Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga

Resumo

O modelo de bexiga livre de detrusor permite o acesso direto ao suburotelio para estudar os mecanismos locais de regulação da disponibilidade de mediadores biologicamente ativos na propria suburotelio/laminado durante o armazenamento e a anulação da urina. A preparação assemelha-se pròxima ao enchimento de uma bexiga intata e permite que os estudos do pressão-volume sejam executados sem influências sistemáticas.

Resumo

Estudos anteriores estabeleceram a liberação de substâncias químicas de folhas de mucosa de bexiga plana afixadas nas câmaras de Ussing e expostas a mudanças na pressão hidrostática ou alongamento mecânico e de células urotelia cultivadas após alterações de pressão hidrostática, alongamento, inchaço celular ou forças de arrasto, e em lúmen da bexiga no final do enchimento. Tais achados levaram à suposição de que esses mediadores também são liberados em suburotelio (SubU)/lamina propria (LP) durante o enchimento da bexiga, onde afetam as células profundas na parede da bexiga para, em última análise, regular a excitabilidade da bexiga. Há pelo menos duas limitações óbvias em tais estudos: 1) nenhuma dessas abordagens fornece informações diretas sobre a presença de mediadores em SubU/LP, e 2) os estímulos utilizados não são fisiológicos e não recapitulam o preenchimento autêntico da bexiga. Aqui, discutimos um procedimento que permite o acesso direto à superfície suburotelial da mucosa da bexiga no decorrer do enchimento da bexiga. A preparação livre de intrusão de urina que criamos se assemelha ao enchimento da bexiga intacta e permite que estudos de volume de pressão sejam realizados na bexiga na ausência de sinalização confusa de reflexos espinhais e músculos suaves destruor. Usando o modelo de bexiga livre de detrusor, demonstramos recentemente que medições intravesivas de mediadores não podem ser usadas como um proxy para o que foi lançado ou presente no SubU/LP durante o enchimento da bexiga. O modelo permite o exame de moléculas de sinalização derivadas de urotelium que são liberadas, geradas pelo metabolismo e/ou transportadas para o SubU/LP durante o recheio da bexiga para transmitir informações aos neurônios e músculos lisos da bexiga e regular sua excitabilidade durante continência e micturição.

Introdução

O objetivo deste modelo é permitir o acesso direto ao lado submucosato da mucosa da bexiga durante diferentes fases do enchimento da bexiga.

A bexiga deve abster-se de contração prematura durante o enchimento e vazio quando o volume crítico e a pressão são alcançados. Continência anormal ou voiding da urina são freqüentemente associados com excitabilidade anormal do músculo liso detrusor (DSM) no curso do enchimento da bexiga. Excitabilidade do DSM é determinada por fatores intrínsecos às células musculares lisas e por influências geradas por diferentes tipos de células dentro da parede da bexiga. A parede da bexiga urinária consiste em urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo suave detrusor (DSM) e serosa (Figura 1A). O urotelio consiste em células guarda-chuva (ou seja, a camada mais externa do urotelio), células intermediárias e células basais (ou seja, a camada mais interna do urotelio). Vários tipos de células, incluindo células intersticiais, fibroblastos, terminais nervosos aferentes, pequenos vasos sanguíneos e células imunes residem no SubU/LP. É amplamente assumido que o urotelio da bexiga é um órgão sensorial que inicia mictura e continência reflexa, liberando mediadores na submucosa que afetam as células do SubU/ LP e do DSM^1,2,3. Para a maior parte, tais pressupostos são baseados em estudos que demonstraram liberação de mediadores: a partir de pedaços de mucosa expostos a mudanças na pressão hidrostática^4,5; de células uroteliais cultivadas expostas ao trecho^6,7,célulainduzida pela hipotonicidade inchando⁷ ou forças de arrasto^8; de tiras de parede da bexiga isoladas sobre receptor ou ativação nervosa^{9,10,11,12,13,14;} e na bexiga lúmen no final da bexiga enchimento^{15,16,17,18,19}. Embora tais estudos foram fundamentais para demonstrar a liberação de mediadores sobre a estimulação mecânica de segmentos da parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas, eles precisam ser apoiados por evidências diretas para a liberação de mediadores na submucosa que é eliciada por estímulos fisiológicos que reproduzem o enchimento da bexiga. Esta é uma tarefa desafiadora, dado que o SubU / LP está localizado no fundo da parede da bexiga dificultando o acesso direto à vizinhança de SubU / LP durante o enchimento da bexiga.

Aqui, ilustramos um modelo descentralizado (ex vivo) da bexiga da urina com o músculo detrusor removido¹³ que foi desenvolvido para facilitar estudos nos mecanismos locais do mechanotransduction que participam na sinalização entre o urothelium da bexiga, dSM e outros tipos da pilha na parede da bexiga. Esta abordagem é superior ao uso de folhas de parede da bexiga plana, tiras de parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas porque permite medições diretas nas proximidades de SubU/LP de mediadores derivados de urotelium que são liberados ou formados em resposta a pressões fisiológicas e volumes na bexiga e evita possíveis mudanças fenotípicas na cultura celular. Ele pode ser usado para medir a disponibilidade, liberação, metabolismo e transporte transurotelial de mediadores em SubU/LP em diferentes estágios de enchimento da bexiga (Figura 1B). A preparação também pode ser usada para examinar a sinalização urotelial e mechanotransdução em modelos de síndromes da bexiga hiperativa e subativa.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e o Institutional Animal Use and Care Committee da Universidade de Nevada.

NOTA:O modelo aqui apresentado consiste na remoção do músculo detrusor, enquanto o urotelio e SubU/LP permanecem intactos(Figura 1B)para permitir aos investigadores o acesso direto ao SubU/LP no decorrer do enchimento da bexiga.

1. Dissecação da Preparação da Bexiga Livre de Detrusor

1. Coloque a bexiga isolada em um prato de dissecação cheio de frio (10 °C) e oxigenado com 5% co₂/95 % O₂ Krebs bicarbonato solução (KBS) com a seguinte composição (mM): 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl_2,23.8 NaHCO_3,1.2 KH₂PO_4,11.0 dextrose, 1.8 CaCl₂ (pH 7.4)¹³.
2. Pine uma pequena parte da cúpula da bexiga isolada para um prato de dissecação coberto de Sylgard preenchido com KBS. Certifique-se de que o pino passa por um pedaço da serosa ou a borda mais externa do músculo detrusor longe da borda mais interna do músculo que enfrenta o SubU / LP.
3. Usando um microscópio, identifique a uretra e os ureteres e fixe cada um deles à parte inferior do prato de dissecação.
4. Retire o excesso de tecidos adiposos e conjuntivos para que todo o corpo principal da bexiga, a uretra e ambos os ureteres sejam exibidos.
5. Amarre os ureteres com suturas de nylon 6-0. Em seguida, fixar as extremidades abertas de ureters para o fundo do prato de dissecação para garantir a preparação.
6. Usando fórceps de ponta fina, puxe suavemente um pedaço da serosa no canto entre o ureter e o corpo da bexiga.
7. Ajuste a luz do microscópio para aumentar a transparência e distinguir a margem da submucosa o músculo detrusor.
8. Comece a cortar(não descascar!) a parede da bexiga com tesoura de ponta fina ao longo da superfície interna da camada muscular detrusor, enquanto suavemente puxando o segmento de corte longe da preparação. Em todos os momentos, garantir que a borda lateral da mucosa pode ser visto e evitar tocá-lo.
9. Retire o músculo detrusor inteiramente, virando o prato de dissecação para que a posição da preparação é confortável para continuar dissecando o músculo detrusor.
10. Deixe um pequeno pedaço de músculo detrusor no topo da cúpula da bexiga para garantir a capacidade de imobilizar a preparação durante as etapas restantes do protocolo.
11. Faça um laço duplo de 6-0 fio de nylon, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço solto.
12. Adicione um segundo laço duplo de 6-0 fio de seda, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço perder. Ter duas suturas impede vazamentos em torno das suturas.
13. Corte cerca de 2 cm de tubos de 20 PE (cateter), incendiar a ponta, movendo-se lentamente a ponta perto de uma chama.
14. Encha o cateter com KBS oxigenado quente (37°C).
15. Insira o cateter no orifício da uretra da bexiga e empurre suavemente o cateter até que a ponta do cateter atinja aproximadamente o meio da bexiga.
16. Amarre a sutura ao redor do cateter e o tecido circundante do pescoço da bexiga.
17. Lentamente encher a bexiga com cerca de 50-100 μL de quente (37 °C) KBS oxigenado, levantá-lo brevemente (<10 s) acima da superfície do KBS, e monitorar vazamentos nas suturas e corpo da bexiga.
18. Se nenhum vazamento for observado, a preparação está pronta para o experimento. Se um vazamento em torno da sutura é observada, retire a sutura e substituí-lo. Se um vazamento de um buraco no corpo da bexiga é notado, descartar a preparação.

2. Enchimento da preparação da bexiga desnudada

1. Perfuse KBS (37 °C) em uma câmara de 3 mL de um prato de órgão regado de água (37 °C) com um fundo Sylgard.
2. Ajuste as linhas de oxigênio e sucção.
3. Coloque a preparação da bexiga desnudada na câmara.
4. Fixe o cateter para o lado da câmara para que a preparação não flutue acima da superfície da solução de perfusão.
5. Ligue o cateter da bexiga a uma tubulação PE20 mais longa (linha de infusão) conectada à torneira de três vias usando o mesmo tamanho.
6. Certifique-se de que as linhas entre a bomba de infusão, o transdutor de pressão e a bexiga estão abertas.
7. Encha a seringa de infusão com KBS fresco, quente (37 °C) e oxigenado.
8. Ajuste os parâmetros da bomba: tipo/volume de seringa (ou seja, 1 mL), operação (ou seja, Infusível), fluxo (ou seja, constante) e taxa de fluxo (ou seja, 15 μL/min).
9. Pressione o botão Iniciar na bomba de seringa para encher a bexiga.
10. Monitore o volume de enchimento e a pressão intravesa durante o enchimento da bexiga.

3. Detecção de mediadores no aspecto SubU/LP da preparação da bexiga desnudada

1. Colete alíquotas da solução de banho em tubos de microcentrífuga sem gelo ou inserções de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
2. Prepare e processe as amostras de acordo com a aplicação de detecção apropriada. No caso da detecção da disponibilidade de purina, processe as amostras por HPLC com detecção de fluorescência^13,18.

Resultados

A parede da preparação da bexiga livre de detritos e urina está intacta e contém todas as camadas, exceto o DSM e a serosa. Estudos de prova de princípio demonstraram que a parede da bexiga livre de DSM inclui urotelium e SubU/LP, enquanto a tunica muscular e a serosa estão ausentes (Figura 2)¹³.

O enchimento da bexiga livre de detrusor aproxima-se do enchiment...

Discussão

A bexiga tem duas funções: armazenamento e voiding da urina. O funcionamento normal dessas funções requer sensoriamento mecânico adequado de volume e pressão intralumínio e transdução de sinais através de células na parede da bexiga para regular a excitabilidade muscular detrusora. Acredita-se que a mucosa da bexiga (urotelio) regule a excitabilidade da bexiga, liberando uma variedade de moléculas de sinalização no SubU/LP que afetam vários tipos de células na parede da bexiga. Atualmente, a maioria das t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	Fisher	C79	Source flexible
Dextrose	Fisher	D16	Source flexible
Dissecting pins	Fine Science Tools	26002-20	Source flexible
Infusion Pump	Kent Scientific	GenieTouch	Source flexible
KCl	Fisher	P217	Source flexible
KH2PO4	Fisher	P284	Source flexible
Light source	SCHOTT ACEI		Source flexible
Microscope	Olympus SZX7		Flexible to use any scope
MgCl2	Fisher	M33	Source flexible
NaCl	Fisher	S671	Source flexible
NaHCO3	Fisher	S233	Source flexible
Needles 25G	Becton Dickinson	305122	Source flexible
Organ bath	Custom made		Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing	Intramedic	427405	Source flexible
Pressure transducer	AD instrument		Source flexible
S&T Forceps	Fine Science Tools	00632-11	Source flexible
Software pressure-volume	AD Instruments	Power lab
Suture Nylon, 6-0	AD surgical	S-N618R13	Source flexible
Suture Silk, 6-0	Deknatel via Braintree Scientific, Inc.	07J1500190	Source flexible
Syringes 1 mL	Becton Dickinson	309602	Source flexible
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Source flexible
Water circulator	Baxter	K-MOD 100	Source flexible