Estudando remodelagem reversa ventricular esquerda por debandagem aórtica em roedores

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo de desbandada cirúrgica de aorta no modelo de camundongos bem estabelecido de constrição aórtica. Este procedimento não só permite estudar os mecanismos subjacentes à remodelação reversa ventricular esquerda e à regressão da hipertrofia, mas também testar novas opções terapêuticas que possam acelerar a recuperação do miocárdio.

Resumo

Para entender melhor a remodelagem reversa ventricular esquerda (LV) (RR), descrevemos um modelo de roedor no qual, após a remodelação de LV induzida por banda aórtica, os ratos passam por RR após a remoção da constrição aórtica. Neste artigo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para realizar uma debandagem aórtica cirúrgica minimamente invasiva em camundongos. A ecocardiografia foi posteriormente utilizada para avaliar o grau de hipertrofia cardíaca e disfunção durante a remodelação de LV e RR e determinar o melhor tempo para a debandagem aórtica. Ao final do protocolo, foi realizada avaliação hemodinâmica terminal da função cardíaca e coleta de amostras para estudos histológicos. Mostramos que a debandada está associada a taxas de sobrevivência cirúrgica de 70-80%. Além disso, duas semanas após a debandada, a redução significativa da carga pós-onda ventricular desencadeia a regressão da hipertrofia ventricular (~20%) e fibrose (~26%), recuperação da disfunção diastólica avaliada pela normalização do preenchimento ventricular esquerdo e das pressões diastólicas finais (E/e' e LVEDP). A debandagem aoórtica é um modelo experimental útil para estudar LV RR em roedores. A extensão da recuperação do miocárdio é variável entre os sujeitos, portanto, imitando a diversidade de RR que ocorre no contexto clínico, como a substituição da válvula aórtica. Concluímos que o modelo de banda/debandada aórtica representa uma ferramenta valiosa para desvendar novas percepções sobre os mecanismos da RR, ou seja, a regressão da hipertrofia cardíaca e a recuperação da disfunção diastólica.

Introdução

A constrição da aorta transversal ou ascendente no camundongo é um modelo experimental amplamente utilizado para hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de pressão, disfunção diastólica e sistólica e insuficiência cardíaca^1,2,3,4. A constrição aórtica inicialmente leva à hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo compensado (LV) para normalizar o estresse da parede¹. No entanto, sob certas circunstâncias, como a sobrecarga cardíaca prolongada, essa hipertrofia é insuficiente para diminuir o estresse da parede, desencadeando disfunção diastólica e sistólica (hipertrofia patológica)⁵. Paralelamente, mudanças na matriz extracelular (ECM) levam à deposição do colágeno e à interligação em um processo conhecido como fibrose, que pode ser subdividido em fibrose de substituição e fibrose reativa. A fibrose é, na maioria dos casos, irreversível e compromete a recuperação do miocárdio após alívio de sobrecarga^6,7. No entanto, estudos recentes de ressonância magnética cardíaca revelaram que a fibrose reativa é capaz de regredir a longo prazo⁸. Ao todo, fibrose, hipertrofia e disfunção cardíaca fazem parte de um processo conhecido como remodelagem do miocárdio que progride rapidamente para a insuficiência cardíaca (HF).

Compreender as características da remodelagem do miocárdio tornou-se um grande objetivo para limitar ou reverter sua progressão, esta última conhecida como remodelagem reversa (RR). O termo RR inclui qualquer alteração do miocárdio cronicamente revertida por uma dada intervenção, tal terapia farmacológica (por exemplo, medicação antihipertensiva), cirurgia de válvula (por exemplo, estenose aórtica) ou dispositivos de assistência ventricular (por exemplo, HF crônico). No entanto, a RR é frequentemente incompleta devido à hipertrofia predominante ou disfunção sistólica/diastólica. Assim, ainda faltam o esclarecimento dos mecanismos subjacentes da RR e novas estratégias terapêuticas, o que se deve principalmente à impossibilidade de acesso e estudo do tecido miocárdio humano durante a RR na maioria desses pacientes.

Para superar essa limitação, os modelos de roedores têm desempenhado um papel significativo no avanço da nossa compreensão das vias de sinalização envolvidas na progressão do HF. Especificamente, a debandagem aórtica de camundongos com constrição aórtica representa um modelo útil para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à remodelação adversa da LV⁹ e RR^10,11, pois permite a coleta de amostras de miocárdio em diferentes pontos de tempo nessas duas fases. Além disso, fornece uma excelente configuração experimental para testar potenciais alvos novos que podem promover/acelerar o RR. Por exemplo, no contexto da estenose aórtica, este modelo pode fornecer informações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na vasta diversidade da resposta do miocárdio subjacente à (in)completude da RR^6,12, bem como, o tempo ideal para a substituição da válvula, o que representa uma grande deficiência do conhecimento atual. De fato, o momento ideal para essa intervenção é objeto de debate, principalmente porque é definido com base na magnitude dos gradientes aórticos. Vários estudos defendem que este ponto de tempo pode ser tarde demais para a recuperação do miocárdio, pois fibrose e disfunção diastólica já estão frequentemente presentes¹².

Pelo que sabemos, este é o único modelo animal que recapitula o processo de remodelação do miocárdio e RR em condições como estenose aórtica ou hipertensão antes e depois da substituição da válvula ou o início de medicamentos anti-hipertensivos, respectivamente.

Buscando enfrentar os desafios resumidos acima, descrevemos um modelo animal cirúrgico que pode ser implementado tanto em camundongos quanto em ratos, abordando as diferenças entre essas duas espécies. Descrevemos os principais passos e detalhes envolvidos na realização dessas cirurgias. Por fim, relatamos as mudanças mais significativas que ocorrem na LV imediatamente antes e em toda a RR.

Protocolo

Todos os experimentos em animais estão em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NNI Publicação nº 85-23, revisado em 2011) e a lei portuguesa sobre o bem-estar animal (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). As autoridades locais competentes aprovaram este protocolo experimental (018833). Os camundongos C57B1/J6 masculinos de sete semanas foram mantidos em gaiolas apropriadas, com um ambiente regular de ciclo claro-escuro de 12/12 horas, uma temperatura de 22 °C e 60% de umidade com acesso à água e um anúncio padrão de dieta libitum.

1. Preparação do campo cirúrgico

1. Desinfete o local de operação com 70% de álcool e coloque uma tampa de mesa de sala de cirurgia descartável sobre a área cirúrgica.
2. Esterilize todos os instrumentos antes da cirurgia.
   NOTA: Este procedimento requer uma tesoura micro cirúrgica, 2 fórceps curvos finos, 3 fórceps retos finos, um bisturi, fórceps pequenos, uma tesoura dissente angular, um suporte de agulha, um auxílio de ligadura ultrafina, 2 hemostats e, por último, um sistema de retração de fixador magnético é altamente recomendado(Figura 1A).
3. Curve a ponta de uma agulha de 26 G em linha até 90° para uma aproximação mais fácil à aorta. Uma agulha de 26 G criará um estreitamento aórtico de 0,45 mm de diâmetro(Figura 1B).
4. Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para 37 ± 0,1 °C.

2. Preparação e intubação de camundongos

1. Anestesiar camundongos jovens C57B1/J6 (20-25 g) por inalação de 8% de sevoflurano com 0,5 - 1,0 L/min 100% O₂ em um tubo de cone.
2. Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de abstinência do dedo do dedo do dedo do dedo.
3. Coloque o mouse na recência dorsal em uma placa inclinada e prossiga para a intubação orotraqueal.
4. Mova o mouse para a almofada de aquecimento e conecte rapidamente o tubo orotraqueal ao ventilador para iniciar a ventilação mecânica.
5. Ajuste os parâmetros do ventilador para uma frequência de 160 respirações/min e um volume de maré de 10 mL/kg.

3. Preparação para cirurgia (para cirurgias de banda e desbandada)

1. Raspe e aplique o creme depilatório do decote ao nível médio do peito dos ratos.
2. Aplique gel oftálmico nos olhos dos animais para evitar a secagem da córnea.
3. Coloque uma sonda retal e o oxímetro na pata ou cauda para monitorar a temperatura e a oxigenação sanguínea, e a frequência cardíaca, respectivamente.
   NOTA: A anestesia induz hipotermia significativa, portanto, é importante manter a temperatura normal do corpo durante a cirurgia para evitar uma rápida diminuição da frequência cardíaca.
4. Manter anestesia com sevoflurano (2,0 - 3,0%). Verifique o nível correto da anestesia pela falta do reflexo do dedo do sol.
5. Coloque os camundongos em decúbito lateral-direito em uma almofada de aquecimento e fixe os membros no sistema de retração do fixador magnético com uma fita para manter o animal na posição correta durante a cirurgia (Figura 2, Figura 3A).
6. Desinfete o baú do rato com 70% de álcool seguido pela solução de providone-iodo.

4. Cirurgia de banda aórtica ascendente

NOTA: Para uma descrição detalhada do protocolo, consulte ^2,3,4,13.

1. Com uma lâmina descartável, realize uma pequena incisão de pele (~0,5 cm) no lado esquerdo imediatamente abaixo do nível de axila e disseque a pele.
2. Disseca suavemente e separe o músculo peitoral e outras camadas musculares até que as costelas se tornem visíveis. Use fórceps finos e evite cortar o músculo.
3. Sob um microscópio, identifique os espaços intercostais e abra uma pequena incisão entre o^2º e o^3º espaço intercostal com fórceps finos.
4. Retraia as costelas colocando o retítil do peito(Figura 2A).
5. Use pequenas fórceps para dissecar suavemente e separar os lóbulos timímicos até que a aorta ascendente se torne visível.
   NOTA: Os aplicadores de algodão devem ser úteis em caso de sangramento. O soro fisiológico quente estéril deve ser dado subcutâneamente em caso de sangramento significativo (por exemplo, a artéria mamária).
6. Use pequenas fórceps para dissecar suavemente a aorta.
   NOTA: A aorta é considerada dissecada quando não há gordura ou outras aderências ao seu redor e é possível cercar facilmente o vaso com uma pequena curva fórceps.
7. Após dissecção aórtica, coloque uma ligadura de polipropileno 7-0 ao redor da aorta usando ajuda de ligadura e fórceps curvos(Figura 2B).
8. Posicione a agulha de 26 G em linha paralela à aorta (ponta apontada para a cabeça do camundongo) (Figura 2B). Para camundongos que pesam 20-25 g, esta agulha induz uma constrição aórtica reprodutível de 65-70%.
9. Faça 2 nós soltos ao redor da aorta e da agulha de 26 G com a ajuda de 2 fórceps(Figura 2B).
10. Aperte o^1º nó e, logo depois, o^2º nó. Confirme brevemente o posicionamento certo da constrição e remova rapidamente a agulha para restaurar o fluxo sanguíneo aórtico. Por fim, faça um^3º nó (grupo BA).
11. Reposicione o timo e os músculos em sua posição inicial.
12. Realize o procedimento falso idêntico ao procedimento de constrição, mas mantendo a sutura solta ao redor da aorta (grupo SHAM).
13. Corte as extremidades da sutura e remova o retrátil do peito.
    NOTA: As extremidades curtas da sutura podem aumentar a probabilidade de afrouxamento de nós com pressão aórtica, enquanto as extremidades longas tornam o procedimento de debandada mais arriscado, uma vez que as aderências podem ocorrer entre a sutura e o átrio esquerdo.
14. Feche a parede torácica usando sutura de polipropileno 6-0 com uma sutura simples interrompida ou contínua usando o menor número de pontos possíveis. Aperte o último nó torácico com os pulmões inflados na inspiração final, beliscando o fluxo do ventilador por 2s para reinflar os pulmões.
15. Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão contínuo de sutura.
    NOTAs: Se um ventilador mais recente for usado, é possível programá-lo para fazer uma pausa na inspiração (Configuração-Advanced-Pause-Inspiration)

5. Cuidados pós-operatórios

1. Aplique solução de providona-iodo no local da sutura da pele.
2. Para analgesia adequada, administre buprenorfina subcutâneamente 0,1 mg/kg, duas vezes por dia, até que o animal se recupere totalmente (geralmente 2-3 dias após a cirurgia).
3. Injete soro fisiológico estéril intraperitoneal para evitar desidratação em caso de sangramento significativo durante a cirurgia.
4. Desligue a anestesia (sem desintubar o camundongo) e espere até que o animal recupere os reflexos (os movimentos dos bigodes são um sinal de despertar) e comece a respirar espontaneamente.
5. Remova a cânula traqueal.
6. Deixe o animal se recuperar em uma incubadora a 37 °C.
7. Retorne o animal a uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas após a recuperação completa.

6. Cirurgia de debandagem aórtica

1. Sete semanas depois, realize a debandada da aorta em metade dos animais da BA e remova a sutura solta de metade dos ratos SHAM, dando origem a dois novos grupos - debanding (DEB) e debanding SHAMA (DESHAM), respectivamente. A DESHAM representa o controle para o grupo DEB (Figura 4).
2. Repita todas as etapas 2.1 a 3.6 mencionadas acima.
3. Dissecar suavemente os tecidos, aderências e fibrose ao redor da aorta até que sua constrição se torne visível.
4. Dissecar cuidadosamente a aorta e separar a sutura da aorta. Corte a sutura com uma tesoura de mola de uma sonda(Figura 3B).
5. Feche a parede torácica usando sutura de polipropileno 6-0 com uma sutura simples interrompida ou contínua usando o número mínimo de pontos possíveis.
   NOTA: Tente apertar a última sutura torácica quando os pulmões estiverem inflados para evitar pneumotórax.
6. Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão contínuo de sutura.
7. Realizar todos os procedimentos de assistência pós-operatória, conforme mencionado em 5.
8. Sacrifique os animais duas semanas depois.

7. Ecocardiografia para avaliar função cardíaca e hipertrofia ventricular esquerda in vivo

1. Realize o exame ecocardiográfico a cada 2-3 semanas para acompanhar a progressão da hipertrofia e da função cardíaca.
2. Anestesiar os animais, como descrito, por inalação de 5% de sevoflurano com um cone de nariz. Ajuste o nível de anestesia diminuindo-o para 2,5%.
3. Raspe e aplique o creme depilatório do decote ao nível médio do peito.
4. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento e coloque os eletrodos ECG. Assegure um bom traço de ECG e mantenha a frequência cardíaca entre 300 e 350 batidas/min.
5. Monitore a temperatura (~37 °C).
6. Aplique gel ecológico e posicione o animal no decúbito lateral esquerdo.
7. Inicie o ecocardiograma e ajuste as configurações.
8. Posicione uma sonda de ultrassom sobre o tórax.
9. Avalie o gradiente de pressão em toda a banda em 7 e 2 semanas após a cirurgia de banda e desbandada, respectivamente. Posicione a sonda no eixo longo lv e coloque o feixe sobre a aorta. Pressione o botão PW para ativar a ecocardiografia do doppler de onda pulsada. Após sete semanas de banda, os gradientes aórticos serão >25 mmHg nos animais de banda.
10. Gravar imagens guiadas bidimensionais da aorta mostrando a presença ou ausência da constrição ascendente da aorta para visualizar anatomicamente a eficácia da banda e debandar.
    NOTA: É possível visualizar o fluxo turbulento no nível de constrição se o modo de cor estiver disponível.
11. Avalie a hipertrofia posicionando a sonda em um eixo curto LV, no nível dos músculos papilares, e pressione o rastreamento do modo M para visualizar a parede anterior LV (LVAW), o diâmetro lv (LVD) e a parede posterior lv (LVPW) em diastole (D) e systole (S)(Figura 5).
12. Avalie a função sistólica, calcule a fração de ejeção e o encurtamento fracionado como descrito anteriormente^14,15.
13. Avalie a função diastólica por 1) determinando o pico do Doppler de ondas pulsadas de velocidade de fluxo mitral precoce e tardia (ondas E e A, respectivamente) usando uma visão apical apical de 4 câmaras logo acima dos folhetos mitral; 2) gravação lateral mitral anular miocárdio diastólico precoce (E') e pico sistólica (S') velocidades utilizando pulsado-TDI e apical de 4 câmaras apical(Figura 5).
14. Registo pelo menos três batimentos cardíacos consecutivos em cada avaliação do parâmetro. Esses valores serão posteriormente mediados.

8. Avaliação hemodinâmica

1. Ao final do protocolo (Figura 4),realizar a ecocardiografia final, conforme descrito em 7, antes da avaliação hemodinâmica terminal.
2. Repita as etapas 2.1 a 3.6.
3. Cannulate a veia jugular direita e perfuse soro fisiológico estéril a 64 mL/kg/h.
4. Gire ligeiramente o animal para o lado esquerdo e faça uma incisão da pele ao nível do apêndice xiphoide.
5. Separe a pele do músculo com fórceps ou com uma tesoura.
6. Faça uma incisão lateral entre as costelas esquerdas no nível do apêndice xiphoide.
7. Faça uma toracotomia lateral esquerda para expor o coração completamente.
   NOTA: Para evitar sangramentos e danos pulmonares, insira um cotonete na cavidade torácica e empurre o pulmão suavemente enquanto insere dois hemostatos no lado direito e esquerdo do lugar para cortar.
8. Pré-aqueça os cateteres de alça P-V em um banho de água a 37 °C.
9. Calibrar o cateter (configuração, configuração do canal, escolheu o canal correto para pressão e volume, unidades).
10. Insira um cateter apático no LV e garanta que os sensores de volume estejam posicionados entre a válvula aórtica e o ápice. Os volumes podem ser avaliados por ecocardiografia (Figura 5). A visualização dos laços de volume de pressão ajuda a confirmar o posicionamento correto do cateter (Figura 6).
11. Deixe o animal estabilizar 20-30 min sem mudanças significativas na forma dos laços de volume de pressão.
12. Com a ventilação suspensa no vencimento final, adquira gravações de linha de base(Figura 6). Adquira continuamente dados a 1.000 Hz para serem posteriormente analisados off-line por software apropriado.
13. Compute a conduance paralela após o bolus de soro fisiológico hipertônico (10%, 10 μL).
14. Enquanto anestesiado, sacrifique o animal por exsanguinação, colete e centrifuge o sangue.
15. Por último, extirem e recolhem o coração. Pondere o coração, o ventrículo esquerdo e o ventrículo direito separadamente e imediatamente armazene as amostras em nitrogênio líquido ou formalina para estudos moleculares ou histológicos subsequentes, respectivamente.

9. Procedimento de banda/debandada aórtica em ratos

1. Execute banda aórtica no jovem Wistar (70-90 g) usando uma agulha de 22 G e ligadura de polipropileno 6-0 para restringir a aorta.
2. Assegurar um procedimento anestésico e analgésico adequado com 3-4% de sevoflurano e 0,05 mg/kg de buprenorfina, respectivamente.
3. Durante a ecocardiografia, assegurar uma frequência cardíaca sempre acima de 300 taxas / min (idealmente entre 300 e 350).
4. Antes do passo 8.9, disseque suavemente a aorta do rato, coloque uma sonda de fluxo ao seu redor para medir a saída cardíaca. O uso da sonda de fluxo aórtico é o procedimento padrão-ouro para ratos.
5. Para a avaliação hemodinâmica, cannulate a veia jugular ou femoral para administração de fluidos (32 mL/kg/h).
6. Substitua o cateter de volume de pressão SPR-1035 pelo SPR-847 ou SPR-838, cujos tamanhos se adequam melhor às dimensões ventriculares do rato.

Resultados

Sobrevivência pós-operatória e tardia
A sobrevida perioperatória do procedimento de banda é de 80% e a mortalidade durante o primeiro mês é tipicamente <20%. Como mencionado anteriormente, o sucesso da cirurgia de desbandada depende de quão invasiva foi a cirurgia anterior. Após uma curva de aprendizado, a taxa de mortalidade durante os procedimentos de debandada é de cerca de 25%. Para esta mortalidade, a maioria dos óbitos durante o procedimento cirúrgico, incluindo a ruptura da aorta ou...

Discussão

O modelo aqui proposto imita o processo de remodelação de LV e RR após banda aórtica e debandada, respectivamente. Portanto, representa um excelente modelo experimental para avançar nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na remodelação adversa da LV e testar novas estratégias terapêuticas capazes de induzir a recuperação miocárdia desses pacientes. Este protocolo detalha passos sobre como criar um modelo animal roedor de banda aórtica e debandada com uma técnica cirúrgica minimamente...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorption Spears	F.S.T	18105-03	To absorb fluids during the surgery
Blades	F.S.T	10011-00	To perform the skin incision
Buprenorphine	Buprelieve		Analgesia drug
Catutery	F.S.T	18010-00	To prevent exsanguination
Catutery tips	F.S.T	18010-01	To prevent exsanguination
cotton swab	Johnson's		To absorb fluids during the surgery
Depilatory cream	Veet		To delipate the animal
Disposable operating room table cover	MEDKINE	DYND4030SB	To cover the surgical area
Echo probe	Siemens	Sequoia 15L8W	Ultrasound signal aquisition
Echocardiograph	Siemens	Acuson Sequoia C512	Ultrasound signal aquisition
End-tidal CO2 monitor	Kent Scientific	CapnoStat	To control expiration gas saturation
Forcep/Tweezers	F.S.T	11255-20	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11272-30	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11151-10	To dissect the tissues and aorta
Forcep/Tweezers	F.S.T	11152-10	To dissect the tissues and aorta
Gas system	Penlon Sigma Delta		To anesthesia and mechanical ventilation
Hemostats	F.S.T	13010-12	To hold the suture before tight the aorta
Hemostats	F.S.T	13011-12	To hold the suture before tight the aorta
Ligation aids	F.S.T	18062-12	To place a suture around the aorta
Magnetic retractor	F.S.T	18200-20	To help keep the animal in a proper position
Needle holder	F.S.T	12503-15	To suture the animal
Needle 26G	B-BRAUN	4665457	To serve as a molde of aortic constriction diameter
Oxygen	Air Liquide		To anesthesia and mechanical ventilation
Polipropilene suture	Vycril	W8304/W8597	To suture the animal and to do the constriction
Povidone-iodine solution	Betadine®		Skin antiseptic
PowerLab	Millar instruments	ML880 PowerLab 16/30	PV loop Signal Aquisition
Pulse oximeter	Kent Scientific	MouseStat	To control heart rate and blood saturation
PVAN software	Millar Instruments		To analyse the haemodynamic data
PV loop cathether	Millar instruments	SPR-1035. 1.4 F	PV loop Signal Aquisition
Retractor	F.S.T	17000-01	To provide a better overview of the aorta
Scalpet handle	F.S.T	10003-12	To perform the skin incision
Scissors	F.S.T	15070-08	To cut the suture in debanding surgery
Scissors	F.S.T	14084-09	To cut other material during the surgery e.g. suture, papper
Sevoflurane	Baxter	533-CA2L9117
Temperature control module	Kent Scientific	RightTemp	To control animal corporal temperature
Ventilator	Kent Scientific	PhysioSuite	To ventilate the animal
Water-bath	Thermo Scientific™	TSGP02	To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers