АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем методы индукции двух эпителиальных линий молочной железы, HC11 и EpH4. В то время как оба требуют сыворотки плода теленка, инсулина и пролактина для производства молочных белков, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в маммосферы в трехмерной культуре. Эти дополнительные модели полезны для исследований трансдукции сигналов дифференциации и неоплазии.

Аннотация

Кадхерины играют важную роль в регулировании дифференциации клеток, а также неоплазии. Здесь мы описываем происхождение и методы индукции дифференциации двух линий эпителиальной клеточной клетки молочной железы, HC11 и EpH4, а также их использование для изучения дополнительных этапов развития молочной железы и неопластической трансформации.

Линия эпителиальной клеточной клетки мышки HC11 возникла из молочной железы беременной мыши Balb/c. Он дифференцируется, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности чашки Петри в среде, содержащей сыворотки икроножной железы плода и Hydrocortisone, Insulin и Prolactin (HIP среды). В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки и сывороточный кислотный белок (WAP), похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы, и образуют рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами».

Линия клеток EpH4 была получена из спонтанно увековеченных мышей молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от беременной бальзам / c мыши. В отличие от HC11, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в сфероиды (также называемые маммосферы), когда культивируется в трехмерных (3D) условиях роста в среде HIP. Клетки трипсинизированы, подвешены в 20% матрице, состоящей из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), покрынные поверх слоя концентрированной матрицы, покрывающей пластиковую тарелку Петри или многоцветную пластину, и покрытые слоем 10% матрицы, содержащей HIP среду. В этих условиях клетки EpH4 образуют полые сфероиды, которые демонстрируют апикально-базальную полярность, полый просвет, и производят к-казеин и WAP.

Используя эти методы, наши результаты показали, что интенсивность сигнала cadherin/Rac имеет решающее значение для дифференциации клеток HC11. В то время как Rac1 необходим для дифференциации и низких уровней активированного RacV12 увеличить дифференциацию, высокие уровни RacV12 блокируют дифференциацию, вызывая неоплазию. В отличие от этого, клетки EpH4 представляют собой более раннюю стадию в дифференциации эпителии молочной железы, которая тормозится даже низким уровнем RacV12.

Введение

В нормальных тканях или опухолях клетки имеют широкие возможности для примыкания к своим соседям в трехмерной организации, и это передразняется в культуре высоким ростом клеток плотности. Клеточная стежка опосредована главным образом через рецепторы кадерин, которые определяют архитектуру клеток и тканей. Интересно, что недавно было продемонстрировано, что кадерины также играют важную роль в трансдукции сигналов, особенно в выживании сигнализации1. Парадоксально, но некоторые из этих клеточных стыковочных сигналов, исследующих из кадерин, были недавно найдены общими как дифференциации и неоплазии2. Здесь мы описываем методы индукции и оценки дифференциации в двух представительных типах эпителиальных клеточных линий молочной железы мыши, HC11 и EpH4.

Линия эпителиальной клеточной линии мыши HC11 может стать полезной моделью для изучения дифференциации эпителиальных клеток. Клетки HC11 являются comMA-1D-производные клеточной линии, происходящих из молочной железы в середине беременной Balb / c мыши3. В отличие от других производных клонов COMMA-1D, клон HC11 не требует экзогенно добавленной внеклеточной матрицы или кокультивации с другими типами клеток для индукции в пробирке эндогенного гена эндогенного гена лактогенными гормонами3. Эта клеточная линия была широко использована в исследованиях дифференциации, потому что она сохранила важные характеристики нормального эпителия молочной железы: клетки HC11 могут частично воссоздать протоковый эпителий в очищенной молочной жирной площадке4. Кроме того, они могут дифференцировать в двумерной (2D) культуры, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности блюда Петри в присутствии стероидов,таких как Hydrocortisone или Дексаметазон, в дополнение к Insulin и Prolactin (HIP средний) не хватает эпидермального фактора роста (EGF), ингибитор дифференциации5,6. В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки, такие как к-казеин и WAP, которые обнаруживаются западными промотированием в течение 4 дней после индукции. В то же время, часть клеток HC11 образует рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами» в стохастической манере. Куполы видны через 4-5 дней после индукции и постепенно увеличиваются в размерах до 10-го дня, что сопутствует увеличению производства к-казеина8. Интересно, что клетки HC11 обладают мутантом p539,и поэтому представляют собой преднеопластическое состояние. По этой причине модель HC11 идеально подходит для изучения сигнальных сетей дифференциации в сочетании с неоплатой в одной и той же клеточной системе.

Клетки EpH4, производные im-2 клеток, являются неопухолевой клеточной линии первоначально полученных от спонтанно увековеченных мыши молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от середины беременности Balb / C мыши10. Клетки EpH4 образуют непрерывные эпителиальные монослои в 2D-культуре, но не дифференцируются в железоподобные структуры10,11. Однако, после 3D роста в материале, состоящем из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши EHS12 (EHS matrix, matrix, или Matrigel, см. Таблица Материалов),в дополнение к стимуляции с HIP, epH4 клетки могут резюмировать начальные стадии дифференциации молочной железы. В этих условиях клетки EpH4 образуют сфероиды (также называемые маммосферами), которые демонстрируют апикально-базальную полярность и полый просвет, и способны производить молочные белки и WAP, похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы. В отличие от клеток HC11, которые являются недифференцированными, а некоторые выражают мезенхимальные маркеры13,клетки EpH4 демонстрируют чисто светлую морфологию14. EpH4 клетки также сообщалось производить молочные белки в 2D культуры путем стимуляции с дексаметазоном, инсулином и пролактином15. Однако такой подход исключает изучение регулятивных эффектов, имитирующих микросреду молочной железы в 3D-культуре.

протокол

1. Покрытие hC11 Клетки

  1. В ламинарном капоте с использованием стерильных методов подготовить бутылку с 50 мл Среды клетки HC11: RPMI-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 5 мкг/мл инсулина, и 10 нг/мл EGF (см. Таблица материалов).
  2. Плита приблизительно 400,000 клеток в 3 см Чашка Петри: Передайте 2 10 см, 50% свяжените блюда Петри в двадцать 3 см блюд в среде HC11. Клетки должны быть хорошо распространены, но высыхания следует избегать.
    1. Аспирируйте среду в колбу с помощью вакуумного насоса.
    2. Добавьте 250 зл трипсина (см. Таблицу Материалов)на тарелку 10 см. Вихрь и ударил пластину со стороны, сохраняя его горизонтальным для распространения трипсина и выбить прикрепленные клетки
    3. Обратите внимание под фазовой контрастной микроскопией с целью 4x, чтобы убедиться, что клетки начали отсажиться от краев перед пипеткой.
    4. Аспирируйте примерно 1,5 мл среды HC11 в стерильной, 9-дюймовой пипетке Pasteur и впрыскивают его вертикально против клеток. Поверните чашку Петри, брызгая, чтобы выбить все клетки. Вы должны работать быстро, чтобы избежать сушки клеток.
    5. Перенесите все клетки в бутылку со средним HC11 и вихрем.
    6. Пипетка 2 мл клеточной подвески в каждом 3 см Чашка Петри. Рок Петри блюда поперечно распространяться равномерно. Поместите клетки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  3. На следующий день, или когда клетки 90-100% смещаются, аспирируют среду и заменяют его на среду с FBS и инсулином, но не хватает EGF.

2. Индукция дифференциации, мониторинг и количественная оценка клеток HC11

  1. После выращивания клеток в среде не хватает EGF для 24 ч, добавить дифференциации среды (HIP средний) до десяти 3 см пластин: RPMI-1640 дополнены 10% FBS, 1 мкг /мЛ Hydrocortisone (см. Таблица материалов), 5 мкг /мЛ Insulin и 5 мкг /мл Prolactin (см. Таблица материалов)в течение 10 дней.
  2. Держите другие десять 3 см пластин в качестве элементов управления: Изменение на среду с 10% FBS и 5 мкг /мл инсулина не хватает EGF и HIP.
  3. Изменение среды каждые 2-3 дней как HIP-обработанных клеток и элементов управления. Pipette среды тщательно, чтобы убедиться, что клетки не отсоединяться.
  4. Для мониторинга дифференциации (т.е. формирования "куполов"), наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопией(рисунок 1А,левая панель). Если клетки выражают зеленый белок флуоресценции (GFP), наблюдайте под микроскопией флуоресценции (возбуждение No 485/20; излучение 530/25; увеличение 240x; 20x цель) (Рисунок 1A, правая панель).
  5. Для количественной оценки степени дифференциации, извлечь белки из одного блюда Петри каждый из HIP обработанных клеток и элементов управления, один раз в день в общей сложности 10 дней и зонд западных помарки для к-казеина (см. Таблица материалов) (Рисунок 1B).
    1. Очистите клетки на льду с 1,5 мл холодного фосфатного сосудистого сосудистого раствора (PBS) в 1,8 мл пластиковой центрифуги трубки.
    2. Пелле клетки на 350 х г, 1 мин, 4 C.
    3. Быстро промыть гранулы 2x с ледяной PBS. Слейте воду любые остатки.
    4. Сделать буфер лисиса: 50 мМ HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10 мМ EDTA, 10 мМ Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 мМ Na 3 VO4, 0,5 мм фенилметилсулфонил фторид (PMSF), 10 мкг/мл протетинин, 10 мкг/м люпептин16. Добавьте 100 л на 3 см блюда Петри.
    5. Уточните лизат центрифугирование при 10 000 х г в течение 10 мин на холоде.
    6. Определите концентрацию белка (см. Таблица Материалов)и загрузите 10–20 мкг белка из каждого образца на 10% полиакриламид-SDS гель.
    7. Электрофорез ы 15 ч при 45 В, или при 100 В за 2-2,5 ч.
    8. Перенесите на нитроцеллюлозу или мембрану PVDF с помощью электроблоттного переносного аппарата (см. Таблицу Материалов).
    9. Блок с 5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в Tris-буферированный солен с 0,1% Tween-20 (TBST).
    10. Добавить первичное антитело, коза анти-к-казеин разбавленной 1:2,000 или мыши анти-актин разбавленной 1:1,000 (см. Таблица материалов).
    11. Вымойте 3x с TBST, 5 минут каждый раз.
    12. Добавить вторичное антитела, хрен peroxidase (HRP) связаны осла анти-коза разбавленной 1:2,500, или HRP связаны лошади анти-мышь антитела разбавленной 1:10000.
    13. Вымойте 3x с TBST, 5 минут каждый раз.
    14. Добавьте реагенты ECL в мембрану в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу Материалов).

3. Покрытие и 3D Рост клеток EpH4 в ehS Матрица

ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица жидкая при температурах и твердая при температурах выше. Хранить при -80 градусах по Цельсию. Оттепель при 4 градусах Цельсия в ночь перед использованием. Предварительно охладить ткани культуры пластин и пипетки советы на -20 градусов до обработки и сохранить матрицу, пластины, и пипетки советы на льду, чтобы предотвратить его от затвердевания.

  1. Выращивайте клетки EpH4 в 2D в среде RPMI-1640 с 10% FBS и 5 мкг/мл инсулина (EGF не требуется).
  2. Подготовьте матрицу роста EpH4, дополненную 10% (v/v, 3500 qL) или 20% (v/v 2,v 2,000 qL) матрицы в двух 50 мл конических труб. Держите на льду до готовности к использованию.
  3. Пальто 10 скважин (1 смпо 2 каждый) из 24 хорошо пластины с 150 зл и с неразбавленной матрицы. Распространение матрицы с помощью наконечника пипетки. Избегайте создания пузырьков. Аккуратно коснитесь сторон пластины, удерживая ее горизонтально, чтобы гарантировать равномерное распределение матрицы по нижней части скважины.
  4. Инкубировать 24 хорошо пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы матрица затвердеть.
  5. Трипсинизуйте клетки EpH4, описанные выше для клеток HC11, и посчитайте их гемоситометром. Перенесите 5 х 104 ячеек на скважину в стерильную конитрическую центрифугу мощностью 1,5 мл и вращайтесь при 250 х г в течение 5 мин.
  6. Тщательно аспирируйте среду и поместите трубку на лед.
  7. Resuspend клетки в 350 qL среды роста EpH4 дополнены 20% матрицы с помощью 1 мл пипетки отзыв при сохранении конической трубки на льду. Избегайте пузырьков. Важно обеспечить одноклеточную подвеску.
  8. После того, как матрица нижнего слоя затвердела (матрица должна казаться полупрозрачной и светлее по цвету по сравнению с первоначальным покрытием скважин), добавьте 350 злиц клеточной подвески к каждому хорошо покрытому и поместите в инкубатор CO2 при 37-C за 1 ч, чтобы 20% матричного слоя затвердеть.
    1. Наблюдайте клетки микроскопически под контрастом фазы с целью 4x. Одиночные ячейки должны быть видны.
  9. Добавьте 200 qL среды EpH4, содержащей 10% матрицы в верхней части 350 злители клеток, подвешенных в 20% матрице. Инкубировать при 37 градусах Цельсия.

4. Индукция дифференциации клеток EpH4, выращенных в 3D (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо дифференциации, клетки EpH4 также могут пройти тубурогенез при стимуляции с HGF (фактор роста гепатоцитов) в 3D-культуре. Трубчатые наросты можно увидеть после 10 дней стимуляции HIP и HGF.

  1. Начало индукции дифференциации клеток EpH4 через день после покрытия в матрице. Тщательно удалите 150 л верхней среды, содержащей 10% матрицы из колодцев с помощью пластикового наконечника пипетки. Добавьте 200 qL среды EpH4, содержащей HIP и 10% матрицы.
  2. Замените 10% матрицу-HIP среды каждые 2 дня на срок до 10 дней. Выращивайте контрольные клетки в той же 10%-ной матричной среде без HIP.
  3. Мониторинг формирования маммографии под фазовой контрастносткой(рисунок 3А,нижняя панель).

5. Тубурогенез индукции клеток EpH4, выращенных в 3D(Рисунок 3A и 3C)

  1. Подготовьте 24 скважины и клетки EpH4 для роста в матрице, как подробно описано в шагах 3.1-3.9. На следующий день после покрытия клеток в матрице, удалить 150 Зл EpH4 среды, содержащей 10% матрицы из колодцев с помощью пластиковой наконечник пипетки. Добавьте 200 кЛ среды EpH4, содержащей 10% матрицы, HIP и 20 нг/мл HGF (см. Таблица материалов).
  2. Замените 10% матрицу/HIP/HGF среду каждые 2 дня на срок до 12-14 дней.
  3. Монитор тулучки формирования микроскопически с помощью 20x или 40x цель(рисунок 3A, правая панель).

6. Количественная дифференциация: Западный Блоттинг для к-казеина

  1. Тщательно pipette от 10% матрицы-HIP среды из скважин. Промыть 20% матричного слоя 2x с 350 л ледяной PBS. Сфероиды должны по-прежнему присутствовать в матричном слое.
  2. Добавьте 700-1000 л ледяной PBS с 1 мм этилэндениаминетететраацетической кислоты (ЭДТА) непосредственно в скважины. Аккуратно отсоедините нижний слой 100% матрицы от колодца с наконечником пипетки для восстановления сфероидов, присутствующих в этом слое. Встряхните осторожно в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
  3. Аккуратно перенесите сфероидную подвеску в коническую трубку. Промыть скважины с помощью 500 евро PBS-EDTA, чтобы восстановить оставшиеся сфероиды в скважинах и добавить в коническую трубку.
  4. Рок на льду еще 30 мин. Убедитесь, что матрица полностью растворилась. Если видны видимые матричные комки, добавьте больше PBS-EDTA или встряхните дольше.
  5. Centrifuge раствор для гранул ы сфероидов на 350 х г в течение 5 мин.
  6. Аспирировать супернатант, лисс сфероидов в ледяной буфер лиза, и зонд для к-казеина, циклина D1, и p120RasGAP по западной blotting как в шаге 2.5 выше16. В качестве первичных антител, используйте козьего анти-к-казеина разбавленного 1:2,000, кролика анти-циклин D1 разбавленный 1:2,000, и мышь анти-p120 разбавленной 1:2,000. Для вторичных антител, используйте HRP связаны осла анти-козла разбавленной 1:2,500, HRP связаны осла анти-кролик разбавленной 1:2,500, и HRP связаны лошадь анти-мышь разбавленной 1:10000.

Результаты

Давно известно, что дифференциация эпителиальных клеток и адипоцитов требует слияния и вовлечения кадерин2. Мы и другие продемонстрировали, что сливка от клетки к ячейке и вовлечение E- или N-кадерин и кадхерин-11, как происходит с слиянием культивированных клеток, вызывает р...

Обсуждение

Клетки HC11 идеально подходят для изучения дифференциации в сочетании с неопластической трансформацией. Дополнительным преимуществом является то, что клетки HC11 легко заражаются ретровирусными вектором на основе Mo-MLV для выражения различных генов. В наших руках клетки EpH4 было труднее за...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Линия клеток HC11 была любезно предоставлена доктором Д. Мединой (Хьюстон, Техас). Авторы благодарны доктору Эндрю Крейгу из Королевского университета за множество реагентов и ценных предложений. Клетки EpH4 были подарком от доктора C. Roskelley (UBC, Ванкувер). Коллин Шик оказала отличную техническую помощь для 3D-культуры исследований.

Финансовая помощь Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда рака молочной железы (CBCF, Онтарио Глава), Канадского альянса исследований рака молочной железы , Онтарио Центры передового опыта, рака молочной железы действий Кингстон (BCAK) и Клэр Нельсон завещание фонда через гранты LR с благодарностью признается. BE получил грантовую поддержку от CIHR, CBCF, BCAK и онкологических исследований общества Инк PTG поддерживается Канады научно-исследовательский председатель, Канадский фонд инноваций, CIHR, NSERC и Канадского онкологического общества. MN была поддержана студентом из Терри Фокс Учебная программа в transdisciplinary исследований рака от NCIC, Высшей премии (ЗГА), и премия декана от Университета королевы. MG была поддержана постдокторской стипендий от армии США рака молочной железы программы, Министерство исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативный исследовательский комитет Королевского университета. VH была поддержана докторской стипендией CBCF и постдокторской стипендией от Программы обучения Фонда Терри Фокса в области трансдисциплинарных онкологических исследований в партнерстве с CIHR. Ханад Адан был получателем летнего обучения NSERC. BS была поддержана наградой выпускника Королевского университета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/0.8% Bis SolutionBio Rad1610154Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibodyrabbit, Santa Cruzsc-717Western Blotting
Anti-p120 antibodymouse, Santa Cruzsc-373751Western Blotting
Anti-β actin antibodymouse, Cell Signalling technology3700Western Blotting
Anti-β casein antibodygoat, Santa Cruz Biotechnologysc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid SolutionSigmaB9643-1L-KCProtein Determination
Bovine serum albuminBio ShopALB007.500Protein Determination
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad170-5061Western Blotting
Copper(II) sulphateSigmaC2284-25MLProtein Determination
DAPIThermofisher ScientificD1306Staining
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500Staining
EDTABio ShopEDT001.500
Epidermal Growth FactorSigmaE9644Medium for HC11 Cells
Fetal calf serumPAAA15-751Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRPSanta CruzSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinantGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRPCell Signalling Technology7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP Medium
insulinSigmaI6634HIP Medium
Laminar-flow hoodBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)CorningCACB 354230
Mouse Anti-Goat HRPSanta Cruzsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ReagentCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMStaining
Multi-photon confocal microscopeLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850Lysis Buffer
Na4P207Sigma125F-0262Lysis Buffer
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4Lysis Buffer
Nikon digital CameraCoolpix 995
NitrocelluloseBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4Staining
Phase Contrast MicroscopeOlympus IX70Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluorideSigma329-98-6Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlactinSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35Sarstedt83.3900.Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 wellSarstedt83.1836.300Cell Culture
Transfer ApparatusCBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.Cell Culture
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting

Ссылки

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156EHS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены