分散（Ex Vivo）的毛骨球模型，去除了除位肌肉，用于在膀胱填充期间直接进入苏布罗氦

摘要

无分泌物的膀胱模型允许直接进入亚尿层，以研究在尿液储存和排空期间调节亚尿层/拉米纳尿体中生物活性介质可用性的本地机制。制备与填充完整膀胱非常相似，允许在无系统影响的情况下进行压力体积研究。

摘要

先前的研究已经确定，在静水压力变化、拉伸、细胞肿胀或阻力时，在静水压力变化、拉伸、细胞肿胀或阻力时，以及气囊流明在填充结束时，从扁平膀胱粘液片中释放化学物质，暴露于静水压力或机械拉伸的变化中，并暴露于培养的泌尿细胞中。这些发现导致假设，这些介质也被释放在子尿层（SubU）/拉米纳丙酸（LP）在膀胱填充，其中他们影响细胞深在膀胱壁，最终调节膀胱兴奋性。此类研究中至少有两个明显的局限性:1） 这些方法均未提供有关子U/LP 中调解员存在的直接信息;2） 使用的刺激不是生理上的，并且不重述膀胱的真实填充。在这里，我们讨论一个程序，使直接访问膀胱粘液的亚尿道表面在膀胱填充过程中。我们创造的无鼠排骨制剂与完整膀胱的填充非常相似，允许在没有来自脊柱反射和分离肌的混淆信号的情况下，对膀胱进行压力体积研究。使用新型无分子膀胱模型，我们最近证明，在膀胱填充过程中，不能将介质的宫内测量用作 SubU/LP 中释放或存在的物的代理。该模型能够检查在膀胱填充过程中释放、代谢产生和/或输送到SubU/LP的泌尿衍生信号分子，以将信息传输到膀胱的神经元和平滑肌，并调节其在节制和气动过程中的兴奋性。

引言

此模型的目的是使膀胱粘膜在膀胱填充的不同阶段能够直接进入下粘膜侧。

膀胱在填充过程中必须避免过早收缩，当达到临界体积和压力时，膀胱必须避免过早收缩。尿液异常的失禁或空位经常与膀胱填充过程中分度平滑肌（DSM）的异常兴奋性有关。DSM 的可兴奋性由平滑肌细胞固有的因素和膀胱壁内不同细胞类型产生的影响决定。膀胱壁由尿道（粘液）、亚尿体（SubU）/拉米纳利普里亚（LP）、德特鲁索平滑肌（DSM）和塞罗萨（图1A）组成。尿体由伞状细胞（即尿体最外层）、中间细胞和基底细胞（即尿体最内层）组成。各种类型的细胞，包括间质细胞、成纤维细胞、神经终端、小血管和免疫细胞都驻留在SubU/LP中。人们普遍认为膀胱尿毒症是一种感觉器官，通过将介质释放到影响SubU/LP和DSM^1、2、3的细胞的亚粘体中，启动反射性粘动和节制。在大多数情况下，这些假设基于已经证明释放介质的研究:从暴露于静水压力变化的粘液^片4，5;从培养的尿毒细胞暴露到^{拉伸6，7，}低度引起的细胞^肿胀7或^阻力8;从分离的膀胱壁条受体或神经激活9，10，11，12，13，14;并在膀胱流明在膀胱填充结束15，16，17，18，19。虽然这些研究有助于证明在机械刺激膀胱壁段或培养的泌尿细胞时释放介质，但它们需要有直接证据支持，以释放通过复制膀胱填充的生理刺激引起的子粘膜中介质的释放。这是一项具有挑战性的任务，因为 SubU/LP 位于膀胱壁深处，妨碍在膀胱填充过程中直接进入 SubU/LP 附近。

在这里，我们演示一个分散（前体）鼠膀胱模型与去皮肌肉^去除13，这是开发，以促进研究局部机制的中导转导，参与膀胱尿，DSM和膀胱壁的其他细胞类型之间的信号。这种方法优于使用扁平膀胱壁片、膀胱壁带或培养的泌尿细胞，因为它允许在SubU/LP附近直接测量尿毒源介质，这些介质是因膀胱中的生理压力和体积而释放或形成的，并避免细胞培养中潜在的表型变化。它可用于测量子U/LP中调解员在膀胱填充的不同阶段的可用性、释放、代谢和横射物传输（图1B）。该制剂还可用于检查过度活跃和不足的膀胱综合征模型中的泌尿信号和中导转导。

研究方案

本手稿中描述的涉及动物的所有程序均按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》和内华达大学机构动物使用与护理委员会进行。

注:此处介绍的模型包括去除除精肌肉，而尿道和SubU/LP保持完好（图1B），使调查人员在膀胱填充过程中直接访问SubU/LP。

1. 解剖无除气囊准备

1. 将分离的膀胱放入充满冷 （10 °C） 的解剖盘中，用 5% CO₂/95 % O₂克雷布斯碳酸氢盐溶液 （KBS） 进行氧化，具有以下组合物 （mM）: 118.5 NaCl， 4.2 KCl， 1.2 MgCl_2，23.8 NaHCO_3，1.2 KH₂PO_4，11.0 分丝蔗， 1.8_钙2 （pH 7.4）¹³.
2. 将隔离膀胱圆顶的一小部分固定到塞加德覆盖的充满 KBS 的解剖盘中。确保销穿过一块 serosa 或离子/LP 的肌肉最内侧远离的肌肉的最内边缘最外边缘。
3. 使用显微镜，识别尿道和输尿管，并将其分别固定在解剖盘的底部。
4. 去除多余的脂肪和结缔组织，以便显示膀胱的整个主体、尿道和两个输尿管。
5. 用6-0尼龙缝合线连接输尿管。然后，将输尿管的开端固定到解剖盘的底部，以确保准备。
6. 使用细尖钳子，轻轻地拉一块塞罗萨在输尿管和膀胱体之间的角落。
7. 调整显微镜的光线以增加透明度，并区分下半角肌的底数。
8. 开始切割 （不剥！ ） 沿装饰肌肉层的内表面用细尖剪刀切割 （不剥！） 膀胱壁，同时轻轻地将切段从准备中拉开。在任何时候，确保可以看到粘巴的侧边，避免接触它。
9. 通过转动解剖盘完全去除分离肌，使准备的位置舒适，继续解剖出分离肌。
10. 在膀胱圆顶顶部留下一小块除位肌，以确保在协议的剩余步骤中固定制剂的能力。
11. 做一个6-0尼龙线的双环，放在膀胱准备的脖子上，让环松弛。
12. 加入6-0丝线的第二双环，将其放在膀胱准备的脖子上，让循环丢失。有两个缝合线可以防止缝合线周围泄漏。
13. 切割约 2 厘米的 20 PE 管（导管），通过缓慢移动接近火焰的尖端来燃起尖端。
14. 用热 （37 °C） 含氧 KBS 填充导管。
15. 将导管插入膀胱尿道的孔中，轻轻推导管，直到导管尖端大约到达膀胱中间。
16. 将缝合线系在导管和膀胱颈部周围组织周围。
17. 缓慢地向膀胱填充约 50-100 μL 的加热 （37°C） 含氧 KBS，将其短暂提升（+lt;10 s）以上，并监测缝合线和膀胱体有无泄漏。
18. 如果未发现泄漏，则准备进行实验。如果观察到缝合线周围有泄漏，则取出缝合线并更换。如果发现膀胱体孔泄漏，请丢弃制剂。

2. 填充脱阴囊准备

1. 将 KBS （37 °C） 注入具有 Sylgard 底部的水 （37 °C） 夹套器官盘的 3 mL 腔室中。
2. 调整氧气和吸入管路。
3. 将脱损膀胱制剂放入腔室中。
4. 将导管固定在腔室的一侧，使制备物不会浮在灌注溶液表面上方。
5. 使用相同尺寸的接头将膀胱导管连接到连接到三向止油管的较长 PE20 管（输液管）。
6. 确保输液泵、压力传感器和气囊之间的管路打开。
7. 在输液注射器中填充新鲜、温暖（37°C）和含氧KBS。
8. 调整泵参数:注射器的类型/体积（即1 mL）、操作（即注入）、流量（即常数）和流速（即15 μL/min）。
9. 按注射器泵上的"开始"按钮以填充膀胱。
10. 在膀胱填充过程中监测填充量和静脉内压力。

3. 检测脱阴囊制剂的子U/LP方面中的调解员

1. 将沐浴溶液的等分收集到冰冷的微离心管或高性能液相色谱 （HPLC） 刀片中。
2. 根据适当的检测应用准备和处理样品。在检测紫菜可用性的情况下，用荧光^{检测13、18}处理HPLC的样品。

结果

无鼠排叶的膀胱制剂壁完好无损，包含除 DSM 和 Serosa 外的所有层。原理证明研究表明，无DSM的膀胱壁包括尿道和SubU/LP，而图尼卡肌肉和serosa则不存在（图2）13。

无分子膀胱的填充近似于正常膀胱填充。图3显示了以不同填充速率、体积和宫内压力填充体外?...

讨论

膀胱有两个功能:尿液的储存和排空。这些功能的正常运行需要通过膀胱壁中的细胞对宫内体积和压力和信号进行适当的机械感应，以调节突生肌肉的兴奋性。膀胱粘液（尿毒症）被认为通过释放SubU/LP中影响膀胱壁中多种细胞类型的多种信号分子来调节膀胱兴奋性。目前，大多数对泌尿原介质的表征尝试涉及使用不繁殖生理膀胱填充的膀胱制剂（例如，扁平膀胱壁片、膀胱壁条或培养细胞）。膀?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	Fisher	C79	Source flexible
Dextrose	Fisher	D16	Source flexible
Dissecting pins	Fine Science Tools	26002-20	Source flexible
Infusion Pump	Kent Scientific	GenieTouch	Source flexible
KCl	Fisher	P217	Source flexible
KH2PO4	Fisher	P284	Source flexible
Light source	SCHOTT ACEI		Source flexible
Microscope	Olympus SZX7		Flexible to use any scope
MgCl2	Fisher	M33	Source flexible
NaCl	Fisher	S671	Source flexible
NaHCO3	Fisher	S233	Source flexible
Needles 25G	Becton Dickinson	305122	Source flexible
Organ bath	Custom made		Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing	Intramedic	427405	Source flexible
Pressure transducer	AD instrument		Source flexible
S&T Forceps	Fine Science Tools	00632-11	Source flexible
Software pressure-volume	AD Instruments	Power lab
Suture Nylon, 6-0	AD surgical	S-N618R13	Source flexible
Suture Silk, 6-0	Deknatel via Braintree Scientific, Inc.	07J1500190	Source flexible
Syringes 1 ml	Becton Dickinson	309602	Source flexible
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Source flexible
Water circulator	Baxter	K-MOD 100	Source flexible