторинга температуры и оксигенации крови, а также частоты сердечных сокращений соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия вызывает значительное переохлаждение, поэтому важно поддерживать нормальную температуру тела во время операции, чтобы избежать быстрого снижения частоты сердечных сокращений.
4. Поддерживаю анестезию с севофлураном (2,0 - 3,0%). Проверьте правильный уровень анестезии по отсутствию рефлекса защемления.
5. Поместите мышей в право-боковой пролежне на грелку и закрепите конечности к магнитной фиксаторной системе втягивания лентой, чтобы удерживать животное в правильном положении во время операции(Рисунок 2, Рисунок 3А).
6. Продезинфицируйте грудную клетку мыши 70% спиртом с последующим раствором провидона-йода.

4. Бандажирование восходящей аорты

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного описания протокола обратитесь к ^2,3,4,13.

1. Одноразовым лезвием выполните небольшой (~0,5 см) разрез кожи с левой стороны непосредственно ниже уровня впысь и рассекли кожу.
2. Осторожно рассекните и отделите грудную мышцу и другие мышечные слои, пока ребра не станут видимыми. Используйте тонкие щипцы и избегайте разрезания мышц.
3. Под микроскопом определите межребра и вскройте небольшой разрез между^2-м и^3-м межребрюшным пространством тонкими щипцами.
4. Втягиваем ребра, размещая грудной втягиватель(рисунок 2А).
5. Используйте небольшие щипцы, чтобы аккуратно рассекать и отделить доли тимика до тех пор, пока не станет видна восходящая аорта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хлопковые аппликаторы должны быть удобны в случае кровотечения. Теплый стерильный физиологический раствор следует давать подкожно в случае значительного кровотечения (например, молочной артерии).
6. Используйте небольшие щипцы, чтобы аккуратно рассекать аорту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аорта считается рассеченной, когда вокруг нее нет жира или других спаек и можно легко окружить сосуд небольшими кривыми щипцами.
7. После расслоения аорты поместите полипропиленовую лигатуру 7-0 вокруг аорты, используя средство перевязки и изогнутые щипцы(рисунок 2B).
8. Расположите притупленную иглу 26 G параллельно аорте (кончик направлен в сторону головы мышей)(рисунок 2B). Для мышей весом 20-25 г эта игла вызывает воспроизводимое сужение аорты на 65-70%.
9. Сделайте 2 свободных узла вокруг аорты и иглу 26 G с помощью 2 щипцов(рисунок 2B).
10. Затяните^1-й узел и, быстро после этого,^2-й узел. Кратко подтвердите правильное позиционирование сужения и быстро извлеките иглу для восстановления аортального кровотока. Наконец, сделайте^3-й узел (группа БА).
11. Переместите тимус и мышцы в исходное положение.
12. Выполните фиктивную процедуру, идентичную процедуре сужения, но сохраняя шов свободным вокруг аорты (группа SHAM).
13. Обрежьте концы шва и удалите грудной втягиватель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Короткие концы шва могут увеличить вероятность ослабления узлов при аортальном давлении, в то время как длинные концы делают процедуру расвязки более рисковитой, поскольку между швом и левым предсердием могут возникать спайки.
14. Закройте грудную стенку с помощью полипропиленовой шва 6-0 простым прерываемым или непрерывным швом, используя наименьшее количество швов. Затяните последний грудной узел с легкими, раздутыми в конце вдувания, защемляя отток вентилятора на 2 с, чтобы повторно надуть легкие.
15. Закройте кожу шовным швом из шелка/полипропилена 6-0 непрерывным швом.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Если используется более поздний вентилятор, его можно запрограммировать на паузу в вдохновении (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)

5. Послеоперационный уход

1. Нанесите провидон-йодный раствор на участок шва кожи.
2. Для правильного обезболивания вводят бупренорфин подкожно по 0,1 мг/кг два раза в день, пока животное полностью не восстановится (обычно через 2-3 дня после операции).
3. Вводят стерильный физиологический раствор внутрибрюшинно для предотвращения обезвоживания в случае значительного кровотечения во время операции.
4. Выключите анестезию (не деинтубируя мышь) и подождите, пока животное восстановит рефлексы (движения усов являются пробуждающим сигналом) и начнет дышать спонтанно.
5. Удалите канюлю трахеи.
6. Дайте животному восстановиться в инкубаторе при 37 °C.
7. Верните животное в 12-часовую комнату светло-темного цикла после полного выздоровления.

6. Операция по дебандированию аорты

1. Семь недель спустя выполните де-деминг аорты у половины животных БА и удалите свободный шов с половины мышей SHAM, что приведет к появлению 2 новых групп - дебангирование (DEB) и де-демирование SHAMA (DESHAM) соответственно. DESHAM представляет собой элемент управления для группы DEB(рисунок 4).
2. Повторите все шаги с 2.1 по 3.6, упомянутые выше.
3. Осторожно рассекаете ткани, спайки и фиброз вокруг аорты, пока ее сужение не станет видимым.
4. Тщательно рассеките аорту и отделите шов от аорты. Отрежьте шов угловыми однозондовыми пружинными ножницами(рисунок 3Б).
5. Закройте грудную стенку с помощью полипропиленовой шва 6-0 простым прерванным или непрерывным швом, используя минимально возможное количество швов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте подтянуть последний грудной шов, когда легкие надуты, чтобы избежать пневмоторакса.
6. Закройте кожу шовным швом из шелка/полипропилена 6-0 непрерывным швом.
7. Выполните все процедуры послеоперационного ухода, как указано в пункте 5.
8. Приносите животных в жертву через 2 недели.

7. Эхокардиография для оценки сердечной функции и гипертрофии левого желудочка in vivo

1. Выполняйте эхокардиографическое исследование каждые 2-3 недели, чтобы проследить прогрессирование гипертрофии и сердечной функции.
2. Обезболивание животных, как описано, путем вдыхания 5% севофлурана с носовым конусом. Отрегулируйте уровень анестезии, снизив его до 2,5%.
3. Побрейте и нанесите крем для депиляции от декольте до середины груди.
4. Поместите животное на грелку и поместите электроды ЭКГ. Обеспечьте хороший след ЭКГ и поддерживайте частоту сердечных сокращений от 300 до 350 ударов в минуту.
5. Следите за температурой (~37 °C).
6. Нанесите эхо-гель и расположите животное в левом боковом продольном продольном.
7. Запустите эхокардиограф и отрегулируйте настройки.
8. Поместите ультразвуковой зонд над грудной клеткой.
9. Оцените градиент давления через полосу через 7 и 2 недели после операции по полосам и дебандингу соответственно. Поместите зонд на длинную ось LV и поместите пучок над аортой. Нажмите кнопку PW для активации импульсно-волновой допплеровской эхокардиографии. После семи недель полосирования градиенты аорты будут >25 мм рт.ст. у полосатых животных.
10. Записывайте двумерные управляемые изображения аорты, показывающие наличие или отсутствие восходящего сужения аорты, чтобы анатомически визуализировать эффективность полосирования и де-полосирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно визуализировать турбулентный поток на уровне сужения, если доступен цветовой режим.
11. Оцените гипертрофию, расположив зонд на короткой оси LV, на уровне сосочковых мышц, и нажмите трассировку M-режима, чтобы визуализировать переднюю стенку LV (LVAW), диаметр LV (LVD) и заднюю стенку LV (LVPW) в диастоле (D) и систоле (S)(рисунок 5).
12. Оцените систолическую функцию, рассчитайте фракцию выброса и дробное укорочение, как описано^{ранее 14,15.}
13. Оценить диастолическую функцию путем 1) определения пика импульсно-волновой допплеровской скорости раннего и позднего митрального потока (волны Е и А соответственно) с помощью апикального 4-камерного апикального вида чуть выше митральных листочков; 2) запись боковых митральных кольцевых миокарда раннедиастолических (E') и пиковых систолических (S') скоростей с использованием импульсно-TDI и апикального 4-камерного апикального вида(рисунок 5).
14. Запишите не менее трех последовательных сердечных сокращений для каждой оценки параметров. Эти значения будут впоследствии усреднены.

8. Гемодинамическая оценка

1. В конце протокола(рисунок 4)выполняют окончательную эхокардиографию, как описано в 7, перед терминальной гемодинамической оценкой.
2. Повторите шаги 2.1–3.6.
3. Канюлюлировать правую яремную вену и перфузировать стерильный физиологический раствор при 64 мл/кг/ч.
4. Слегка поверните животное в левую сторону и сделайте разрез кожи на уровне кипочного аппендикса.
5. Отделите кожу от мышцы щипцами или ножницами.
6. Сделайте боковой разрез между левыми ребрами на уровне квисотого аппендикса.
7. Выполните левую боковую торакотомию, чтобы полностью обнажить сердце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать кровотечения и повреждения легких, вставьте ватный тампон в грудную полость и осторожно надавите на легкое, вставив два гемостата с правой и левой стороны места для разреза.
8. Предварительно нагрейте катетеры P-V loop в водяной бане при 37 °C.
9. Откалибруйте катетер (настройка, настройка канала, выбор правильного канала по давлению и объему, единицы измерения).
10. Вставьте катетер в РН и убедитесь, что датчики объема расположены между аортальным клапаном и вершиной. Объемы можно оценить с помощью эхокардиографии(рисунок 5). Визуализация напорно-объемных петель помогает подтвердить правильное позиционирование катетера(рисунок 6).
11. Дайте животному стабилизироваться через 20-30 мин без существенных изменений формы напор-объемных петель.
12. Когда вентиляция приостановлена по истечении срока действия, приобретите базовые записи(рисунок 6). Непрерывно получать данные с частотой 1000 Гц для последующего анализа в режиме онлайн с помощью соответствующего программного обеспечения.
13. Вычислить параллельную проводимость после гипертонического соляного болюса (10%, 10 мкл).
14. Во время обезболивания принесите животное в жертву путем экссангинации, соберите и центрифугировать кровь.
15. Наконец, иссейте и соберите сердце. Взвешивайте сердце, левый и правый желудочек отдельно и немедленно храните образцы в жидком азоте или формалине для последующих молекулярных или гистологических исследований соответственно.

9. Процедура полосирования/де-полосирования аорты у крыс

1. Выполняют бандажирование аорты у молодого Вистар (70-90 г) с использованием иглы 22 г и полипропилено-0 лигатуры для сужения аорты.
2. Обеспечьте надлежащую анестезию и обезболивающий процедуры с 3-4% севофлурана и 0,05 мг/кг бупренорфина соответственно.
3. Во время эхокардиографии убедитесь, что частота сердечных сокращений всегда выше 300 / мин (в идеале между 300 и 350).
4. Перед шагом 8.9 аккуратно рассекте аорту крысы, поместите вокруг нее протоковый зонд для измерения сердечного выброса. Использование зонда аортального потока является золотым стандартом для крыс.
5. Для гемодинамической оценки канюлюгируют яремную или бедренную вену для введения жидкости (32 мл /кг /ч).
6. Замените напорный объемный катетер SPR-1035 на SPR-847 или SPR-838, размеры которых лучше соответствуют размерам желудочков крысы.

Результаты

Послеоперационное и позднее выживание
Периоперационная выживаемость при процедуре бандажировки составляет 80%, а смертность в течение первого месяца обычно составляет <20%. Как упоминалось ранее, успех операции по дебандированию сильно зависит от того, насколько инвазивной б...

Обсуждение

Предложенная здесь модель имитирует процесс ремоделирования РН и РР после полосирования и дебандирования аорты соответственно. Таким образом, он представляет собой отличную экспериментальную модель для продвижения наших знаний о молекулярных механизмах, участвующих в неблагоприят?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorption Spears	F.S.T	18105-03	To absorb fluids during the surgery
Blades	F.S.T	10011-00	To perform the skin incision
Buprenorphine	Buprelieve		Analgesia drug
Catutery	F.S.T	18010-00	To prevent exsanguination
Catutery tips	F.S.T	18010-01	To prevent exsanguination
cotton swab	Johnson's		To absorb fluids during the surgery
Depilatory cream	Veet		To delipate the animal
Disposable operating room table cover	MEDKINE	DYND4030SB	To cover the surgical area
Echo probe	Siemens	Sequoia 15L8W	Ultrasound signal aquisition
Echocardiograph	Siemens	Acuson Sequoia C512	Ultrasound signal aquisition
End-tidal CO2 monitor	Kent Scientific	CapnoStat	To control expiration gas saturation
Forcep/Tweezers	F.S.T	11255-20	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11272-30	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11151-10	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11152-10	To dissect the tissues and aorta
Gas system	Penlon Sigma Delta		To anesthesia and mechanical ventilation
Hemostats	F.S.T	13010-12	To hold the suture before tight the aorta
Hemostats	F.S.T	13011-12	To hold the suture before tight the aorta
Ligation aids	F.S.T	18062-12	To place a suture around the aorta
Magnetic retractor	F.S.T	18200-20	To help keep the animal in a proper position
Needle holder	F.S.T	12503-15	To suture the animal
Needle 26G	B-BRAUN	4665457	To serve as a molde of aortic constriction diameter
Oxygen	Air Liquide		To anesthesia and mechanical ventilation
Polipropilene suture	Vycril	W8304/W8597	To suture the animal and to do the constriction
Povidone-iodine solution	Betadine®		Skin antiseptic
PowerLab	Millar instruments	ML880 PowerLab 16/30	PV loop Signal Aquisition
Pulse oximeter	Kent Scientific	MouseStat	To control heart rate and blood saturation
PVAN software	Millar Instruments		To analyse the haemodynamic data
PV loop cathether	Millar instruments	SPR-1035. 1.4 F	PV loop Signal Aquisition
Retractor	F.S.T	17000-01	To provide a better overview of the aorta
Scalpet handle	F.S.T	10003-12	To perform the skin incision
Scissors	F.S.T	15070-08	To cut the suture in debanding surgery
Scissors	F.S.T	14084-09	To cut other material during the surgery e.g. suture, papper
Sevoflurane	Baxter	533-CA2L9117
Temperature control module	Kent Scientific	RightTemp	To control animal corporal temperature
Ventilator	Kent Scientific	PhysioSuite	To ventilate the animal
Water-bath	Thermo Scientific™	TSGP02	To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers