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  • Resumen
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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Resumen

Las cadherinas desempeñan un papel importante en la regulación de la diferenciación celular, así como la neoplasia. Aquí describimos los orígenes y métodos de la inducción de la diferenciación de dos líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4, y su uso para estudiar etapas complementarias del desarrollo de la glándula mamaria y la transformación neoplásica.

La línea celular epitelial de la mama del ratón HC11 se originó a partir de la glándula mamaria de un ratón Balb/c embarazada. Se diferencia cuando se cultiva para confluencia unida a una superficie de plástico de la placa Petri en medio que contiene suero de ternero fetal y Hydrocortisona, Insulin y Prolactin (medio HIP). En estas condiciones, las células HC11 producen las proteínas lácteas-caseína y proteína ácida de suero de leche (WAP), similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes, y forman estructuras rudimentarias similares a las glándulas mamarias llamadas "domes".

La línea celular EpH4 se deriva de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c embarazada. A diferencia de HC11, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en esferoides (también llamadas mamesferas) cuando se cultivan en condiciones de crecimiento tridimensionales (3D) en medio HIP. Las células son trippsinizadas, suspendidas en una matriz del 20% que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), chapadas encima de una capa de matriz concentrada que recubre una placa de plástico Petri o placa multipocilíndor, y se cubren con una capa de 10% de medio HIP que contiene matriz. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides huecos que exhiben polaridad apical-basal, un lumen hueco, y producen la caseína y el WAP.

Utilizando estas técnicas, nuestros resultados demostraron que la intensidad de la señal de la cadherina/Rac es fundamental para la diferenciación de las células HC11. Mientras que Rac1 es necesario para la diferenciación y bajos niveles de RacV12 activado aumentar la diferenciación, altos niveles de RacV12 bloquean la diferenciación mientras que induce neoplasia. Por el contrario, las células EpH4 representan una etapa anterior en la diferenciación epitelial mamaria, que se inhibe incluso por niveles bajos de RacV12.

Introducción

En los tejidos normales o tumores, las células tienen amplias oportunidades de adhesión a sus vecinos en una organización tridimensional, y esto es imitado en el cultivo por el crecimiento celular de alta densidad. La adhesión de célula a célula se media principalmente a través de receptores de cadherina, que definen la arquitectura celular y tisular. Curiosamente, recientemente se demostró que las cadherinas también desempeñan un papel poderoso en la transducción de señales, especialmente en la señalización de supervivencia1. Paradójicamente, algunas de estas señales de adhesión de célula a célula que emanan de las cadreínas se encontraron recientemente compartidas tanto por diferenciación como por neoplasia2. Aquí, describimos métodos de inducción y evaluación de la diferenciación en dos tipos representativos de líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4.

La línea celular epitelial de la mama de ratón HC11 puede proporcionar un modelo útil para el estudio de la diferenciación de células epiteliales. Las células HC11 son una línea celular derivada de COMMA-1D, que se origina en la glándula mamaria de un ratón Balb/c de embarazo medio3. A diferencia de otros clones derivados de COMMA-1D, el clon HC11 no tiene ningún requisito para añadir exógenamente matriz extracelular o cocultivo con otros tipos de células para la inducción in vitro del gen endógeno de caseína por hormonas lactogénicas3. Esta línea celular se ha utilizado ampliamente en estudios de diferenciación porque ha conservado características importantes del epitelio mamario normal: las células HC11 pueden reconstituir parcialmente el epitelio ductal en una almohadilla de grasa mamaria clara4. Por otra parte, se pueden diferenciar en un cultivo bidimensional (2D) cuando se cultivan a la confluencia unida a una superficie de plástico de plato de Petri en presencia de un esteroide como Hydrocortisona o Dexametasona, además de Insulina y Prolactina (medio HIP) carente de factor de crecimiento epidérmico (EGF), un inhibidor de la diferenciación5,6,7. En estas condiciones, las células HC11 producen proteínas lácteas como la caseína y la WAP, que son detectables por la hincha occidental dentro de los 4 días siguientes a la inducción. Al mismo tiempo, una porción de células HC11 forma estructuras rudimentarias mamarias similares a las glándulas denominadas "domes" de una manera estocástica. Las cúpulas son visibles de 4 a 5 días después de la inducción y aumentan gradualmente de tamaño hasta el día 10, concomitantes con un aumento en la producción de caseína8. Curiosamente, las células HC11 poseen mutante p539, y por lo tanto representan un estado preneoplásico. Por esta razón, el modelo HC11 es ideal para estudiar redes de señalización de diferenciación en conjunto con neoplasia en el mismo sistema celular.

Las células EpH4, un derivado de las células IM-2, son una línea celular no tumorigénica originalmente derivada de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c de embarazo medio10. Las células EpH4 forman monocapas epeliales continuas en el cultivo 2D, pero no se diferencian en estructuras glandulares10,11. Sin embargo, después del crecimiento 3D en un material que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón EHS12 (matriz EHS, matriz o Matrigel, ver Tabla de materiales),además de la estimulación con HIP, las células EpH4 pueden recapitular las etapas iniciales de diferenciación de la glándula mamaria. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides (también llamados mamesferas) que exhiben polaridad apical-basal y un lumen hueco, y son capaces de producir las proteínas lácteas-caseína y WAP, similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes lactantes lactantes. Contrariamente a las células HC11, que son indiferenciadas, y algunas expresan marcadores mesenquimales13, las células EpH4 exhiben una morfología puramente luminal14. Las células EpH4 también se han divulgado para producir proteínas de la leche en el cultivo 2D a través de la estimulación con dexametasona, insulina, y prolactina15. Sin embargo, este enfoque impide el estudio de los efectos reglamentarios que imitan el microambiente de la glándula mamaria en el cultivo 3D.

Protocolo

1. Placado de células HC11

  1. En una campana de flujo laminar utilizando técnicas estériles, prepare un frasco con 50 ml de medio celular HC11: RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), insulina de 5 g/ml y EGF de 10 ng/ml (ver Tabla de materiales).
  2. Placa de aproximadamente 400.000 celdas por plato Petri de 3 cm: Pasar dos platos Petri de 10 cm, 50% confluentes en veinte platos de 3 cm en medio HC11. Las células deben estar bien esparcidas, pero se debe evitar el secado.
    1. Aspirar el medio en un matraz utilizando una bomba de vacío.
    2. Añadir 250 l de tripsina (ver Tabla de Materiales)por placa de 10 cm. Gire y golpee la placa desde los lados mientras la mantiene horizontal para extender la trippsina y desalojar las células unidas
    3. Observar bajo fase de la microscopía de contraste con un objetivo 4x para asegurarse de que las células han comenzado a separarse de los bordes antes de pipetear.
    4. Aspirar aproximadamente 1,5 ml de medio HC11 en una pipeta Pasteur estéril de 9 pulgadas y chorro verticalmente contra las células. Gire la placa Petri mientras se revuelve para desalojar todas las células. Debe trabajar rápido para evitar el secado de las células.
    5. Transfiera todas las células al frasco con el medio HC11 y gire.
    6. Pipeta 2 ml de suspensión celular en cada plato Petri de 3 cm. Mece los platos Petri transversalmente para esparcirse uniformemente. Coloque las células en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
  3. Al día siguiente, o cuando las células son de 90-100% confluentes, aspirar el medio, y reemplazarlo con medio con FBS e insulina pero carente de EGF.

2. Inducción de diferenciación, monitoreo y cuantificación de células HC11

  1. Después de cultivar las células en medio carentes de EGF durante 24 h, añadir el medio de diferenciación (medio HIP) a diez placas de 3 cm: RPMI-1640 suplementada con 10% FBS, 1 g/ml Hydrocortisona (ver Tabla de Materiales),5 g/ml Insulina y 5 g/ml Prolactin (ver Tabla de Materiales)durante un máximo de 10 días.
  2. Mantenga las otras diez placas de 3 cm como controles: Cambie a un medio con un 10% de FBS y 5 g/ml de insulina que falten EGF y HIP.
  3. Cambie el medio cada 2-3 días a células y controles tratados con HIP. Pipetear el medio cuidadosamente para asegurarse de que las células no se separan.
  4. Para monitorear la diferenciación (es decir, la formación de "domes"), observar las células bajo microscopía de contraste de fase(Figura 1A,panel izquierdo). Si las células están expresando proteína de fluorescencia verde (GFP), observe bajo microscopía de fluorescencia (excitación 485/20; emisión a 530/25; aumento 240x; objetivo 20x)(Figura 1A, panel derecho).
  5. Para cuantificar el grado de diferenciación, extraiga las proteínas de una placa Petri cada una de las células y controles tratados con HIP, una vez al día durante un total de 10 días y sondee las manchas occidentales para la caseína (ver Tabla de Materiales)(Figura 1B).
    1. Raspa las células sobre hielo con una solución salina tamponada de fosfato helado de 1,5 ml (PBS) en un tubo centrífugo de plástico de 1,8 ml.
    2. Pellet las células a 350 x g,1 min, 4 oC.
    3. Lave rápidamente el pellet 2x con PBS helado. Escurra cualquier residuo.
    4. Hacer un tampón de lisis: 50 mM HEPES (pH a 7,4), 150 mM De NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 g/ml de aprotina, 10 g/ml de leupeptina16. Añadir 100 l por plato de Petri de 3 cm.
    5. Aclarar el lisado por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos en frío.
    6. Determinar la concentración de proteínas (ver Tabla de Materiales)y cargar de 10 a 20 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%.
    7. Electroforesa durante 15 h a 45 V, o a 100 V durante 2–2,5 h.
    8. Transferencia a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un aparato de transferencia electroblotante (ver Tabla de Materiales).
    9. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución salina con búfer de Tris con 0,1% de Tween-20 (TBST).
    10. Añadir el anticuerpo primario, cabra anti-caseína diluida 1:2,000 o ratón anti-a actina diluida 1:1,000 (ver Tabla de Materiales).
    11. Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.
    12. Añadir el anticuerpo secundario, el rábano picante peroxidasa (HRP) vinculado burro anti-cabra diluido 1:2,500, o HRP vinculado anticuerpo anti-ratón caballo diluido 1:10,000.
    13. Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.
    14. Añadir reactivos ECL a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).

3. Plating y crecimiento 3D de células EpH4 en EHS Matrix

NOTA: La matriz es líquida a temperaturas <10 oC y sólida a temperaturas superiores. Conservar a -80oC. Descongelar a 4oC la noche antes de su uso. Enfríe previamente las placas de cultivo de tejido y las puntas de las pipetas a -20 oC antes de manipular y mantenga las puntas de la matriz, las placas y las pipetas en el hielo para evitar que se solidifique.

  1. Cultivar células EpH4 en 2D en medio RPMI-1640 con 10% de FBS y 5 g/ml de insulina (no se requiere EGF).
  2. Preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con una matriz de 10% (v/v, 3.500 l) o 20% (v/v 2.000 l) en dos tubos cónicos de 50 ml. Mantener en hielo hasta que esté listo para usar.
  3. Recubrir 10 pocillos (1 cm2 cada uno) de una placa de 24 pocillos con 150 ml de matriz sin diluir. Extienda la matriz con una punta de pipeta. Evite crear burbujas. Toque suavemente los lados de la placa mientras la sostiene horizontalmente para asegurarse de que la matriz se distribuye uniformemente a través de la parte inferior del pozo.
  4. Incubar la placa de 24 pocillos a 37oC durante 1 h para permitir que la matriz se solidifique.
  5. Pruebe las células EpH4 como se describió anteriormente para las células HC11 y cuente con un hemocitómetro. Transfiera 5 x 104 células por pozo a un tubo centrífugo cónico estéril de 1,5 ml y gire a 250 x g durante 5 min.
  6. Aspirar cuidadosamente el medio y colocar el tubo sobre hielo.
  7. Resuspenda las células en un medio de crecimiento EpH4 de 350 oL complementado con una matriz del 20% utilizando una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene el tubo cónico sobre hielo. Evite las burbujas. Es importante asegurar una suspensión de una sola célula.
  8. Una vez que la matriz de la capa inferior se haya solidificado (la matriz debe aparecer translúcida y de color más claro en comparación con el recubrimiento inicial de los pozos), agregue los 350 s de suspensión celular a cada pocato recubierto y colóquelo en una incubadora de CO2 a 37 oC para el número 1 h para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.
    1. Observe las células microscópicamente bajo contraste de fase con un objetivo 4x. Las celdas individuales deben ser visibles.
  9. Añadir 200 sl de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% encima de los 350 s de células suspendidas en una matriz del 20%. Incubar a 37oC.

4. Inducción de diferenciación de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 2)

NOTA: Además de la diferenciación, las células EpH4 también pueden someterse a tubulogénesis cuando se estimulan con HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) en el cultivo 3D. Los crecimientos tubulares se pueden ver después de 10 días de estimulación de HIP y HGF.

  1. Comenzar la inducción de diferenciación de las células EpH4 1 día después del enchapado en la matriz. Retire con cuidado 150 s l de medio superior que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 sL de medio EpH4 que contenga HIP y matriz del 10%.
  2. Reemplace el medio de matriz-HIP del 10% cada 2 días durante un máximo de 10 días. Cultivar células de control en el mismo medio de matriz 10% sin HIP.
  3. Supervisar la formación de mamesferas bajo contraste de fase(Figura 3A,panel inferior).

5. Inducción de tubulogénesis de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 3A y 3C)

  1. Prepare 24 placas de pozo y células EpH4 para el crecimiento en matriz como se detalla en los pasos 3.1–3.9. El día después de enchapar las células en la matriz, retire 150 ml de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 l de medio EpH4 que contenga una matriz del 10%, HIP y 20 ng/mL HGF (ver Tabla de Materiales).
  2. Reemplace el medio de matriz/HIP/HGF del 10% cada 2 días durante un máximo de 12-14 días.
  3. Supervise la formación de túbulos microscópicamente utilizando un objetivo de 20x o 40x(Figura 3A,panel derecho).

6. Cantidad de diferenciación: Western Blotting para la caseína

  1. Pipetear cuidadosamente el medio de matriz-HIP del 10% de los pozos. Enjuague la capa de matriz 20% 2x con 350 s de PBS helado. Los esferoides todavía deben estar presentes en la capa de matriz.
  2. Añadir entre 700 y 1.000 ml de PBS helado con ácido etilendiaminetetraacético de 1 mM (EDTA) directamente en los pozos. Separe suavemente la capa inferior de la matriz 100% del pozo con una punta de pipeta para recuperar los esferoides presentes en esa capa. Agitar suavemente durante 30 min a 4oC.
  3. Transfiera cuidadosamente la suspensión esferoide a un tubo cónico. Enjuague los pozos con 500 ol de PBS-EDTA para recuperar los esferoides restantes en los pozos y añadirlos al tubo cónico.
  4. Roca sobre hielo durante 30 minutos adicionales. Asegúrese de que la matriz se haya disuelto por completo. Si se ven grumos de matriz visibles, agregue más PBS-EDTA o agite más tiempo.
  5. Centrifugar la solución para peletizar los esferoides a 350 x g durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante, licre rofher los esferoides en tampón de lisis helada, y sonda para la caseína, la ciclina D1 y p120RasGAP por la hincha occidental como en el paso 2.5 por encima de16. Como anticuerpos primarios, utilizar la cabra anti-caseína diluido 1:2,000, conejo anticiclina D1 diluido 1:2,000, y ratón anti-p120 diluido 1:2,000. Para los anticuerpos secundarios, utilice anti-cabra de burro vinculado a HRP diluido 1:2,500, HRP vinculado burro anticonejo diluido 1:2,500, y HRP vinculado caballo anti-ratón diluido 1:10,000.

Resultados

Durante mucho tiempo se ha sabido que la diferenciación de células epiteliales y adipocitos requiere confluencia y compromiso de las cadherinas2. Nosotros y otros demostramos que la adhesión de célula a célula y el compromiso de E- o N-cadherin y cadherin-11, como ocurre con la confluencia de células cultivadas, desencadena un aumento dramático en la actividad de las pequeñas GTPases Rac y la proteína de control de división celular 42 (Cdc42), y este proceso conduce a la activación de l...

Discusión

Las células HC11 son ideales para el estudio de la diferenciación en combinación con la transformación neoplásica. Una ventaja añadida es que las células HC11 son fácilmente infectables con vectores retrovirales basados en Mo-MLV para expresar una variedad de genes. En nuestras manos, las células EpH4 eran más difíciles de infectar con los mismos vectores retrovirales que HC112.

El contacto entre células y el detención del crecimiento son requisitos previos...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

La línea celular HC11 fue proporcionada amablemente por el Dr. D. Medina (Houston, TX). Los autores están agradecidos al Dr. Andrew Craig de queen's University por muchos reactivos y valiosas sugerencias. Las células EpH4 fueron un regalo del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick proporcionó una excelente asistencia técnica para estudios de cultivo 3D.

La asistencia financiera del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), la Fundación Canadiense contra el Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), la Alianza Canadiense para la Investigación del Cáncer de Mama , se reconocen con gratitud los Centros de Excelencia de Ontario, el Kingston de Acción contra el Cáncer de Mama (BCAK) y el fondo de legado Clare Nelson a través de subvenciones a LR. BE recibió apoyo de CIHR, CBCF, BCAK y Cancer Research Society Inc. PTG cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación, el CIHR, el NSERC y la Sociedad Canadiense del Cáncer. MN fue apoyado por una estudiante del Programa de Entrenamiento Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer de NCIC, un Premio de Posgrado (QGA), y un Premio Dean de la Universidad de Queen. MG fue apoyada por becas postdoctorales del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen. VH contó con el apoyo de una beca de doctorado CBCF y una beca postdoctoral del Programa de Capacitación de la Fundación Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer en asociación con la CIHR. Hanad Adan fue el receptor de una beca de verano NSERC. La licenciatura fue apoyada por un premio de posgrado de la Universidad de la Reina.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/0.8% Bis SolutionBio Rad1610154Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibodyrabbit, Santa Cruzsc-717Western Blotting
Anti-p120 antibodymouse, Santa Cruzsc-373751Western Blotting
Anti-β actin antibodymouse, Cell Signalling technology3700Western Blotting
Anti-β casein antibodygoat, Santa Cruz Biotechnologysc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid SolutionSigmaB9643-1L-KCProtein Determination
Bovine serum albuminBio ShopALB007.500Protein Determination
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad170-5061Western Blotting
Copper(II) sulphateSigmaC2284-25MLProtein Determination
DAPIThermofisher ScientificD1306Staining
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500Staining
EDTABio ShopEDT001.500
Epidermal Growth FactorSigmaE9644Medium for HC11 Cells
Fetal calf serumPAAA15-751Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRPSanta CruzSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinantGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRPCell Signalling Technology7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP Medium
insulinSigmaI6634HIP Medium
Laminar-flow hoodBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)CorningCACB 354230
Mouse Anti-Goat HRPSanta Cruzsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ReagentCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMStaining
Multi-photon confocal microscopeLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850Lysis Buffer
Na4P207Sigma125F-0262Lysis Buffer
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4Lysis Buffer
Nikon digital CameraCoolpix 995
NitrocelluloseBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4Staining
Phase Contrast MicroscopeOlympus IX70Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluorideSigma329-98-6Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlactinSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35Sarstedt83.3900.Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 wellSarstedt83.1836.300Cell Culture
Transfer ApparatusCBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.Cell Culture
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting

Referencias

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).

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