マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化

要約

我々は、2つの胸上皮線HC11およびEpH4の分化誘導のための技術を記述する。どちらも乳タンパク質を産生するために胎児の子牛血清、インスリン、プロラクチンを必要としますが、EpH4細胞は3次元培養でマンモスフィアに完全に分化することができます。これらの相補モデルは、分化および新生物のシグナル伝達研究に有用である。

要約

カドヘリンは、細胞分化および腫瘍の調節において重要な役割を果たす。ここでは、2つのマウス胸上皮細胞株HC11とEpH4の分化誘導の起源と方法、および乳腺の発達と腫瘍性形質転換の相補的段階を研究するためのその使用について説明する。

HC11マウスの乳房上皮細胞系は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺に由来する。これは、胎児の子牛血清およびHイドロコルチゾン、InsulinおよびPロラクチン(HIP培地)を含む培地中のプラスチックペトリ皿表面に結合するように成長した場合に分化する。これらの条件下で、HC11細胞は乳タンパク質βカゼインおよび乳清酸性タンパク質(WAP)を産生し、乳腺上皮細胞の授乳と同様に、初歩的な乳腺様構造を形成し、「ドーム」と呼ばれます。

EpH4細胞株は、妊娠中のバルブ/cマウスから単離された自発的に不死化したマウス乳腺上皮細胞に由来した。HC11とは異なり、EPH4細胞はHIP培地で3次元(3D)増殖条件下で培養すると、スフェロイド(マンモスフィアとも呼ばれる)に完全に分化することができます。細胞はトリプシン化され、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる20%マトリックスで懸濁し、プラスチックペトリ皿またはマルチウェルプレートをコーティングする濃縮マトリックスの層の上にメッキし、10%マトリックス含有HIP培地の層で覆われる。これらの条件下で、EpH4細胞は、尖面基底極性、中空ルーメンを示し、βカゼインおよびWAPを産生する中空回転楕円体を形成する。

これらの技術を用いて、我々の結果は、カドヘリン/Racシグナルの強度がHC11細胞の分化に重要であることを実証した。Rac1は分化に必要であり、活性化されたRac^V12の低レベルは分化を増加させるが、高いRac^V12レベルは新生物を誘導しながら分化をブロックする。対照的に、EpH4細胞は乳腺上皮分化における初期段階を表し、これは低レベルのRac^V12によっても阻害される。

概要

正常な組織や腫瘍では、細胞は3次元組織で隣人との接着の広範な機会を有し、これは高密度細胞増殖によって培養中に模倣される。細胞間接着は、主にカドヘリン受容体を介して媒介され、細胞および組織の構造を定義する。興味深いことに、カドヘリンは、特に生存シグナル伝達¹において、シグナル伝達においても強力な役割を果たしていることを最近実証した。逆説的に、カドヘリンから発せられるこれらの細胞間接着シグナルの一部は、最近、分化と新生物²の両方によって共有されることがわかった。ここでは、マウス胸上皮細胞株の2つの代表的なタイプHC11およびEpH4における分化誘導および評価の方法を記載する。

HC11マウスの胸上皮細胞株は、上皮細胞分化の研究に有用なモデルを提供することができる。HC11細胞は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺由来のCOMMA-1D由来細胞株^{である3。}他のCOMMA−1D誘導体クローンとは対照的に、HC11クローンは、発泡性ホルモン³による内因性β-カゼイン遺伝子のインビトロ誘導のために他の細胞型と外因性付加された細胞外マトリックスまたは共培養のための要件を有さない。この細胞株は、正常乳上皮の重要な特徴を保持しているため分化試験で広く使用されている:HC11細胞は、乳腺脂肪パッド⁴をクリアして、そのダクト上皮を部分的に再構成することができる。また、Hイドロコルチゾンやデキサメタゾンなどのステロイドの存在下でプラスチックペトリ皿表面に結合して成長した場合に2次元(2D)培養で分化することができ、さらに、表皮成長因子(EGF)を欠く上皮成長因子(EGF)に加えて^、5、6、7の^異化阻害薬である。これらの条件下では、HC11細胞はβカゼインやWAPなどの乳タンパク質を産生し、これは誘導後4日以内にウェスタンブロッティングによって検出可能である。同時に、HC11細胞の一部は、ストカスティックな方法で「ドーム」と呼ばれている初歩的な乳腺様構造を形成する。ドームは、誘導後4〜5日目に見え、徐々に10日目までサイズが増加し、βカゼイン産生の増加に伴って^8.興味深いことに、HC11細胞は変異型p53⁹を有し、したがって前生性状態を表す。このため、HC11モデルは、同じ細胞系の新生物と組み合わせて分化のシグナリングネットワークを研究するのに理想的です。

EPH4細胞は、IM−2細胞の誘導体であり、元来、妊娠中のバルブ/cマウス¹⁰から単離された自発的に不死化マウス乳腺上皮細胞に由来する非腫瘍性細胞株である。EpH4細胞は2D培養で連続上皮単層を形成するが、腺様構造^10,11に分化しない。しかし、EHSマウス肉腫細胞¹²によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる材料での3D増殖に続いて(EHSマトリックス、マトリックス、またはマトリゲル、材料の表を参照)、HIPによる刺激に加えて、EpH4細胞は乳腺分化の初期段階を再現することができる。これらの条件下では、EpH4細胞は、吸盤基底極性および中空腔を示す回転楕円体(マンモスフィアとも呼ばれる)を形成し、乳タンパク質β-カゼインおよびWAPを産生し得る。未分化化しているHC11細胞とは対照的に、幾つかは間葉マーカー¹³を発現するが、EpH4細胞は純粋に発光形態¹⁴を示す。EpH4細胞はまた、デキサメタゾン、インスリン、およびプロラクチン¹⁵による刺激を通じて2D培養で乳タンパク質を産生することが報告されている。しかし、このアプローチは、3D培養における乳腺微小環境を模倣する調節効果の研究を妨げる。

プロトコル

1. HC11細胞のめっき

1. 無菌技術を用いた層流フードでは、HC11細胞培地の50mLのボトルを準備します:10%のウシ胎児血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、および10 ng/mL EGFを備えたRPMI-1640(材料表参照)。
2. プレート 3 cm ペトリ皿あたり約 400,000 セル: HC11 培地で 20 3 cm の皿に 2 つの 10 cm、50% コンフルエントペトリ皿を渡します。細胞はよく広がらなければならないが、乾燥は避けなければならない。
   1. 真空ポンプを使用してフラスコに培地を吸引します。
   2. 10 cmプレートあたり250μLのトリプシン(材料表を参照)を加えます。トリプシンを広げ、取り付けられた細胞を取り除くために水平に保ちながら、プレートを横から回転させ、打つ
   3. 位相コントラスト顕微鏡下で4倍の目的を観察し、ピペット処理の前に細胞がエッジから切り離し始めたことを確認します。
   4. 滅菌、9インチパスツールピペットにHC11培地の約1.5 mLを吸引し、細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞を取り除くために潮吹きしながらペトリ皿を回転させます。細胞の乾燥を避けるために、速く働かなければなりません。
   5. HC11培地と渦巻きでボトルにすべての細胞を移します。
   6. ピペット2 mLの細胞懸濁液を各3cmペトリ皿に入れます。ペトリ料理を横に揺らし、均等に広げます。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに入れる。
3. 翌日、または細胞が〜90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、培地をFBSおよびインスリンと培地に置換するが、EGFを欠いている。

2. HC11細胞の分化誘導・モニタリング・定量

1. 24時間のEGFを欠いている培地で細胞を成長させた後、分化培地(HIP培地)を10個の3cmプレートに加えます:10%FBSを添加したRPMI-1640、1μg/mL Hイドロコルチゾン(材料表を参照)、5 μg/mL P rolactin(材料の表を参照)。
2. 他の10個の3cmプレートをコントロールとして保管する:10%FBSと5 μg/mLインスリンがEGFおよびHIPを欠いている媒体に変更します。
3. HIP 処理セルとコントロールの両方に 2 ~ 3 日ごとにメディアを変更します。細胞が剥離しないように慎重に培地をピペット。
4. 分化(すなわち、「ドーム」の形成)を監視するために、位相コントラスト顕微鏡下の細胞を観察する(図1A、左パネル)。細胞が緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現している場合、蛍光顕微鏡(励起= 485/20;放出= 530/25;倍率240倍;20倍の目的)で観察する(図1A、右パネル)。
5. 分化の程度を定量するには、HIP処理細胞およびコントロールの各々のペトリ皿からタンパク質を抽出し、1日1回、βカゼイン用のプローブウェスタンブロット(材料表を参照)(図1B)。
   1. 1.8 mlのプラスチック遠心分離管に1.5 mL氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を削ります。
   2. 350 x g、1分、4 °C で細胞をペレットします。
   3. 氷冷PBSでペレット2xを素早く洗います。残留物を排水します。
   4. リシスバッファーを作る:50 mM HEPES (pH = 7.4)、150 mM NaCl、 10 mM EDTA, 10 mM Na₄P₂O_7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na₃VO_4,0.5 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF), 10 μg/mL アプロチニン, 10 μg/mL レプテプチン^16.3cmペトリ皿あたり100μLを加えます。
   5. 寒さの中で10分の10,000×gで遠心分離によってライセートを明確にします。
   6. タンパク質濃度を決定し(材料表を参照)、各サンプルから10%ポリアクリルアミド-SDSゲルに10~20μgのタンパク質をロードします。
   7. 45 Vで15時間、~2~2.5hの場合は100 Vの電気phorese。
   8. 電気ブロッティング転写装置を用いてニトロセルロースまたはPVDF膜に転写する(材料表参照)。
   9. トリス緩衝生理液中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%Tween-20(TBST)でブロックします。
   10. 一次抗体を加えて、ヤギの抗βカゼイン希釈1:2,000またはマウス抗βアクチン希釈1:1,000(材料表参照)。
   11. TBSTで3倍、毎回5分洗います。
   12. 二次抗体を加えて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ロバ抗ヤギ1:2,500、またはHRPリンク馬抗マウス抗体を1:10,000希釈した。
   13. TBSTで3倍、毎回5分洗います。
   14. メーカーの指示に従って膜にECL試薬を追加します(材料表を参照)。

3. EHSマトリックスにおけるEpH4細胞のめっきと3D成長

注: マトリックスは温度 <10 °C で液体で、上記の温度では固体です。80 °Cで保管してください。使用前の夜に4°Cで解凍します。取り扱い前に-20°Cで組織培養プレートとピペットチップを前冷させ、マトリックス、プレート、ピペットチップを氷の上に置いて固化を防ぎます。

1. 10% FBS および 5 μg/mL インスリンを用いて、RPMI-1640 培地で EpH4 細胞を 2D で成長させます (EGF は必要ありません)。
2. 10%(v/v,3,500 μL)または20%(v/v 2,000 μL)のマトリックスを2つの50 mL円錐形チューブに添加したEpH4成長培地を調製します。使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。
3. 150 μLの未希釈マトリックスを備えた24ウェルプレートの10ウェル(各^1cm2)をコートします。ピペットチップを使用してマトリックスを広げます。泡を作成しないでください。プレートを水平に保持したまま、プレートの側面を軽くタップして、マトリックスがウェルの底面に均等に分布していることを確認します。
4. 24ウェルプレートを37°Cで1時間インキュベートし、マトリックスが固化できるようにします。
5. HC11細胞について上記のようにEpH4細胞をトリプシン化し、それらをヘモサイトメーターでカウントする。ウェルあたり5 x 10⁴細胞を1.5 mLの無菌円錐形遠心チューブに移し、250 x gで5分間スピンします。
6. 慎重に媒体を吸引し、氷の上にチューブを置きます。
7. 氷上の円錐管を維持しながら、1 mLピペットチップを使用して20%マトリックスを添加したEpH4成長培地の350μLで細胞を再懸濁します。泡を避けてください。単一細胞懸濁液を確保することが重要である。
8. 底層マトリックスが固まったら(マトリックスはウェルの初期コーティングと比較して半透明で明るい色に見える)、各コーティングされた井戸に350μLの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層が固化できるように37°CのCO₂インキュベーターに〜1時間置きます。
   1. 4xの目的と位相コントラストの下で細胞を微小観察する。単一のセルが表示されている必要があります。
9. 20%マトリックスに懸濁した350μLの細胞の上に10%マトリックスを含む200μLのEpH4培地を加える。37 °Cでインキュベート。

4. 3Dで増殖したEpH4細胞の分化誘導 (図2)

注:分化に加えて、EpH4細胞は、3D培養でHGF(肝細胞増殖因子)で刺激された場合、尿細管形成を受けることもできます。管外増殖はHIPおよびHGF刺激の10日後に見ることができる。

1. マトリックス内でめっき後1日目にEpH4細胞の分化誘導を開始する。プラスチックピペットチップを使用して、10%マトリックスを含む150μLの上部培地をウェルから慎重に取り除きます。HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地を200μL追加します。
2. 最大 10 日間、2 日ごとに 10% マトリックス HIP 培地を交換してください。HIPを使用せずに、同じ10%マトリックス培地でコントロールセルを成長させます。
3. 位相コントラストの下でマモスフィアの形成を監視します(図3A、下部パネル)。

5. 3Dで増殖したEpH4細胞の卵管形成誘導 (図3Aおよび3C)

1. ステップ 3.1 ~3.9 で詳しく説明されているように、24 個のウェルプレートと EpH4 細胞をマトリックスで成長させる準備をします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日、プラスチックピペットチップを用いて10%マトリックスを含むEpH4培地の150μLをウェルから除去する。10% マトリックス、HIP、および 20 ng/mL HGF を含む EpH4 培地を 200 μL 追加します (材料表を参照)。
2. 10% マトリックス/HIP/HGF 培地を 2 日ごとに 12 ~14 日まで交換します。
3. 20x または 40x の目的を使用して細管の形成を顕微鏡的に監視します (図 3A、 右パネル)。

6. 分化の定量:β-カゼイン用ウェスタンブロッティング

1. 井戸から10%マトリックスHIP培地を慎重にピペットオフ。20%マトリックス層2xを350μLの氷冷PBSでリンスします。回転楕円体は、マトリックス層に存在している必要があります。
2. 1 mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を備えた700~1,000μLの氷冷PBSを直接ウェルに加えます。ピペットチップでウェルから100%マトリックスの底層を静かに取り外し、その層に存在する回転楕円体を回収します。4°Cで30分間やさしく振ります。
3. 回転楕円管の懸濁液を円錐形の管に注意深く移します。500 μLのPBS-EDTAでウェルをリンスし、ウェル内の残りの回転楕円体を回収し、円錐形のチューブに加えます。
4. さらに30分間氷上でロックします。マトリックスが完全に溶解していることを確認してください。可視マトリックスの束が見られる場合は、PBS-EDTA を追加するか、長く振ります。
5. 350 x gで 5 分間回転楕円体をペレットにする溶液を遠心分離します。
6. 上清を吸引し、氷冷リシス緩衝液中のスフェロイドをリスピー化し、および¹⁶以上のステップ2.5のようにウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAP用プローブを用いる。一次抗体として、ヤギの抗β-カゼイン希釈1:2,000、ウサギ抗サイクリンD1希釈1:2,000、マウス抗p120希釈1:2,000を使用してください。二次抗体の場合は、HRPリンクロバ抗ヤギ希釈1:2,500、HRPリンクロバ抗ウサギ希釈1:2,500、HRPリンク馬抗マウス希釈1:10,000を使用してください。

結果

上皮細胞とアディポサイトの分化にはカドヘリン²の合流と関与が必要とすることが長い間知られている。我々および他の人々は、E-またはN-カドヘリンおよびカドヘリン-11の細胞間接着および関与を実証した。 培養細胞の合流と同様に、小さなGTPases Racおよび細胞分裂制御タンパク質42(Cdc42)の活性の劇的な増加を引き起こし、このプロセスはインターロイキン6(IL6)ファミリ?...

ディスカッション

HC11細胞は、新生物の形質転換と共に分化の研究に理想的に適しています。さらに、HC11細胞はMo-MLVベースのレトロウイルスベクターに容易に感染し、様々な遺伝子を発現できることが利点です。私たちの手では、EpH4細胞はHC11²よりも同じレトロウイルスベクターに感染することがより困難であった。

細胞間接触および増殖停止は、HC11細胞分化のための?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution	Bio Rad	1610154	Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody	rabbit, Santa Cruz	sc-717	Western Blotting
Anti-p120 antibody	mouse, Santa Cruz	sc-373751	Western Blotting
Anti-β actin antibody	mouse, Cell Signalling technology	3700	Western Blotting
Anti-β casein antibody	goat, Santa Cruz Biotechnology	sc-17971	Western Blotting
Aprotinin	Bio Shop	APR600	Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution	Sigma	B9643-1L-KC	Protein Determination
Bovine serum albumin	Bio Shop	ALB007.500	Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate	Bio Rad	170-5061	Western Blotting
Copper(II) sulphate	Sigma	C2284-25ML	Protein Determination
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306	Staining
Digitonin	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	14952-500	Staining
EDTA	Bio Shop	EDT001.500
Epidermal Growth Factor	Sigma	E9644	Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum	PAA	A15-751	Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP	Santa Cruz	SC-2004	Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant	Gibco	PHG0321
Hepes	Sigma	7365-45-9	Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP	Cell Signalling Technology	7076	Western Blotting
Hydrocortisone	Sigma	H0888	HIP Medium
insulin	Sigma	I6634	HIP Medium
Laminar-flow hood	BioGard Hood		Cell Culture
Leupeptin	Bio Shop	LEU001.10	Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)	Corning	CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP	Santa Cruz	sc-8360	Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd	475904-100GM	Staining
Multi-photon confocal microscope	Leica TCS SP2
Na3VO4	Bio Shop	SOV850	Lysis Buffer
Na4P207	Sigma	125F-0262	Lysis Buffer
NaCl	Bio Shop	SOD001.1	Western Blotting
NaF	Fisher Scientific	7681-49-4	Lysis Buffer
Nikon digital Camera	Coolpix 995
Nitrocellulose	Bio Rad	1620112	Western Blotting
NP-40	Sigma	9016-45-9
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	Staining
Phase Contrast Microscope	Olympus IX70		Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride	Sigma	329-98-6	Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V	Addgene	14567
Prolactin	Sigma	L6520	HIP Medium
RPMI-1640	Sigma	R8758	Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35	Sarstedt	83.3900.	Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well	Sarstedt	83.1836.300	Cell Culture
Transfer Apparatus	CBS Scientific Co	EBU-302	Western Blotting
Tris Acetate	Bio Shop	TRA222.500	Western Blotting
Trypsin	Sigma	9002-07-7.	Cell Culture
Tween-20	Bio Shop	TWN510.500	Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System	CBS Scientific Co	MGV-202-33	Western Blotting