Un modèle de vessie murine décentralisé (Ex Vivo) avec le muscle detrusor enlevé pour l'accès direct au Suburothelium pendant le remplissage de la vessie

Résumé

Le modèle de vessie sans detrusor permet un accès direct au suburothélium pour étudier les mécanismes locaux de régulation de la disponibilité du médiateur biologiquement actif dans le suburothélium/lamina propria pendant le stockage et l'annulation de l'urine. La préparation ressemble étroitement au remplissage d'une vessie intacte et permet d'effectuer des études de volume de pression sans influences systémiques.

Résumé

Des études antérieures ont établi la libération de substances chimiques à partir de feuilles de muqueuse de la vessie plate apposées dans les chambres ussing et exposées à des changements dans la pression hydrostatique ou extensible mécanique et des cellules urothéliales cultivées sur les changements de pression hydrostatique, extensible, gonflement cellulaire, ou les forces de traînée, et dans le lumen de la vessie à la fin du remplissage. Ces résultats ont mené à l'hypothèse que ces médiateurs sont également libérés dans suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) pendant le remplissage de réservoir souple, où ils affectent des cellules profondément dans la paroi de réservoir souple pour finalement régler l'excitabilité de réservoir souple. Il y a au moins deux limites évidentes dans ces études : 1) aucune de ces approches ne fournit d'informations directes sur la présence de médiateurs dans SubU/LP, et 2) les stimuli utilisés ne sont pas physiologiques et ne récapitulent pas le remplissage authentique de la vessie. Ici, nous discutons d'une procédure qui permet un accès direct à la surface suburothéliale de la muqueuse de la vessie au cours du remplissage de la vessie. La préparation sans détruseur de murine que nous avons créée ressemble étroitement au remplissage de la vessie intacte et permet d'effectuer des études de volume de pression sur la vessie en l'absence de signalisation confondante des réflexes spinaux et du muscle lisse de détruseur. En utilisant le nouveau modèle de vessie sans détrusive, nous avons récemment démontré que les mesures intravesical des médiateurs ne peuvent pas être utilisées comme un proxy à ce qui a été libéré ou présent dans le SubU/LP pendant le remplissage de la vessie. Le modèle permet d'examiner les molécules de signalisation dérivées de l'urothélium qui sont libérées, générées par le métabolisme et/ou transportées dans le SubU/LP au cours du remplissage de la vessie pour transmettre des informations aux neurones et au muscle lisse de la vessie et réguler son excitabilité pendant la continence et la micturition.

Introduction

Le but de ce modèle est de permettre un accès direct au côté submucosal de la muqueuse de la vessie pendant différentes phases de remplissage de la vessie.

La vessie doit s'abstenir de contraction prématurée pendant le remplissage et vider lorsque le volume critique et la pression sont atteints. La continence anormale ou l'annulation de l'urine sont fréquemment associées à une excitabilité anormale du muscle lisse du détruseur (DSM) au cours du remplissage de la vessie. L'excitabilité du DSM est déterminée par des facteurs intrinsèques aux cellules musculaires lisses et par des influences générées par différents types de cellules dans la paroi de la vessie. La paroi de la vessie urinaire se compose d'urothelium (mucosa), de suburothélium (SubU)/lamina propria (LP), de muscle lisse detrusor (DSM) et de sérosa (figure 1A). L'urothélium se compose de cellules parapluie (c.-à-d. la couche la plus externe de l'urothélium), de cellules intermédiaires et de cellules basales (c.-à-d., la couche la plus interne de l'urothélium). Divers types de cellules, y compris les cellules interstitielles, les fibroblastes, les terminaux nerveux afférents, les petits vaisseaux sanguins et les cellules immunitaires résident dans le SubU/LP. Il est largement supposé que l'urothélium de la vessie est un organe sensoriel qui initie la micturition réflexe et la continence en libérant des médiateurs dans le submucosa qui affectent les cellules dans le SubU / LP et le DSM^1,2,3. Pour la plupart, ces hypothèses sont basées sur des études qui ont démontré la libération de médiateurs: à partir de morceaux de muqueuse exposés à des changements de pression hydrostatique^4,5; à partir de cellules urothéliales cultivées exposées à l'étirement^6,7, gonflement des cellules induite par l'hypotonie⁷ ou forces de traînée^8; des bandes isolées de paroi de réservoir souple sur l'activation^derécepteur ou de nerf 9^{,10,11,12,13,14}; et dans le lumen de réservoir souple à la fin du remplissage de réservoir souple^{15,16,17,18,19}. Bien que ces études aient été déterminantes pour démontrer la libération de médiateurs lors de la stimulation mécanique des segments de la paroi de la vessie ou des cellules urothéliales cultivées, elles doivent être étayées par des preuves directes de la libération de médiateurs dans la sous-muqueuse qui sont obtenues par des stimuli physiologiques qui reproduisent le remplissage de la vessie. Il s'agit d'une tâche difficile étant donné que le SubU /LP est situé profondément dans la paroi de la vessie entraver l'accès direct à proximité de SubU / LP pendant le remplissage de la vessie.

Ici, nous illustrons un modèle décentralisé (ex vivo) de réservoir souple murine avec le muscle detrusor enlevé¹³ qui a été développé pour faciliter des études sur les mécanismes locaux de la méchanotransduction qui participent à la signalisation entre l'urothelium de la vessie, DSM et d'autres types de cellules dans la paroi de la vessie. Cette approche est supérieure à l'utilisation de feuilles plates de la paroi de la vessie, de bandes de paroi vésicale ou de cellules urothéliales cultivées, car elle permet des mesures directes à proximité de SubU/LP de médiateurs dérivés de l'urothélium qui sont libérés ou formés en réponse aux pressions physiologiques et aux volumes dans la vessie et évite les changements phénotypiques potentiels dans la culture cellulaire. Il peut être utilisé pour mesurer la disponibilité, la libération, le métabolisme et le transport transurothélial des médiateurs dans SubU/LP à différents stades de remplissage de la vessie (Figure 1B). La préparation peut également être employée pour examiner la signalisation urotheliale et la mécanotransduction dans des modèles des syndromes hyperactifs et underactifs de réservoir souple.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux décrits dans ce manuscrit ont été menées selon le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et le Institutional Animal Use and Care Committee de l'Université du Nevada.

REMARQUE: Le modèle présenté ici consiste en l'ablation du muscle du détruseur, tandis que l'urothélium et le SubU/LP restent intacts (figure 1B) pour permettre aux enquêteurs d'accéder directement au SubU/LP au cours du remplissage de la vessie.

1. Dissection de la préparation de la vessie sans détrusseur

1. Placer la vessie isolée dans un plat disséqué rempli de froid (10 oC) et oxygéné avec 5 % de CO₂/95 % O₂ Solution de bicarbonate Krebs (KBS) avec la composition suivante (mM) : 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl₂, 23.8 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl₂ (pH 7.4)¹³.
2. Épingler une petite partie du dôme de la vessie isolée à un plat de dissection recouvert de Sylgard rempli de KBS. Assurez-vous que la broche passe à travers un morceau de la sérose ou le bord le plus externe du muscle detrusor loin du bord le plus interne du muscle qui fait face à la SubU / LP.
3. À l'aide d'un microscope, identifier l'urètre et les uretères et épingler chacun d'eux au fond du plat disséquer.
4. Enlever l'excès d'adipeux et de tissus conjonctifs de sorte que l'ensemble du corps principal de la vessie, l'urètre et les deux ureters sont affichés.
5. Attachez les ureters avec des sutures en nylon 6-0. Ensuite, épinglez les extrémités ouvertes des ureters vers le fond du plat disséquant pour fixer la préparation.
6. À l'aide de forceps fins, tirez délicatement un morceau de serosa au coin entre l'uretère et le corps vésicaire.
7. Ajuster la lumière du microscope pour augmenter la transparence et distinguer la marge de la submucosa sous le muscle detrusor.
8. Commencez à couper(pas peler!) la paroi de la vessie avec des ciseaux à pointe fine le long de la surface intérieure de la couche musculaire detrusor tout en tirant doucement le segment de coupe loin de la préparation. En tout temps, assurez-vous que le bord latéral de la muqueuse peut être vu et éviter de le toucher.
9. Retirez entièrement le muscle du détruseur en retournant le plat disséquant de sorte que la position de la préparation soit confortable pour continuer à disséquer le muscle detrusor.
10. Laissez un petit morceau de muscle detrusor sur le dessus du dôme de la vessie pour assurer la capacité d'immobiliser la préparation pendant les étapes restantes du protocole.
11. Faire une double boucle de fil de nylon 6-0, le placer autour du cou de la préparation de la vessie, et laisser la boucle lâche.
12. Ajoutez une deuxième double boucle de fil de soie 6-0, placez-la autour du cou de la préparation de la vessie, et laissez la boucle perdre. Avoir deux sutures empêche les fuites autour des sutures.
13. Couper environ 2 cm de tube de 20 PE (cathéter), évaser la pointe en déplaçant lentement la pointe près d'une flamme.
14. Remplir le cathéter d'un KBS chaud (37 oC).
15. Insérez le cathéter dans l'orifice de l'urètre vésicale et poussez doucement le cathéter jusqu'à ce que la pointe du cathéter atteigne environ le milieu de la vessie.
16. Attachez la suture autour du cathéter et du tissu environnant du cou de la vessie.
17. Remplissez lentement la vessie d'environ 50 à 100 l de KBS oxygéné chaud (37 oC), soulevez-la brièvement (lt;10 s) au-dessus de la surface de KBS et surveillez les fuites aux sutures et au corps vésical.
18. Si aucune fuite n'est observée, la préparation est prête pour l'expérience. Si une fuite autour de la suture est observée, retirez la suture et remplacez-la. Si une fuite d'un trou dans le corps de la vessie est remarquée, jetez la préparation.

2. Remplissage de la préparation de la vessie dénudée

1. Perfuse KBS (37 oC) dans une chambre de 3 ml d'un plat d'orgue enveste d'eau (37 oC) avec un fond Sylgard.
2. Ajuster les lignes d'oxygène et d'aspiration.
3. Placez la préparation de la vessie dénudée dans la chambre.
4. Fixer le cathéter sur le côté de la chambre afin que la préparation ne flotte pas au-dessus de la surface de la solution de perfusion.
5. Connectez le cathéter de la vessie à un tube PE20 plus long (ligne d'infusion) relié au robinet d'arrêt à trois voies en utilisant le même ajustement de taille.
6. Assurez-vous que les lignes entre la pompe à perfusion, le transducteur de pression et la vessie sont ouvertes.
7. Remplissez la seringue d'infusion de KBS fraîche, chaude (37 oC) et oxygénée.
8. Ajuster les paramètres de la pompe : type/volume de seringue (c.-à-d. 1 mL), fonctionnement (c.-à-d. infuser), débit (c.-à-d. constant) et débit (c.-à-d. 15 l/min).
9. Appuyez sur le bouton Démarrer sur la pompe à seringues pour remplir la vessie.
10. Surveiller le volume de remplissage et la pression intravesicale pendant le remplissage de la vessie.

3. Détection des médiateurs dans l'aspect SubU/LP de la préparation de la vessie dénudée

1. Recueillir les aliquots de la solution de bain dans des tubes de microcentrifuge à froid ou des inserts de chromatographie liquide de haute performance (HPLC).
2. Préparer et traiter les échantillons selon l'application de détection appropriée. Dans le cas de la détection de la disponibilité de la purine, traiter les échantillons par HPLC avec la détection de fluorescence^13,18.

Résultats

La paroi de la préparation de la vessie sans détrusseur de murine est intacte et contient toutes les couches sauf le DSM et le sérosa. Des études de preuve de principe ont démontré que la paroi vésicale exempte de DSM comprend l'urothélium et le SubU/LP, tandis que les tunica muscularis et les sérosses sont absents (figure 2)¹³.

Le remplissage de la vessie s...

Discussion

La vessie a deux fonctions : le stockage et l'annulation de l'urine. Le fonctionnement normal de ces fonctions exige une bonne détection mécanique du volume et de la pression intraluminesses et la transduction des signaux à travers les cellules de la paroi de la vessie pour réguler l'excitabilité musculaire du détruseur. La muqueuse de la vessie (urothélium) est censée réguler l'excitabilité de la vessie en libérant une variété de molécules de signalisation dans le SubU/LP qui affectent de nombreux types de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	Fisher	C79	Source flexible
Dextrose	Fisher	D16	Source flexible
Dissecting pins	Fine Science Tools	26002-20	Source flexible
Infusion Pump	Kent Scientific	GenieTouch	Source flexible
KCl	Fisher	P217	Source flexible
KH2PO4	Fisher	P284	Source flexible
Light source	SCHOTT ACEI		Source flexible
Microscope	Olympus SZX7		Flexible to use any scope
MgCl2	Fisher	M33	Source flexible
NaCl	Fisher	S671	Source flexible
NaHCO3	Fisher	S233	Source flexible
Needles 25G	Becton Dickinson	305122	Source flexible
Organ bath	Custom made		Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing	Intramedic	427405	Source flexible
Pressure transducer	AD instrument		Source flexible
S&T Forceps	Fine Science Tools	00632-11	Source flexible
Software pressure-volume	AD Instruments	Power lab
Suture Nylon, 6-0	AD surgical	S-N618R13	Source flexible
Suture Silk, 6-0	Deknatel via Braintree Scientific, Inc.	07J1500190	Source flexible
Syringes 1 ml	Becton Dickinson	309602	Source flexible
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Source flexible
Water circulator	Baxter	K-MOD 100	Source flexible