Ein dezentralisiertes (Ex Vivo) Murine Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt für direkten Zugang zum Suburothelium während der Blasenfüllung

Zusammenfassung

Das detrusorfreie Blasenmodell ermöglicht den direkten Zugang zum Suburothel, um lokale Mechanismen zur Regulierung der biologisch aktiven Mediatorverfügbarkeit in Suburothelium/Lamina propria während der Lagerung und Leerung von Urin zu untersuchen. Das Präparat ähnelt dem Füllen einer intakten Blase und ermöglicht Druckvolumenstudien ohne systemische Einflüsse.

Zusammenfassung

Frühere Studien haben die Freisetzung chemischer Substanzen aus flachen Blasenschleimhautplatten, die in Ussing-Kammern angebracht und Veränderungen des hydrostatischen Drucks oder der mechanischen Dehnung und von kultivierten Urothelzellen bei hydrostatischen Druckänderungen, Dehnungs-, Zellschwellungs- oder Schleppkräften und in Blasenlumen am Ende der Füllung ausgesetzt sind, festgestellt. Solche Ergebnisse führten zu der Annahme, dass diese Mediatoren auch in Suburothelium (SubU)/Lamina propria (LP) während der Blasenfüllung freigesetzt werden, wo sie Zellen tief in der Blasenwand beeinflussen, um letztendlich die Blasenerregbarkeit zu regulieren. Es gibt mindestens zwei offensichtliche Einschränkungen in solchen Studien: 1) Keiner dieser Ansätze liefert direkte Informationen über das Vorhandensein von Mediatoren in SubU/LP, und 2) die verwendeten Reize sind nicht physiologisch und rekapitulieren nicht die authentische Füllung der Blase. Hier diskutieren wir ein Verfahren, das den direkten Zugang zur suburotheliale Oberfläche der Blasenschleimhaut im Verlauf der Blasenfüllung ermöglicht. Das murine detrusorfreie Präparat, das wir erstellt haben, ähnelt der Füllung der intakten Blase und ermöglicht druckvolumende Untersuchungen an der Blase in Ermangelung verwirrender Signale durch Wirbelsäulenreflexe und Detrusor-Glattmuskel. Anhand des neuartigen detrusorfreien Blasenmodells haben wir kürzlich gezeigt, dass intravesische Messungen von Mediatoren nicht als Proxy für das verwendet werden können, was während der Blasenfüllung im SubU/LP freigesetzt oder vorhanden ist. Das Modell ermöglicht die Untersuchung von urothelium-abgeleiteten Signalmolekülen, die freigesetzt, durch Stoffwechsel erzeugt und/oder im Laufe der Blasenfüllung in den SubU/LP transportiert werden, um Informationen an Neuronen und glatten Muskel der Blase zu übertragen und ihre Erregbarkeit während der Kontinenz und Micturition zu regulieren.

Einleitung

Der Zweck dieses Modells ist es, den direkten Zugang zur submukossalen Seite der Blasenschleimhaut während verschiedener Phasen der Blasenfüllung zu ermöglichen.

Die Blase muss auf eine vorzeitige Kontraktion während der Befüllung verzichten und entleeren, wenn kritisches Volumen und Druck erreicht werden. Abnormale Kontinenz oder Leerung des Urins sind häufig mit abnormaler Erregbarkeit des Detrusor glatten Muskels (DSM) im Laufe der Blasenfüllung verbunden. Die Erregbarkeit von DSM wird durch Faktoren bestimmt, die den glatten Muskelzellen innewohnen, und durch Einflüsse, die von verschiedenen Zelltypen innerhalb der Blasenwand erzeugt werden. Die Wand der Harnblase besteht aus Urothelium (Mukosa), Suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), Detrusor glatter Muskel (DSM) und Serosa (Abbildung 1A). Das Urothel besteht aus Schirmzellen (d.h. der äußersten Schicht des Urothel), Zwischenzellen und Basalzellen (d. h. der innersten Schicht des Urothel). Verschiedene Arten von Zellen, einschließlich interstitielle Zellen, Fibroblasten, affefente Nerventerminals, kleine Blutgefäße und Immunzellen befinden sich in der SubU/LP. Es wird allgemein angenommen, dass das Blasenurothel ein Sinnesorgan ist, das Reflex-Micturition und Kontinenz initiiert, indem es Mediatoren in die Submukose freisetzt, die Zellen in der SubU/ LP und im DSM^1,2,3. Zum größten Teil basieren solche Annahmen auf Studien, die die Freisetzung von Mediatoren gezeigt haben: aus Schleimhautteilen, die Veränderungen des hydrostatischen Drucks ausgesetzt sind^4,5; von kultivierten urotheliale Zellen, die dehnung^6,7, Hypotonizität-induzierte Zellschwellung⁷ oder Schleppkräfte^{ausgesetzt 8}; von isolierten Blasenwandstreifen auf Rezeptor oder Nervenaktivierung^{9,10,11,12,13,14}; und in Blase Lumen am Ende der Blasenfüllung^{15,16,17,18,19}. Während solche Studien entscheidend waren, um die Freisetzung von Mediatoren bei mechanischer Stimulation von Blasenwandsegmenten oder kultivierten Urothelzellen zu demonstrieren, müssen sie durch direkte Beweise für die Freisetzung von Mediatoren in der Submucosa gestützt werden, die durch physiologische Reize ausgelöst werden, die die Blasenfüllung reproduzieren. Dies ist eine schwierige Aufgabe, da sich der SubU/LP tief in der Blasenwand befindet und den direkten Zugang zur Nähe von SubU/LP während der Blasenfüllung behindert.

Hier illustrieren wir ein dezentralisiertes (ex vivo) murines Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt^13, das entwickelt wurde, um Studien über lokale Mechanismen der Mechanotransduktion zu erleichtern, die an der Signalisierung zwischen dem Blasenurothel, DSM und anderen Zelltypen in der Blasenwand teilnehmen. Dieser Ansatz ist der Verwendung von flachen Blasenwandblättern, Blasenwandstreifen oder kultivierten Urothelzellen überlegen, da er direkte Messungen in der Nähe von SubU/LP von Urothel-abgeleiteten Mediatoren ermöglicht, die als Reaktion auf physiologische Drücke und Volumina in der Blase freigesetzt oder gebildet werden und mögliche phänotypische Veränderungen in der Zellkultur vermeiden. Es kann verwendet werden, um Verfügbarkeit, Freisetzung, Stoffwechsel und transurotheliale Transport von Mediatoren in SubU/LP in verschiedenen Stadien der Blasenfüllung zu messen (Abbildung 1B). Das Präparat kann auch verwendet werden, um urotheliale Signalisierung und Mechanotransduktion in Modellen von überaktiven und unteraktiven Blasensyndromen zu untersuchen.

Protokoll

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren mit Tieren wurden gemäß dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und dem Institutional Animal Use and Care Committee an der University of Nevada durchgeführt.

ANMERKUNG: Das hier vorgestellte Modell besteht in der Entfernung des Detrusormuskels, während das Urothel und SubU/LP intakt bleiben (Abbildung 1B), um den Ermittlern den direkten Zugang zu SubU/LP im Verlauf der Blasenfüllung zu ermöglichen.

1. Zerlegung der detrusorfreien Blasenpräparation

1. Die isolierte Blase in eine mit Kälte (10 °C) gefüllte und mit 5% CO₂/95 %_O2 Krebs Bicarbonatlösung (KBS) gefüllte Sezschale (mM) legen: 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl₂, 23.8 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl₂ (pH 7.4)¹³.
2. Pin einen kleinen Teil der Kuppel der isolierten Blase an eine Sylgard-bedeckte Sezieren Schale mit KBS gefüllt. Stellen Sie sicher, dass der Stift durch ein Stück der Serosa oder den äußersten Rand des Detrusormuskels weit weg vom innersten Rand des Muskels geht, der dem SubU/LP gegenübersteht.
3. Identifizieren Sie mit einem Mikroskop die Harnröhre und harnstoffer und heften Sie sie an den Boden der Sezschale.
4. Entfernen Sie die überschüssigen Fett- und Bindegewebe, so dass der gesamte Hauptkörper der Blase, die Harnröhre und beide Harnleiter angezeigt werden.
5. Binden Sie die Harnleiter mit 6-0 Nylon Nähte. Dann heften Sie die offenen Enden der Harnleiter an den Boden der Sezschale, um die Zubereitung zu sichern.
6. Mit feiner Spitzenzange ziehen Sie vorsichtig ein Stück des Serosa an der Ecke zwischen Harnleiter und Blasenkörper.
7. Passen Sie das Licht des Mikroskops an, um die Transparenz zu erhöhen und den Rand der Submukosa unter dem Detrusormuskel zu unterscheiden.
8. Beginnen Sie mit dem Schneiden(nicht schälen!) die Blasenwand mit einer Feinspitze scheren entlang der Innenseite der Detrusor-Muskelschicht, während Sie das geschnittene Segment sanft von der Zubereitung wegziehen. Stellen Sie jederzeit sicher, dass die seitliche Kante der Schleimhaut sichtbar ist und vermeiden Sie es zu berühren.
9. Entfernen Sie den Detrusormuskel vollständig, indem Sie die Sezierende Schale umdrehen, so dass die Position des Präparats bequem ist, um den Detrusormuskel weiter zu sezieren.
10. Lassen Sie ein kleines Stück Detrusormuskel auf der Oberseite der Blasenkuppel, um die Fähigkeit zu gewährleisten, die Vorbereitung während der verbleibenden Schritte des Protokolls zu immobilisieren.
11. Machen Sie eine doppelte Schleife von 6-0 Nylonfaden, legen Sie es um den Hals der Blase Vorbereitung, und lassen Sie die Schleife locker.
12. Fügen Sie eine zweite Doppelschleife von 6-0 Seidenfaden, legen Sie es um den Hals der Blase Vorbereitung, und lassen Sie die Schleife verlieren. Zwei Nähte zu haben verhindert Lecks um die Nähte.
13. Schneiden Sie ca. 2 cm von 20 PE-Schläuche (Katheter), aufflackern Sie die Spitze, indem Sie langsam die Spitze in der Nähe einer Flamme bewegen.
14. Füllen Sie den Katheter mit warmen (37 °C) sauerstoffhaltigen KBS.
15. Legen Sie den Katheter in die Öffnung der Harnröhre der Blase ein und drücken Sie den Katheter vorsichtig, bis die Katheterspitze ungefähr die Mitte der Blase erreicht.
16. Binden Sie die Naht um den Katheter und das umgebende Gewebe des Blasenhalses.
17. Füllen Sie die Blase langsam mit ca. 50-100 l warmem (37 °C) sauerstoffhaltigem KBS, heben Sie sie kurz (<10 s) über die Oberfläche von KBS und überwachen Sie Leckagen an den Nähten und dem Blasenkörper.
18. Wenn kein Leck beobachtet wird, ist die Vorbereitung für das Experiment bereit. Wenn ein Leck um die Naht beobachtet wird, entfernen Sie die Naht und ersetzen Sie sie. Wenn ein Leck aus einem Loch im Blasenkörper bemerkt wird, entsorgen Sie das Präparat.

2. Füllung der denuded Blasenvorbereitung

1. KBS (37 °C) in eine 3 ml Kammer einer wassergemantelten Organschale mit Sylgardboden durchdringen.
2. Stellen Sie die Sauerstoff- und Saugleitungen ein.
3. Legen Sie das denuded Blasenpräparat in die Kammer.
4. Sichern Sie den Katheter an der Seite der Kammer, damit das Präparat nicht über der Oberfläche der Perfusionslösung schwebt.
5. Schließen Sie den Blasenkatheter an einen längeren PE20-Schlauch (Infusionsleitung) an, der mit dem Drei-Wege-Stopphahn verbunden ist, und verwenden Sie die gleiche Größe.
6. Stellen Sie sicher, dass die Leitungen zwischen der Infusionspumpe, dem Druckaufnehmer und der Blase offen sind.
7. Füllen Sie die Infusionsspritze mit frischen, warmen (37 °C) und sauerstoffhaltigen KBS.
8. Passen Sie die Pumpenparameter an: Spritzentyp/-volumen (d. h. 1 ml), Betrieb (d. h. Infuse), Durchfluss (d. h. konstante) und Durchfluss (d. h. 15 l/min).
9. Drücken Sie die Starttaste an der Spritzenpumpe, um die Blase zu füllen.
10. Überwachen Sie Füllvolumen und intravesischen Druck während der Blasenfüllung.

3. Nachweis von Mediatoren im SubU/LP-Aspekt der denuded Blasenvorbereitung

1. Sammeln Sie Aliquots der Badlösung in eiskalte Mikrozentrifugenrohre oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Einsätze.
2. Bereiten Und verarbeiten Sie die Proben entsprechend der entsprechenden Erkennungsanwendung. Im Falle der Detektion der Purinverfügbarkeit verarbeiten Sie die Proben mit HPLC mit Fluoreszenzdetektion^13,18.

Ergebnisse

Die Wand der murinen detrusorfreien Blasenzubereitung ist intakt und enthält alle Schichten außer dem DSM und serosa. Proof-of-Principle-Studien zeigten, dass die DSM-freie Blasenwand Urothelium und SubU/LP enthält, während die Tunika muscularis und die Serosa fehlen (Abbildung 2)¹³.

Die Füllung der detrusorfreien Blase entspricht der normalen Blasenfüllung.

Diskussion

Die Blase hat zwei Funktionen: Lagerung und Leerung von Urin. Der normale Betrieb dieser Funktionen erfordert eine ordnungsgemäße mechanische Erfassung des intraluminalen Volumens und des Drucks sowie die Transduktion von Signalen durch Zellen in der Blasenwand, um die Erregbarkeit der Detrusormuskulatur zu regulieren. Die Blasenschleimhaut (Urothelium) wird geglaubt, um Blasenerregbarkeit zu regulieren, indem eine Vielzahl von Signalmolekülen in der SubU/LP freigesetzt wird, die zahlreiche Zelltypen in der Blasenwand...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	Fisher	C79	Source flexible
Dextrose	Fisher	D16	Source flexible
Dissecting pins	Fine Science Tools	26002-20	Source flexible
Infusion Pump	Kent Scientific	GenieTouch	Source flexible
KCl	Fisher	P217	Source flexible
KH2PO4	Fisher	P284	Source flexible
Light source	SCHOTT ACEI		Source flexible
Microscope	Olympus SZX7		Flexible to use any scope
MgCl2	Fisher	M33	Source flexible
NaCl	Fisher	S671	Source flexible
NaHCO3	Fisher	S233	Source flexible
Needles 25G	Becton Dickinson	305122	Source flexible
Organ bath	Custom made		Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing	Intramedic	427405	Source flexible
Pressure transducer	AD instrument		Source flexible
S&T Forceps	Fine Science Tools	00632-11	Source flexible
Software pressure-volume	AD Instruments	Power lab
Suture Nylon, 6-0	AD surgical	S-N618R13	Source flexible
Suture Silk, 6-0	Deknatel via Braintree Scientific, Inc.	07J1500190	Source flexible
Syringes 1 ml	Becton Dickinson	309602	Source flexible
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Source flexible
Water circulator	Baxter	K-MOD 100	Source flexible