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Neste Artigo

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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Resumo

Cadherins desempenham um papel importante na regulação da diferenciação celular, bem como da neoplasia. Aqui descrevemos as origens e métodos da indução da diferenciação de duas linhas de células epiteliais do peito de camundongo, HC11 e EpH4, e seu uso para estudar estágios complementares de desenvolvimento de glândulas mamárias e transformação neoplástica.

A linha de células epiteliais do camundongo HC11 originou-se da glândula mamária de um rato Balb/c grávida. Diferencia-se quando cultivado à confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico em meio contendo soro fetal de bezerro e ydrocortisona H, insulin e Prolactin (meio QUADRIL). Nessas condições, as células HC11 produzem as proteínas de β-caseína e soroácido soro (WAP), semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes, e formam estruturas rudimentares de glândulam mamárias denominadas "cúpulas".

A linha celular EpH4 foi derivada de células epiteliais de glândula samárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida. Ao contrário do HC11, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente em esferoides (também chamados de mamografias) quando cultivadas condições tridimensionais (3D) de crescimento no meio HIP. As células são trippsinizadas, suspensas em uma matriz de 20% composta por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma de camundongos Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), banhadas em cima de uma camada de matriz concentrada que reveste uma placa de Petri de plástico ou placa multiwell, e coberta com uma camada de 10% de matricial contendo meio HIP. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides ocos que exibem polaridade apical-basal, um lúmen oco, e produzem β-caseína e WAP.

Utilizando essas técnicas, nossos resultados demonstraram que a intensidade do sinal cadherin/Rac é fundamental para a diferenciação das células HC11. Embora rac1 seja necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativado aumentam a diferenciação, altos níveis de RacV12 bloqueiam diferenciação ao induzir neoplasia. Em contraste, as células EpH4 representam um estágio anterior na diferenciação epitelial mamária, que é inibida por níveis ainda baixos de RacV12.

Introdução

Em tecidos normais ou tumores, as células têm extensas oportunidades de adesão aos seus vizinhos em uma organização tridimensional, e isso é imitado na cultura pelo crescimento celular de alta densidade. A adesão celular-célula é mediada principalmente através de receptores de cadherina, que definem arquitetura celular e tecidual. Curiosamente, foi demonstrado recentemente que os cadherins também desempenham um papel poderoso na transdução de sinais, especialmente na sinalização de sobrevivência1. Paradoxalmente, alguns desses sinais de adesão celular-célula emanando de cadherins foram recentemente encontrados para serem compartilhados tanto pela diferenciação quanto pela neoplasia2. Aqui, descrevemos métodos de indução e avaliação da diferenciação em dois tipos representativos de linhas celulares epiteliais do peito do camundongo, HC11 e EpH4.

A linha de células epiteliais do camundongo HC11 pode fornecer um modelo útil para o estudo da diferenciação celular epitelial. As células HC11 são uma linha celular derivada comma-1D, originária da glândula mamária de um rato Balb/c grávidamédia 3. Em contraste com outros clones derivados COMMA-1D, o clone do HC11 não tem exigência para matriz extracelular exógena adicionada ou cocultivo com outros tipos de células para a indução in vitro do gene de β-casein endógeno por hormônios lactogênicos3. Esta linha celular tem sido amplamente utilizada em estudos de diferenciação porque manteve características importantes do epitélio mamário normal: as células HC11 podem reconstituir parcialmente o epitélio ductal em uma almofada de gordura mamária limpa4. Além disso, eles podem diferenciar em uma cultura bidimensional (2D) quando cultivadas para confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico na presença de um esteroide como h ydrocortisona ou Dexamethasone, além de Insulin e Prolactin (meio HIP) sem fator de crescimento epidérmico (EGF), um inibidor de diferenciação5,6,7. Nessas condições, as células HC11 produzem proteínas lácteas, como β-caseína e WAP, que são detectáveis pela coagulação ocidental dentro de 4 dias após a indução. Ao mesmo tempo, uma parte das células HC11 forma estruturas rudimentares de glândulas mamárias denominadas "cúpulas" de forma estocástica. As cúpulas são visíveis de 4 a 5 dias após a indução e aumentam gradualmente de tamanho até o dia 10, concomitantes com um aumento na produção de β-casein8. Curiosamente, as células HC11 possuem mutantes p539, e, portanto, representam um estado préneoplástico. Por essa razão, o modelo HC11 é ideal para estudar redes de sinalização de diferenciação em conjunto com a neoplasia no mesmo sistema celular.

As células EpH4, um derivado das células IM-2, são uma linha celular não tumorigênica originalmente derivada de células epiteliais de glândula mamárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida10. As células EpH4 formam monocamadas epiteliais contínuas na cultura 2D, mas não se diferenciam em estruturas semelhantes a glandular10,11. No entanto, após o crescimento 3D em um material composto por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma do camundongo EHS12 (matriz, matriz ou Matrigel, ver Tabela de Materiais),além de estimulação com quadril, as células EpH4 podem recapitular os estágios iniciais da diferenciação da glândula mamária. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides (também chamados de mamografias) que exibem polaridade apical-basal e um lúmen oco, e são capazes de produzir as proteínas do leite β-caseína e WAP, semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes. Ao contrário das células HC11, que são indiferenciadas, e algumas expressam marcadores mesenquimicos13,as células EpH4 exibem uma morfologia puramente luminal14. As células EpH4 também foram relatadas para produzir proteínas leiteres na cultura 2D através da estimulação com dexametasona, insulina e prolactina15. No entanto, essa abordagem impede o estudo de efeitos regulatórios que imitam o microambiente da glândula mamária na cultura 3D.

Protocolo

1. Plating HC11 Células

  1. Em uma capa de fluxo laminar usando técnicas estéreis prepare uma garrafa com 50 mL de meio celular HC11: RPMI-1640 com soro bovino 10% fetal (FBS), 5 μg/mL insulina e 10 ng/mL EGF (ver Tabela de Materiais).
  2. Prato aproximadamente 400.000 células por 3 cm Placa de petri: Passe duas placas de Petri de 10 cm e 50% em vinte pratos de 3 cm no meio HC11. As células devem estar bem espalhadas, mas a secagem deve ser evitada.
    1. Aspirar o meio em um frasco usando uma bomba de vácuo.
    2. Adicione 250 μL de trippsina (ver Tabela de Materiais) por placa de 10 cm. Redemoinho e bata a placa das laterais, mantendo-a horizontal para espalhar a trippsina e desalojar as células anexadas
    3. Observe em fase de contraste microscopia com um objetivo de 4x para garantir que as células tenham começado a se desprender das bordas antes de encanar.
    4. Aspirar aproximadamente 1,5 mL de HC11 médio em uma pipeta pastelde estéril de 9 polegadas e esguichar-a verticalmente contra as células. Gire a placa de Petri enquanto esguicha para desalojar todas as células. Você deve trabalhar rápido para evitar a secagem das células.
    5. Transfira todas as células para a garrafa com o meio HC11 e redemoinho.
    6. Pipette 2 mL de suspensão celular em cada prato petri de 3 cm. Aça os pratos de Petri em sentido cruzado para se espalhar uniformemente. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
  3. No dia seguinte, ou quando as células são ~90-100% confluentes, aspiram o meio, e substituam-no por meio por FBS e insulina, mas sem EGF.

2. Indução de diferenciação, monitoramento e quantitação de células HC11

  1. Depois de cultivar as células em média sem EGF por 24 h, adicione o meio de diferenciação (meio QUADRIL) a dez placas de 3 cm: RPMI-1640 complementado com 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisona (ver Tabela de Materiais),5 μg/mL Insulin e 5 μg/mL Pactrolin (ver Tabela de Materiais) por até 10 dias.
  2. Mantenha as outras dez placas de 3 cm como controles: Mude para um meio com 10% de FBS e 5 μg/mL insulina sem EGF e HIP.
  3. Mude o meio a cada 2 a 3 dias para células e controles tratados com QUADRIL. Pipette o meio cuidadosamente para garantir que as células não se desapegom.
  4. Para monitorar a diferenciação (ou seja, a formação de cúpulas), observe as células microscopia de contraste de fase (Figura 1A, painel esquerdo). Se as células estiverem expressando proteína de fluorescência verde (GFP), observe microscopia de fluorescência (excitação = 485/20; emissão = 530/25; ampliação 240x; 20x objetiva) (Figura 1A, painel direito).
  5. Para quantificar o grau de diferenciação, extrair proteínas de uma placa de Petri cada uma das células e controles tratados com QUADRIL, uma vez por dia por um total de 10 dias e sondar manchas ocidentais para β-caseína (ver Tabela de Materiais)(Figura 1B).
    1. Raspe as células no gelo com soro lona tampão de fosfato frio de 1,5 mL (PBS) em um tubo de centrífuga de plástico de 1,8 ml.
    2. Pelotas as células a 350 x g, 1 min, 4 °C.
    3. Lave rapidamente a pelota 2x com PBS gelado. Escorra qualquer resíduo.
    4. Faça um tampão de lise: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 μg/mL aprotinina, 10 μg/mL leupeptin1. Adicione 100 μL por 3 cm placa petri.
    5. Esclareça o lysato por centrífuga em 10.000 x g por 10 min no frio.
    6. Determine a concentração de proteínas (ver Tabela de Materiais)e carregue 10-20 μg de proteína de cada amostra para um gel de poliacrilamida-SDS 10%.
    7. Eletroforese por 15 h a 45 V, ou a 100 V por ~2-2,5 h.
    8. Transfira para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um aparelho de transferência de eletrocoagulante (ver Tabela de Materiais).
    9. Bloqueie com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em soro fixo tris com 0,1% Tween-20 (TBST).
    10. Adicione o anticorpo primário, a cabra anti-β-casein diluída 1:2.000 ou mouse anti-β actin diluído 1:1.000 (ver Tabela de Materiais).
    11. Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.
    12. Adicione o anticorpo secundário, peroxidase de rabanete (HRP) ligado ao burro anti-cabra diluído 1:2.500, ou anticorpo anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.
    13. Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.
    14. Adicione reagentes eCL à membrana de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).

3. Revestimento e Crescimento 3D de Células EpH4 em Matriz EHS

NOTA: A matriz é líquida a temperaturas <10 °C e sólida a temperaturas acima. Loja a -80 °C. Descongele a 4 °C na noite anterior ao uso. Pré-esfrie as placas de cultura do tecido e as pontas de pipeta a -20 °C antes de manusear e manter as pontas de matriz, placas e pipette no gelo para evitar que se solidifique.

  1. Cultivar células EpH4 em 2D em rpmi-1640 médio com 10% FBS e 5 μg/mL insulina (EGF não é necessário).
  2. Prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com 10% (v/v, 3.500 μL) ou 20% (v/v 2.000 μL) em dois tubos cônicos de 50 mL. Mantenha o gelo até estar pronto para usar.
  3. Cubra 10 poços (1 cm2 cada) de uma placa de 24 poços com 150 μL de matriz não diluída. Espalhe a matriz usando uma dica de pipeta. Evite criar bolhas. Toque delicadamente nas laterais da placa enquanto a segura horizontalmente para garantir que a matriz seja distribuída uniformemente pela parte inferior do poço.
  4. Incubar a placa de 24 poços a 37 °C por 1h para permitir que a matriz se solidifique.
  5. Experimente as células EpH4 como descrito acima para as células HC11 e conte-as com um hemocímetro. Transfira 5 x 104 células por poço para um tubo de centrífuga círica cínica estéril de 1,5 mL e gire a 250 x g por 5 min.
  6. Atribua cuidadosamente o meio e coloque o tubo no gelo.
  7. Resuspender as células em 350 μL do meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 20% usando uma ponta de tubulata de 1 mL, mantendo o tubo cônico no gelo. Evite bolhas. É importante garantir uma suspensão de uma única célula.
  8. Uma vez que a matriz de camada inferior tenha se solidificado (a matriz deve parecer translúcida e mais leve em cores em comparação com o revestimento inicial dos poços), adicione os 350 μL de suspensão celular a cada poço revestido e coloque em uma incubadora de CO2 a 37 °C para ~1h para permitir que a camada matricial de 20% se solidifique.
    1. Observe as células microscopicamente em contraste de fase com um objetivo 4x. Células únicas devem ser visíveis.
  9. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo matriz de 10% em cima dos 350 μL de células suspensas em matriz de 20%. Incubar a 37 °C.

4. Indução de diferenciação de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 2)

NOTA: Além da diferenciação, as células EpH4 também podem sofrer tubulogênese quando estimuladas com HGF (fator de crescimento hepatocito) na cultura 3D. Os crescimentos tubulares podem ser vistos após 10 dias de estimulação hip e HGF.

  1. Comece a indução de diferenciação das células EpH4 1 dia após o revestimento na matriz. Remova cuidadosamente 150 μL do meio superior contendo matriz de 10% dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo QUADRIL e matriz de 10%.
  2. Substitua o meio matrix-HIP de 10% a cada 2 dias por até 10 dias. Cresça células de controle no mesmo meio de matriz de 10% sem quadril.
  3. Monitore a formação da mamografia em contraste de fase(Figura 3A,painel inferior).

5. Indução de tubulogênese de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 3A e 3C)

  1. Prepare 24 placas de poço e células EpH4 para crescimento em matriz conforme detalhado nas etapas 3.1-3.9. No dia seguinte ao revestimento das células na matriz, remova 150 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz, QUADRIL e 20 ng/mL HGF (ver Tabela de Materiais).
  2. Substitua o meio matriz/QUADRIL/HGF de 10% a cada 2 dias por até 12 a 14 dias.
  3. Monitorar a formação de túbulos microscopicamente usando um objetivo de 20x ou 40x (Figura 3A, painel direito).

6. Quantitação da Diferenciação: Loteamento Ocidental para β-casein

  1. Cuidadosamente pipette fora do meio 10% matrix-HIP dos poços. Enxágüe a camada matricial de 20% 2x com 350 μL de PBS gelado. Os esferoides ainda devem estar presentes na camada matricial.
  2. Adicione 700-1.000 μL de PBS gelado com 1 mM ácido etilenodiaminatetratetracético (EDTA) diretamente nos poços. Retire delicadamente a camada inferior da matriz de 100% do poço com uma ponta de pipeta para recuperar esferoides presentes nessa camada. Agite suavemente por 30 min a 4°C.
  3. Transfira cuidadosamente a suspensão esferoide para um tubo cônico. Enxágüe os poços com ~500 μL de PBS-EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes nos poços e adicionar ao tubo cônico.
  4. Rocha no gelo por mais 30 min. Certifique-se de que a matriz se dissolveu completamente. Se os aglomerados de matriz visíveis forem vistos, adicione mais PBS-EDTA ou agite mais.
  5. Centrífuga a solução para pelotas os esferoides em 350 x g por 5 min.
  6. Aspirar o supernatant, lise os esferoides em tampão de lise gelada, e sonda para β-caseína, cyclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais como na etapa 2.5 acimade 16. Como anticorpos primários, use cabra anti-β-casein diluída 1:2.000, o coelho anti-ciclina D1 diluído 1:2.000, e o rato anti-p120 diluído 1:2.000. Para anticorpos secundários, use o burro anti-cabra ligado ao HRP diluído 1:2.500, o burro ligado ao HRP anti-coelho diluído 1:2.500, e o anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.

Resultados

Há muito se sabe que a diferenciação de células epiteliais e adipócitos requer confluência e engajamento de cadherins2. Nós e outros demonstramos que a adesão celular-célula e o engajamento de E- ou N-cadherin e cadherin-11, como ocorre com a confluência das células cultivadas, desencadeia um aumento dramático na atividade do pequeno GTPases Rac e da proteína de controle da divisão celular 42 (Cdc42), e esse processo leva à ativação de citocinas familiares interleucinas-6 (IL6) e ...

Discussão

As células HC11 são idealmente adequadas para o estudo da diferenciação em conjunto com a transformação neoplástica. Uma vantagem adicional é que as células HC11 são facilmente infectáveis com vetores retrovirais baseados em Mo-MLV para expressar uma variedade de genes. Em nossas mãos, as células EpH4 eram mais difíceis de infectar com os mesmos vetores retrovirais do que o HC112.

Contato celular-celular e prisão de crescimento são pré-requisitos fundam...

Divulgações

Os autores não têm conflitos para divulgar.

Agradecimentos

A linha celular HC11 foi gentilmente fornecida pelo Dr. D. Medina (Houston, TX). Os autores são gratos ao Dr. Andrew Craig da Queen's University por muitos reagentes e sugestões valiosas. As células EpH4 foram um presente do Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick prestou excelente assistência técnica para estudos culturais 3D.

A assistência financeira do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontário Chapter), da Canadian Breast Cancer Research Alliance , os Centros de Excelência de Ontário, a Ação contra o Câncer de Mama Kingston (BCAK) e o fundo de legado Clare Nelson através de subsídios à LR são reconhecidos com gratidão. Be recebeu apoio de subvenção da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. A PTG é apoiada por um presidente de pesquisa do Canadá, Fundação Canadense para Inovação, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN foi apoiado por uma estudante do Terry Fox Training Program em Pesquisa Transdisciplinar de Câncer da NCIC, um prêmio de pós-graduação (QGA), e um Prêmio Reitor da Queen's University. Mg foi apoiado por bolsas de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério da Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê de Pesquisa Consultiva da Universidade da Rainha. A VH foi apoiada por uma bolsa de doutorado da CBCF e uma bolsa de pós-doutorado do Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research em parceria com a CIHR. Hanad Adan foi o destinatário de uma estudante de verão da NSERC. BS foi apoiado por um prêmio de pós-graduação da Queen's University.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/0.8% Bis SolutionBio Rad1610154Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibodyrabbit, Santa Cruzsc-717Western Blotting
Anti-p120 antibodymouse, Santa Cruzsc-373751Western Blotting
Anti-β actin antibodymouse, Cell Signalling technology3700Western Blotting
Anti-β casein antibodygoat, Santa Cruz Biotechnologysc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid SolutionSigmaB9643-1L-KCProtein Determination
Bovine serum albuminBio ShopALB007.500Protein Determination
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad170-5061Western Blotting
Copper(II) sulphateSigmaC2284-25MLProtein Determination
DAPIThermofisher ScientificD1306Staining
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500Staining
EDTABio ShopEDT001.500
Epidermal Growth FactorSigmaE9644Medium for HC11 Cells
Fetal calf serumPAAA15-751Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRPSanta CruzSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinantGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRPCell Signalling Technology7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP Medium
insulinSigmaI6634HIP Medium
Laminar-flow hoodBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)CorningCACB 354230
Mouse Anti-Goat HRPSanta Cruzsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ReagentCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMStaining
Multi-photon confocal microscopeLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850Lysis Buffer
Na4P207Sigma125F-0262Lysis Buffer
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4Lysis Buffer
Nikon digital CameraCoolpix 995
NitrocelluloseBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4Staining
Phase Contrast MicroscopeOlympus IX70Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluorideSigma329-98-6Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlactinSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35Sarstedt83.3900.Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 wellSarstedt83.1836.300Cell Culture
Transfer ApparatusCBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.Cell Culture
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting

Referências

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