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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo tecniche per l'induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.

Abstract

I cadherin svolgano un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare e della neoplasia. Qui descriviamo le origini e i metodi dell'induzione della differenziazione di due linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 ed EpH4, e il loro uso per studiare fasi complementari dello sviluppo della ghiandola mammaria e della trasformazione neoplastica.

La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 ha avuto origine dalla ghiandola mammaria di un topo balb/c incinta. Si differenzia quando viene coltivato alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto Petri di plastica in un mezzo contenente siero di vitello fetale e Hydrocortisone, Insulin e Prolactin (medium HIP). In queste condizioni, le cellule HC11 producono le proteine del latte proteina acida (WAP), simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano, e formano rudimentali strutture simili a ghiandole mammarie definite "cupole".

La linea cellulare EpH4 è stata derivata da cellule epiteliali mammarie topoimmortalizzate spontaneamente isolate da un topo balb/c incinta. A differenza dell'HC11, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in sferoidi (chiamati anche mammosferie) quando coltivate in condizioni di crescita tridimensionali (3D) nel mezzo HIP. Le cellule sono ortopsinizzate, sospese in una matrice del 20% costituita da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte da cellule di sarcoma tono Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), placcate sopra uno strato di matrice concentrata che riveste una piastra Petri di plastica o piastra multiwell, e coperte da uno strato di mezzo HIP composto da matrice del 10%. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi cavi che presentano polarità apicale-basale, un lume cavo, e producono la caseina e la WAP.

Utilizzando queste tecniche, i nostri risultati hanno dimostrato che l'intensità del segnale cadherin/Rac è fondamentale per la differenziazione delle cellule HC11. Mentre Rac1 è necessario per la differenziazione e bassi livelli di Attivato RacV12 aumentare la differenziazione, alti livelli di RacV12 bloccano la differenziazione mentre inducono neoplasia. Al contrario, le cellule EpH4 rappresentano una fase precedente nella differenziazione epiteliale mammaria, che è inibita anche da bassi livelli di RacV12.

Introduzione

Nei tessuti normali o tumori, le cellule hanno ampie opportunità di adesione ai loro vicini in un'organizzazione tridimensionale, e questo è imitato nella coltura dalla crescita cellulare ad alta densità. L'adesione da cellula a cellula è mediata principalmente attraverso i recettori della cadherin, che definiscono l'architettura cellulare e tissutale. È interessante notare che è stato recentemente dimostrato che le cadherine svolgono anche un ruolo potente nella trasduzione del segnale, specialmente nella segnalazione di sopravvivenza1. Paradossalmente, alcuni di questi segnali di adesione da cellula a cellula provenienti da cadherins sono stati recentemente trovati per essere condivisi sia dalla differenziazione che dalla neoplasia2. Qui, descriviamo i metodi di induzione e valutazione della differenziazione in due tipi rappresentativi di linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 e EpH4.

La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 può fornire un modello utile per lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali. Le cellule HC11 sono una linea cellulare derivata da COMMA-1D, proveniente dalla ghiandola mammaria di un topo Balb/c a metà gravidanza3. A differenza di altri cloni derivati COMMA-1D, il clone hC11 non ha alcun requisito per la matrice extracellulare aggiunta esogenao o la cocoltivazione con altri tipi di cellule per l'induzione in vitro del gene endogeno della caseina endogena dagli ormoni lattogenici3 . Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata negli studi di differenziazione perché ha mantenuto importanti caratteristiche del normale epitelio mammario: le cellule HC11 possono parzialmente ricostituire l'epitelio duttale in un cuscinetto di grasso mammario eliminato4. Inoltre, possono differenziarsi in una coltura bidimensionale (2D) quando coltivati alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto di Petri di plastica in presenza di uno steroide come Hydrocortisone o Dexamethasone, oltre a Insulin e Prolactin (media HIP) privo di fattore di crescita epidermica (EGF), un inibitore della differenziazione5,6,7. In queste condizioni, le cellule HC11 producono proteine del latte come la caseina e la WAP, che sono rilevabili dalla gonfiore occidentale entro 4 giorni dall'induzione. Allo stesso tempo, una porzione di cellule HC11 forma strutture rudimentali simili alla ghiandola mammaria definite "cupole" in modo stocastico. Le cupole sono visibili 4-5 giorni dopo l'induzione e aumentano gradualmente di dimensioni fino al giorno 10, concomitanti con un aumento della produzione di banofaz 8. È interessante notare che le cellule HC11 possiedono p539mutanti e quindi rappresentano uno stato preneoplastico. Per questo motivo, il modello HC11 è ideale per studiare le reti di segnalazione di differenziazione in combinazione con la neoplasia nello stesso sistema cellulare.

Le cellule EpH4, un derivato delle cellule IM-2, sono una linea cellulare non tumorale originariamente derivata da cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo immortalate spontaneamente isolate da un topo balb/c medio-gravidanza10. Le cellule EpH4 formano monostrati epiteliali continui in coltura 2D, ma non si differenziano in strutture simili alla ghiandaia10,11. Tuttavia, a seguito della crescita 3D in un materiale costituito da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte dalle cellule sarcoma del topo EHS12 (matrice EHS, matrice o Matrigel, vedi Tabella dei materiali), oltre alla stimolazione con HIP, le cellule EpH4 possono ricapitolare le fasi iniziali della differenziazione della ghiandola mammaria. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi (chiamati anche mammosferie) che presentano polarità apicale-basale e un lume cavo, e sono in grado di produrre le proteine del latte, la caseina e la WAP, simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano. Contrariamente alle cellule HC11, che sono indifferenziate, e alcuni esprimono marcatori mesenchymal13, cellule EpH4 mostrano una morfologia puramente luminale14. Cellule EpH4 sono stati segnalati anche per produrre proteine del latte nella coltura 2D attraverso la stimolazione con dexamethasone, insulina, e prolattina15. Tuttavia, questo approccio preclude lo studio degli effetti normativi che imitano il microambiente della ghiandola mammaria nella coltura 3D.

Protocollo

1. Placcatura delle cellule HC11

  1. In una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche sterili preparare una bottiglia con 50 mL di HC11 mezzo cellulare: RPMI-1640 con 10% siero bovino fetale (FBS), 5 insulina g/mL, e 10 ng/mL EGF (vedi Tabella dei materiali).
  2. Piatto di circa 400.000 cellule per piatto Petri da 3 cm: Passare due piatti Petri 10 cm, 50% confluenti in venti piatti 3 cm in mezzo HC11. Le cellule devono essere ben distribuite, ma l'essiccazione deve essere evitata.
    1. Aspirare il mezzo in un pallone utilizzando una pompa a vuoto.
    2. Aggiungete 250 di cfrina (vedi Tabella dei materiali)per piastra da 10 cm. Swirl e colpire la piastra dai lati mantenendolo orizzontale per diffondere la trypsin e per spostare le celle collegate
    3. Osservare la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4x per assicurarsi che le cellule abbiano iniziato a staccarsi dai bordi prima del pipettaggio.
    4. Aspirata circa 1,5 mL di HC11 medio in uno sterile, 9 pollici Pasteur pipetta e schizzare verticalmente contro le cellule. Ruotare il piatto Petri mentre si schizza per spostare tutte le cellule. È necessario lavorare velocemente per evitare l'essiccazione delle cellule.
    5. Trasferire tutte le celle alla bottiglia con il mezzo HC11 e il vortice.
    6. Pipette 2 mL di sospensione cellulare in ogni piatto Petri di 3 cm. Rock i piatti Petri trasversalmente per diffondersi in modo uniforme. Collocare le cellule in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi.
  3. Il giorno successivo, o quando le cellule sono confluenti del 90-100%, aspirano il mezzo e sostituirlo con mezzo con FBS e insulina ma manca di EGF.

2. Induzione della differenziazione, monitoraggio e quantitazione delle cellule HC11

  1. Dopo aver fatto crescere le cellule in media privo EGF per 24 h, aggiungere il mezzo di differenziazione (medium HIP) a dieci piastre da 3 cm: RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1 g/mL Hydrocortisone (vedi Tabella dei materiali),5 g/mL Insulin e 5 g/mL Prolactin (vedi Tabella dei Materiali) per un massimo di 10 giorni.
  2. Mantenere le altre dieci piastre da 3 cm come controlli: passare a un mezzo con 10% FBS e 5 insulina sg/mL privo di EGF e HIP.
  3. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni in sia cellule trattate con HIP che con controlli. Pipette il mezzo con attenzione per assicurarsi che le cellule non si stacchino.
  4. Per monitorare la differenziazione (cioè la formazione di "cupole"), osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase (Figura 1A, pannello sinistro). Se le cellule esprimono proteine a fluorescenza verde (GFP), osservate sotto microscopia a fluorescenza (eccitazione - 485/20; emissione - 530/25; ingrandimento 240x; obiettivo 20x) (Figura 1A, pannello destro).
  5. Per quantificare il grado di differenziazione, estrarre le proteine da un piatto Petri ciascuna delle cellule e dei controlli trattati con HIP, una volta al giorno per un totale di 10 giorni e sondare le macchie occidentali per la caseina (vedi Tabella dei materiali)(Figura 1B).
    1. Raschiare le cellule sul ghiaccio con una salina con buffer di fosfato a freddo ghiaccio da 1,5 ml in un tubo di centrifuga in plastica da 1,8 ml.
    2. Pellele cellule a 350 x g, 1 min, 4 gradi centigradi.
    3. Lavare rapidamente il pellet 2x con PBS ghiacciato. Scolare i residui.
    4. Creare un buffer di lisi: 50 mHE HEPES (pH - 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 g/mL di aprotinina, 10 g/mL leupeptina16. Aggiungere 100 l per 3 cm di piatto Petri.
    5. Chiarire il lisato dalla centrifugazione a 10.000 x g per 10 min al freddo.
    6. Determinare la concentrazione di proteine (vedi Tabella dei materiali)e caricare da 10 a 20 g di proteine da ciascun campione su un gel poliacrilamitilminismo-SDS del 10%.
    7. Elettroforo per 15 h a 45 V, o a 100 V per 2–2,5 h.
    8. Trasferire su una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un apparato di trasferimento elettroblotting (vedere Tabella dei materiali).
    9. Blocco con 5% di albumina di siero bovino (BSA) in salina con 0,1% Tween-20 (TBST).
    10. Aggiungere l'anticorpo primario, capra anti-caseina diluita 1:2,000 o topo anti-atto diluito 1:1,000 (vedi Tabella dei materiali).
    11. Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.
    12. Aggiungere l'anticorpo secondario, il rafano perossidasi (HRP) legato asino anti-capra diluito 1:2.500, o HRP collegato cavallo anti-tono anticorpo diluito 1:10,000.
    13. Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.
    14. Aggiungere reagenti ECL alla membrana secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).

3. Placcatura e crescita 3D delle cellule EpH4 nella matrice EHS

NOTA: La matrice è liquida a temperature <10 gradi centigradi e solida a temperature superiori. Conservare a -80 gradi centigradi. Scongelare a 4 gradi centigradi la sera prima dell'uso. Pre-raffreddare le piastre di coltura dei tessuti e punte di pipetta a -20 gradi centigradi prima di maneggiare e mantenere la matrice, le piastre e le punte di pipetta sul ghiaccio per evitare che si solidifica.

  1. Crescere le cellule EpH4 in 2D nel mezzo RPMI-1640 con 10% FBS e 5 insulina g/mL (l'EGF non è richiesto).
  2. Preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con una matrice del 10% (v/v, 3.500 ) o del 20% (v/v 2.000 ) in due tubi conici da 50 ml. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.
  3. Cappotto 10 pozze (1 cm2 ciascuno) di un pozzo 24 con 150 l di matrice non diluita. Stendere la matrice utilizzando una punta pipetta. Evitare di creare bolle. Toccare delicatamente i lati della piastra tenendola orizzontalmente per assicurarsi che la matrice sia distribuita uniformemente sul fondo del pozzo.
  4. Incubare la piastra 24 pozza a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice di solidificarsi.
  5. Provaa le cellule EpH4 come descritto sopra per le cellule HC11 e contale con un emocitometro. Trasferire 5 x 104 cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conica sterile da 1,5 mL e girare a 250 x g per 5 min.
  6. Aspirare con attenzione il mezzo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
  7. Risospendere le cellule in 350 -L di EpH4 growth medium integrata con una matrice del 20% utilizzando una punta di pipetta da 1 mL, mantenendo il tubo conico sul ghiaccio. Evitare le bolle. È importante garantire una sospensione a cella singola.
  8. Una volta che la matrice dello strato inferiore si è solidificata (la matrice dovrebbe apparire di colore traslucido e più chiaro rispetto al rivestimento iniziale dei pozze), aggiungere la 350 l di sospensione cellulare ad ogni pozzo rivestito e posizionare in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice del 20% di solidificarsi.
    1. Osservare le cellule microscopicamente in fase contrasto con un obiettivo 4x. Le celle singole devono essere visibili.
  9. Aggiungere 200 L di epH4 di supporto contenente 10% matrice sopra il 350 - L di celle sospese in 20% matrice. Incubare a 37 gradi centigradi.

4. Induzione differenziazione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 2)

NOTA: Oltre alla differenziazione, le cellule EpH4 possono anche subire tubulogenesi quando stimolate con HGF (fattore di crescita epatocite) nella coltura 3D. Le escrescenze tubolari possono essere viste dopo 10 giorni di stimolazione HIP e HGF.

  1. Iniziare l'induzione della differenziazione delle cellule EpH4 1 giorno dopo la placcatura nella matrice. Rimuovere con cura 150 -L di mezzo superiore contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di epH4 media contenente HIP e 10% di matrice.
  2. Sostituire il mezzo 10% matrix-HIP ogni 2 giorni per un massimo di 10 giorni. Crescere le celle di controllo nello stesso mezzo a matrice 10% senza HIP.
  3. Monitorare la formazione della mammosfera in contrasto di fase (Figura 3A,pannello inferiore).

5. Tubulogenesi Induzione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 3A e 3C)

  1. Preparare 24 lastre e celle EpH4 per la crescita in matrix, come descritto nei passaggi da 3.1 a 3,9. Il giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice, rimuovere 150 L di epH4 medio contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di supporto EpH4 contenente 10% matrice, HIP e 20 ng/mL HGF (vedere Tabella dei materiali).
  2. Sostituire il supporto 10% matrix/HIP/HGF ogni 2 giorni per un massimo di 12-14 giorni.
  3. Monitorare la formazione di tubuli al microscopio utilizzando un obiettivo 20x o 40x(Figura 3A, pannello destro).

6. Quantitazione della differenziazione: Blotting occidentale per la caseina z

  1. Con attenzione pipetta fuori il 10% matrice-HIP mezzo dai pozzi. Risciacquare lo strato di 20% a matrice 2x con 350 gradi di PBS ghiacciato. Gli sferoidi dovrebbero essere ancora presenti nel livello della matrice.
  2. Aggiungere 700-1.000 gradi di PBS ghiacciato con 1 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) direttamente nei pozzi. Staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice 100% dal pozzo con una punta di pipette per recuperare gli sferoidi presenti in quel livello. Agitare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
  3. Trasferire con attenzione la sospensione sferoide in un tubo conico. Sciacquare i pozzetti con 500 dollari loff di PBS-EDTA per recuperare gli sferoidi rimanenti nei pozzetti e aggiungerli al tubo conico.
  4. Roccia sul ghiaccio per altri 30 min. Assicurarsi che la matrice si sia completamente dissolta. Se si osservano grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS-EDTA o scuotere più a lungo.
  5. Centrifugare la soluzione per pellet gli sferoidi a 350 x g per 5 min.
  6. Aspirati il superatante, lividi gli sferoidi nel tampone di lisi ghiacciato e sondano per la caseina, la ciclica D1 e la p120RasGAP dal gonfiore occidentale come nel punto 2,5 sopra16. Come anticorpi primari, utilizzare capra anti-s-casein diluito 1:2,000, coniglio anti-ciclone D1 diluito 1:2,000, e topo anti-p120 diluito 1:2,000. Per gli anticorpi secondari, utilizzare HRP collegato anti-capra anti-capra diluito 1:2,500, HRP collegato asino anti-coniglio diluito 1:2,500, e HRP collegato cavallo anti-topo diluito 1:10,000.

Risultati

È noto da tempo che la differenziazione delle cellule epiteliali e degli adipociti richiede confluenza e impegno di cadherins2. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'adesione cellulare-cellulare e l'impegno di E- o N-cadherin e cadherin-11, come avviene con la confluenza di cellule coltivate, innesca un drammatico aumento dell'attività del piccolo GTPases Rac e della divisione cellulare controlla la proteina di controllo 42 (Cdc42), e questo processo porta all'attivazione di interleuchina-6 (IL6)...

Discussione

Le cellule HC11 sono ideali per lo studio della differenziazione in combinazione con la trasformazione neoplastica. Un ulteriore vantaggio è che le cellule HC11 sono facilmente infettivabili con vettori retrovirali basati su Mo-MLV per esprimere una varietà di geni. Nelle nostre mani, le cellule EpH4 erano più difficili da infettare con gli stessi vettori retrovirali di HC112.

Il contatto tra celle e l'arresto della crescita sono i prerequisiti fondamentali per la di...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti da divulgare.

Riconoscimenti

La linea cellulare HC11 è stata gentilmente fornita dal Dr. D. Medina (Houston, TX). Gli autori sono grati al Dr. Andrew Craig della Queen's University per molti reagenti e preziosi suggerimenti. Le cellule EpH4 sono state un dono del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ha fornito un'eccellente assistenza tecnica per gli studi di cultura 3D.

L'assistenza finanziaria del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), dei Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), della Canadian Breast Cancer Research Alliance , i Centri di Eccellenza dell'Ontario, il Breast Cancer Action Kingston (BCAK) e il fondo di lascile Clare Nelson attraverso sovvenzioni a LR sono riconosciuti con gratitudine. BE ha ricevuto il sostegno da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. PTG è supportato da un presidente di ricerca canadese, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN è stato supportato da una nave da uno studente del Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research di NCIC, un Graduate Award (QGA) e un Dean's Award della Queen's University. MG è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato del Programma per il cancro al seno dell'esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell'Innovazione della Provincia dell'Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen's University. VH è stata sostenuta da una borsa di dottorato CBCF e da una borsa di studio post-dottorato del Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in collaborazione con CIHR. Hanad Adan è stato il destinatario di uno studio estivo NSERC. LA BS è stata sostenuta da un premio di laurea della Queen's University.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/0.8% Bis SolutionBio Rad1610154Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibodyrabbit, Santa Cruzsc-717Western Blotting
Anti-p120 antibodymouse, Santa Cruzsc-373751Western Blotting
Anti-β actin antibodymouse, Cell Signalling technology3700Western Blotting
Anti-β casein antibodygoat, Santa Cruz Biotechnologysc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid SolutionSigmaB9643-1L-KCProtein Determination
Bovine serum albuminBio ShopALB007.500Protein Determination
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad170-5061Western Blotting
Copper(II) sulphateSigmaC2284-25MLProtein Determination
DAPIThermofisher ScientificD1306Staining
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500Staining
EDTABio ShopEDT001.500
Epidermal Growth FactorSigmaE9644Medium for HC11 Cells
Fetal calf serumPAAA15-751Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRPSanta CruzSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinantGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRPCell Signalling Technology7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP Medium
insulinSigmaI6634HIP Medium
Laminar-flow hoodBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)CorningCACB 354230
Mouse Anti-Goat HRPSanta Cruzsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ReagentCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMStaining
Multi-photon confocal microscopeLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850Lysis Buffer
Na4P207Sigma125F-0262Lysis Buffer
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4Lysis Buffer
Nikon digital CameraCoolpix 995
NitrocelluloseBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4Staining
Phase Contrast MicroscopeOlympus IX70Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluorideSigma329-98-6Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlactinSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35Sarstedt83.3900.Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 wellSarstedt83.1836.300Cell Culture
Transfer ApparatusCBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.Cell Culture
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting

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