小鼠乳腺皮下HC11和EpH4细胞的分化

摘要

我们描述了两个乳房上皮线HC11和EpH4的分化诱导技术。虽然两者都需要胎儿小牛血清、胰岛素和乳素来产生牛奶蛋白，但EpH4细胞可以在三维培养中完全分化成乳腺球。这些互补模型对于分化和肿瘤的信号转导研究非常有用。

摘要

卡塞林在细胞分化和肿瘤的调节中起着重要的作用。在这里，我们描述了两个小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的诱导诱导的起源和方法，以及它们用于研究乳腺发育和肿瘤转化的互补阶段。

HC11小鼠乳腺上皮细胞系源自怀孕的Balb/c小鼠的乳腺。当生长到附着在含有胎儿小牛血清和Hydrocortisone、I nsulin和Prolactin（HIP介质）的介质中附着在塑料培养皿表面时，它与众不同。 在这些条件下，HC11细胞产生乳蛋白β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP），类似于哺乳期乳腺上皮细胞，并形成称为"圆顶"的基本乳腺状结构。

EpH4细胞系来自从怀孕的Balb/c小鼠分离出来的自发不朽的小鼠乳腺上皮细胞。与HC11不同，EPH4细胞在HIP培养基的三维（3D）生长条件下培养时，可以完全分化成球体（也称为乳腺球体）。细胞被试模，悬浮在20%的基质中，由恩格尔布雷斯-霍尔姆-斯沃姆（EHS）小鼠肉瘤细胞产生的细胞外基质蛋白混合物组成，镀在一层浓缩基质层之上，涂有塑料培养皿或多孔板，并覆盖一层含有10%基质的HIP培养基。在这些条件下，EpH4细胞形成中空球体，表现出表基极性、空心流明，并产生β-酪蛋白和WAP。

利用这些技术，我们的结果表明，球红/Rac信号的强度对HC11细胞的分化至关重要。虽然 Rac1 是分化所必需的，低水平的激活 Rac^V12可增加分化，但高 Rac^V12水平会阻碍分化，同时诱发新奇。相反，EpH4细胞代表了乳腺上皮分化的早期阶段，即使低水平的Rac^V12也会抑制这种分化。

引言

在正常组织或肿瘤中，细胞在三维组织中具有大量粘附到邻居的机会，这在培养中被高密度细胞生长所模仿。细胞对细胞粘附主要通过细胞素受体进行介导，后者定义了细胞和组织结构。有趣的是，最近证明，球童在信号转导中也起着强大的作用，特别是在生存信号¹中。矛盾的是，最近发现，分化和新发育^不良2的细胞对细胞粘附信号中，有一些来自细胞对细胞的粘附信号。在这里，我们描述了两种具有代表性的小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的诱导和评估方法。

HC11小鼠乳腺上皮细胞系可为研究上皮细胞分化提供有用的模型。HC11细胞是一种COMMA-1D衍生的细胞系，起源于中孕巴尔布/c小鼠³的乳腺。与其他COMMA-1D衍生克隆相比，HC11克隆不需要外生添加细胞外基质或与其他细胞类型共增，以便通过乳原激素³体外诱导内源β-酪蛋白基因。这种细胞系在分化研究中被广泛使用，因为它保留了正常乳腺上皮的重要特征:HC11细胞可以在清除的乳腺脂肪垫⁴中部分重组导管上皮。此外，他们可以区分在二维（2D）培养，当成长为汇合附附在塑料培养皿表面，在类固醇的存在，如Hydrocortisone或德塞马塞松，除了Insulin和Prolactin（HIP介质）缺乏表皮生长因子（EGF），分化^5，6，7的抑制剂。在这些条件下，HC11细胞产生β-酪蛋白和WAP等牛奶蛋白，在诱导后4天内通过西方印迹检测。同时，HC11细胞的一部分以随机方式形成基本乳腺状结构，称为"圆顶"。诱导后4~5天可见Domes，并在第10天逐渐增大，同时增加β-酪蛋白产量⁸。有趣的是，HC11细胞具有突变的p53^9，因此代表一种前塑性状态。因此，HC11 模型非常适合研究同一细胞系统中的异化信号网络与肿瘤。

EpH4细胞是IM-2细胞的衍生物，是一种非肿瘤细胞系，最初来自自发的细胞乳腺上皮细胞，从中孕的Balb/c小鼠¹⁰中分离出来。EpH4细胞在2D培养中形成连续的上皮单层，但不分化成腺状结构^10，11。然而，在由EHS小鼠肉瘤细胞^12（EHS基质、基质或Matrigel，见材料表）产生的细胞外基质蛋白混合物组成的材料中，经过3D生长后，EpH4细胞还可以重述乳腺分化的初始阶段。在这些条件下，EpH4细胞形成球体（也称为乳腺球体），表现出表基极性和空心流明，能够产生乳蛋白β-酪蛋白和WAP，类似于哺乳期乳腺上皮细胞。与HC11细胞相反，它们未分化，有些表达间质标记13，EpH4细胞表现出纯发光形态^14。EpH4细胞也报告通过用地塞米松、胰岛素和泌乳素¹⁵的刺激在二维培养中产生牛奶蛋白。然而，这种方法排除了对模仿3D培养中乳腺微环境的调节效应的研究。

研究方案

1. 电镀 HC11 电池

1. 在使用无菌技术的层流罩中，制备一个装有50 mL HC11细胞培养基的瓶子:RPMI-1640，带10%胎儿牛血清（FBS）、5微克/mL胰岛素和10纳克/mL EGF（见材料表）。
2. 每3厘米培养皿约400，000个细胞:通过两个10厘米，50%的康料培养皿进入203厘米的菜肴在HC11中等。细胞必须很好地分散，但必须避免干燥。
   1. 使用真空泵将介质吸入烧瓶。
   2. 每10厘米板加入250μL的胰蛋白酶（见材料表）。旋转并从侧面击中板，同时保持其水平，以传播胰蛋白酶和驱逐附加的细胞
   3. 使用 4 倍物镜观察相下对比显微镜，以确保细胞在移液前已开始从边缘分离。
   4. 在无菌的9英寸巴斯德移液器中吸气约1.5 mL的HC11介质，并垂直喷向细胞。旋转培养皿，同时喷出以清除所有细胞。你必须快速工作，以避免细胞干燥。
   5. 使用 HC11 介质和涡流将所有细胞转移到瓶子上。
   6. 移液器 2 mL 的细胞悬浮液在每个 3 厘米培养皿。将培养皿横向摇动，均匀分布。将细胞放入37°C，5%CO2培养箱。
3. 第二天，或当细胞是+90~100%汇入，吸气培养基，并替换为介质与FBS和胰岛素，但缺乏EGF。

2. HC11细胞的分化诱导、监测和定量

1. 在缺乏EGF的介质中生长24小时后，将分化介质（HIP介质）加入至10个3厘米板:RPMI-1640，辅以10%FBS、1μg/mL Hydrocortisone（见材料表）、5微克/mL Insulin和5μg/mL乳酸（见材料表）长达10天。
2. 保持其他10个3厘米板作为对照:更改为10%FBS和5μg/mL胰岛素缺乏EGF和HIP的介质。
3. 每 2⁄3 天将培养基更改为 HIP 处理的细胞和对照组。仔细移移介质，确保细胞不会分离。
4. 为了监测分化（即"圆顶"的形成），观察相对比显微镜下的细胞（图1A，左侧面板）。如果细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），在荧光显微镜下观察（激励=485/20;发射=530/25;放大倍率240倍;20倍物位）（图1A，右侧面板）。
5. 为了量化分化程度，从一个培养皿中抽取蛋白质，每个培养皿经过HIP处理的细胞和控制，每天一次，共10天，并探查西方的血红蛋白β-酪蛋白（见材料表）（图1B）。
   1. 用1.5毫升冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）将冰上细胞刮入1.8ml塑料离心管中。
   2. 在350 x g，1分钟，4°C下粒细胞。
   3. 用冰冷的PBS快速清洗颗粒2倍。排空所有残留物。
   4. 制作一个莱沙缓冲液:50 mM HEPES （pH = 7.4），150 mM NaCl， 10 mM EDTA， 10 mM Na₄P₂O_7，1% NP-40， 100 mM NaF， 2 mM Na₃VO₄， 0.5m 苯基甲基硫酸盐 （PMSF）， 10 μg/mL 丙氨酸， 10 μg/mL 白蛋白¹⁶.每3厘米培养皿加入100 μL。
   5. 在寒冷中，在10，000 x g处通过离心来澄清分麦10分钟。
   6. 确定蛋白质浓度（见材料表），并将每个样品中的10-20μg蛋白质加载到10%的聚丙烯酰胺-SDS凝胶中。
   7. 电噬液在 45 V 时为 15 小时，在 100 V 时为 ±2~2.5 小时。
   8. 使用电镀转移装置转移到硝基纤维素或PVDF膜上（见材料表）。
   9. 在Tris缓冲盐水中含有5%牛血清白蛋白（BSA）的块状，含有0.1%补间-20（TBST）。
   10. 加入原抗体，山羊抗β-酪蛋白稀释1:2，000或小鼠抗β蛋白稀释1:1，000（见材料表）。
   11. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
   12. 加入二级抗体，马萝卜过氧化物酶（HRP）链接驴抗山羊稀释1:2，500，或HRP链接马抗鼠抗体稀释1:10，000。
   13. 用TBST洗涤3次，每次5分钟。
   14. 根据制造商的说明将 ECL 试剂添加到膜中（参见材料表）。

3. EHS矩阵中EpH4细胞的电镀和3D生长

注: 基质在温度 <10 °C 时为液体，在高于温度时为固体。储存在-80°C。使用前一天晚上在4°C下解冻。在操作前，在 -20°C 处将组织培养板和移液器吸头预冷，并将基质、板和移液器吸头保持在冰上，以防止其凝固。

1. 在 RPMI-1640 培养基中2D细胞中生长EpH4细胞，使用10%FBS和5μg/mL胰岛素（不需要EGF）。
2. 在两个 50 mL 锥形管中制备 EpH4 生长介质，辅以 10%（v/v、3，500 μL）或 20%（v/v 2，000 μL）基质。保持冰上，直到准备使用。
3. 用 150 μL 未稀释的基质在 24 孔板上涂上 10 口孔（每口 1 厘米^2）。使用移液器尖端铺开矩阵。避免产生气泡。轻轻敲击板的两侧，同时水平握住，以确保基质均匀地分布在井底。
4. 在 37°C 孵育 24 孔板 1 小时，使基质凝固。
5. 按上述所述对HC11细胞进行胰蛋白化，用血细胞计计数。将每孔5 x 10⁴个细胞转移到1.5 mL无菌锥形离心管中，以250 x g旋转5分钟。
6. 小心地吸进介质，并将管子放在冰上。
7. 在 EpH4 生长培养基的 350 μL 中重新悬浮细胞，使用 1 mL 移液器尖端辅以 20% 基质，同时保持锥形管在冰上。避免气泡。确保单个细胞悬浮液非常重要。
8. 一旦底层基质凝固（与油井的初始涂层相比，基质应呈半透明和较浅的颜色），将350μL的细胞悬浮液添加到每个涂布孔中，并在37°C的_CO2培养箱中放置±1小时，使20%的基质层凝固。
   1. 用4倍物镜在相对比下微观观察细胞。单个单元格应可见。
9. 在悬浮在20%基质中的350μL细胞顶部加入含有10%基质的EpH4培养基的200μL。在37°C孵育。

4. 3D生长的EpH4细胞的分化诱导（图2）

注:除了分化，EpH4细胞在3D培养中受HGF（肝细胞生长因子）刺激时，还可以进行输卵管生成。在10天的HIP和HGF刺激后，可以看到管状生长。

1. 在基质电镀1天后开始分化诱导EpH4细胞。使用塑料移液器尖端小心地从井中取出含有 10% 基质的 150 μL 顶部介质。加入含有HIP和10%基质的EPH4介质200μL。
2. 每 2 天更换 10% 矩阵-HIP 介质，最多 10 天。在没有 HIP 的情况下，在同一 10% 矩阵培养基中生长控制细胞。
3. 监测相对比度下的乳腺圈形成（图3A，下面板）。

5. 在3D中生长的EpH4细胞的结管诱导（图3A和3C）

1. 准备24个孔板和EpH4细胞，用于基质生长，步骤3.1~3.9中详细。在基质中电镀细胞的第二天，使用塑料移液器尖端从井中取出含有10%基质的EpH4介质的150μL。添加含有 10% 基质、HIP 和 20 纳克/mL HGF 的 EpH4 介质 200 μL（参见材料表）。
2. 每 2 天更换 10% 矩阵/HIP/HGF 介质，最多 12-14 天。
3. 使用20x或40x物镜（图3A，右侧面板）微观监测小管的形成。

6. 差别化的量化:β-酪蛋白的西方印迹

1. 小心地从井中移掉 10% 的矩阵-HIP 介质。用 350 μL 的冷型 PBS 冲洗 20% 矩阵层 2x。球体应仍存在于矩阵层中。
2. 将700~1，000 μL的冰冷的PBS与1mM乙烯二甲酸（EDTA）直接加入井中。用移液器尖端轻轻地从井中分离出 100% 基质的底层，以恢复该层中的球形。在 4°C 下轻轻摇动 30 分钟。
3. 小心地将球形悬浮液转移到锥形管中。用 +500 μL 的 PBS-EDTA 冲洗孔，以回收井中剩余的球形，并添加到锥形管中。
4. 在冰上再摇滚30分钟，确保基质已经完全溶解。如果看到可见的矩阵块，则添加更多 PBS-EDTA 或摇动更长时间。
5. 将溶液离心，以350 x g颗粒球体5分钟。
6. 吸气上清液，在冰冷的裂变缓冲液中裂变球体，并探针β-酪蛋白，环素D1，p120RasGAP由西方印迹，如步骤2.5以上^16。作为原抗体，使用山羊抗β-酪蛋白稀释1:2，000，兔抗环素D1稀释1:2，000，小鼠抗p120稀释1:2，000。对于二次抗体，使用HRP链接驴抗山羊稀释1:2，500，HRP链接驴抗兔稀释1:2，500，和HRP链接马抗鼠稀释1:10，000。

结果

人们早就知道，上皮细胞和脂肪细胞的分化需要汇合和结合的球形细胞^2。我们和其他人证明，细胞对细胞粘附和参与的E-或N-卡塞林和卡塞林-11， 与培养细胞的汇合一样，触发小GTPases Rac和细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）的活性急剧增加，这一过程导致白细胞介素+6（IL6）家族细胞因子和Stat3（信号传感器和转录激活器）1，18，19的激活。

讨论

HC11细胞非常适合与肿瘤转化一起进行分化研究。一个额外的优点是HC11细胞很容易感染基于Mo-MLV的抗逆转录病毒载体来表达各种基因。在我们手中，EpH4细胞比HC11²更难感染相同的逆转录病毒载体。

细胞与细胞接触和生长抑制是HC11细胞分化的关键先决条件。因此，要在细胞层之间实现均匀的分化，在播种时实现培养皿中细胞的统一分布非常重要。如果需要区?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution	Bio Rad	1610154	Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody	rabbit, Santa Cruz	sc-717	Western Blotting
Anti-p120 antibody	mouse, Santa Cruz	sc-373751	Western Blotting
Anti-β actin antibody	mouse, Cell Signalling technology	3700	Western Blotting
Anti-β casein antibody	goat, Santa Cruz Biotechnology	sc-17971	Western Blotting
Aprotinin	Bio Shop	APR600	Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution	Sigma	B9643-1L-KC	Protein Determination
Bovine serum albumin	Bio Shop	ALB007.500	Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate	Bio Rad	170-5061	Western Blotting
Copper(II) sulphate	Sigma	C2284-25ML	Protein Determination
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306	Staining
Digitonin	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	14952-500	Staining
EDTA	Bio Shop	EDT001.500
Epidermal Growth Factor	Sigma	E9644	Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum	PAA	A15-751	Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP	Santa Cruz	SC-2004	Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant	Gibco	PHG0321
Hepes	Sigma	7365-45-9	Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP	Cell Signalling Technology	7076	Western Blotting
Hydrocortisone	Sigma	H0888	HIP Medium
insulin	Sigma	I6634	HIP Medium
Laminar-flow hood	BioGard Hood		Cell Culture
Leupeptin	Bio Shop	LEU001.10	Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)	Corning	CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP	Santa Cruz	sc-8360	Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	475904-100GM	Staining
Multi-photon confocal microscope	Leica TCS SP2
Na3VO4	Bio Shop	SOV850	Lysis Buffer
Na4P207	Sigma	125F-0262	Lysis Buffer
NaCl	Bio Shop	SOD001.1	Western Blotting
NaF	Fisher Scientific	7681-49-4	Lysis Buffer
Nikon digital Camera	Coolpix 995
Nitrocellulose	Bio Rad	1620112	Western Blotting
NP-40	Sigma	9016-45-9
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	Staining
Phase Contrast Microscope	Olympus IX70		Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride	Sigma	329-98-6	Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V	Addgene	14567
Prolactin	Sigma	L6520	HIP Medium
RPMI-1640	Sigma	R8758	Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35	Sarstedt	83.3900.	Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well	Sarstedt	83.1836.300	Cell Culture
Transfer Apparatus	CBS Scientific Co	EBU-302	Western Blotting
Tris Acetate	Bio Shop	TRA222.500	Western Blotting
Trypsin	Sigma	9002-07-7.	Cell Culture
Tween-20	Bio Shop	TWN510.500	Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System	CBS Scientific Co	MGV-202-33	Western Blotting