АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Модель мочевого пузыря, свободная от детрузозора, обеспечивает прямой доступ к субуротелию для изучения местных механизмов регулирования наличия биологически активного посредника в субуротелии/ламине проприи и опорожнение мочи. Препарат очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления без системного воздействия.

Аннотация

Предыдущие исследования установили высвобождение химических веществ из листов слизистой оболочки плоского пузыря, прикрепленных в усинг-камерах и подверженных изменениям гидростатического давления или механического растяжения, а также из культивированных уротических клеток при гидростатических изменениях давления, растяжения, отеке клеток или сил перетаскивания, а также в просвете мочевого пузыря в конце заполнения. Такие выводы привели к предположению, что эти посредники также высвобождаются в субуротелиум (SubU)/lamina propria (LP) во время заполнения мочевого пузыря, где они влияют на клетки глубоко в стенке мочевого пузыря, чтобы в конечном счете регулировать возбудимость мочевого пузыря. В таких исследованиях есть по крайней мере два очевидных ограничения: 1) ни один из этих подходов не дает прямой информации о присутствии посредников в SubU/LP, и 2) используемые стимулы не являются физиологическими и не поддаются подлинному наполнению мочевого пузыря. Здесь мы обсуждаем процедуру, которая позволяет прямой доступ к субротелиальной поверхности слизистой оболочки мочевого пузыря в процессе заполнения мочевого пузыря. Препарат без минурного детрузора, который мы создали, очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления на мочевом пузыре при отсутствии путаницы, сигнализирующей от спинальных рефлексов и гладкой мышцы. Используя новую модель мочевого пузыря без детрузора, мы недавно продемонстрировали, что внутривежные измерения посредников не могут быть использованы в качестве прокси-сервера к тому, что было выпущено или присутствует в SubU/LP во время заполнения мочевого пузыря. Модель позволяет изучить уротелий полученных сигнальных молекул, которые высвобождаются, генерируются метаболизмом и / или транспортируются в SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря для передачи информации в нейроны и гладкой мышцы мочевого пузыря и регулировать его возбудимость во время недержания и micturition.

Введение

Цель этой модели заключается в том, чтобы обеспечить прямой доступ к подмукозной стороне слизистой оболочки мочевого пузыря во время различных фаз заполнения мочевого пузыря.

Мочевой пузырь должен воздерживаться от преждевременного сокращения во время заполнения и пустой, когда критический объем и давление достигаются. Аномальные недержания или аннулирования мочи часто связаны с ненормальной возбудимостью детрузор гладкой мышцы (DSM) в ходе заполнения мочевого пузыря. Возбудимость DSM определяется факторами, присущими гладким мышечным клеткам, и влияниями, генерируемыми различными типами клеток в стенке мочевого пузыря. Стенка мочевого пузыря состоит из уротелия (слизистая оболочка), субуротелия (SubU)/lamina propria (LP), детрузора гладкой мышцы (DSM) и серозы(рисунок 1A). Уротелий состоит из зонтичных клеток (т.е. внешнего слоя уротелия), промежуточных клеток и базальных клеток (т.е. внутреннего слоя уротелия). Различные типы клеток, в том числе интерстициальные клетки, фибробласты, афферентные нервные терминалы, мелкие кровеносные сосуды и иммунные клетки находятся в SubU/LP. Широко предполагается, что уротелиум мочевого пузыря является сенсорным органом, который инициирует рефлекс micturition и недержание инфекции, выпуская посредников в субмукозы, которые влияют на клетки в SubU / LP и DSM1,2,3. По большей части, такие предположения основаны на исследованиях, которые продемонстрировали высвобождение посредников: из кусочков слизистой оболочки подвергаются изменениям гидростатического давления4,5; от культурных уротелиальных клеток подвергаются растяжения6,7, гипотониность индуцированной клеточной опухоль7 или перетащить силы8; от изолированных полоски стенки мочевого пузыря на рецепторе или активации нерва9,10,11,12,13,14; и в просвет мочевого пузыря в конце мочевого пузыря заполнения15,16,17,18,19. Хотя такие исследования сыграли важную роль, чтобы продемонстрировать освобождение посредников при механической стимуляции сегментов стенки мочевого пузыря или культивируемых уротелиальных клеток, они должны быть подкреплены прямыми доказательствами для освобождения посредников в субмукозе, которая вызывается физиологическими стимулами, которые воспроизводят наполнение мочевого пузыря. Это сложная задача, учитывая, что SubU / LP находится глубоко в стенке мочевого пузыря препятствует простой доступ к окрестностям SubU / LP во время заполнения мочевого пузыря.

Здесь мы иллюстрируем децентрализованную (ex vivo) модель мочевого пузыря с детрусорной мышцей удалены13, которая была разработана для облегчения исследований на местных механизмов механотрансдукции, которые участвуют в сигнализации между мочевого пузыря уротели, DSM и других типов клеток в стенке мочевого пузыря. Этот подход превосходит использование плоских листов стенки мочевого пузыря, полосы стенки мочевого пузыря или культивированные уротелиальные клетки, потому что он позволяет прямые измерения в непосредственной близости от SubU / LP уротелия полученных посредников, которые высвобождаются или формируются в ответ на физиологические давления и объемы в мочевом пузыре и позволяет избежать потенциальных фенотипических изменений в культуре клеток. Он может быть использован для измерения доступности, выпуска, метаболизма и трансуротелиальной транспортировки посредников в SubU/LP на разных стадиях заполнения мочевого пузыря(рисунок 1B). Препарат также может быть использован для изучения уротелилиальной сигнализации и механотрансдукции в моделях гиперактивных и недостаточно активных синдромов мочевого пузыря.

протокол

Все процедуры с участием животных, описанных в этой рукописи, были проведены в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья для ухода и использования лабораторных животных и Институционального комитета по использованию и уходу за животными в Университете Невады.

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель, представленная здесь, состоит из удаления мышцы детрузора в то время как уротелий и SubU/LP остаются нетронутыми(Рисунок 1B),чтобы позволить следователям прямой доступ к SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря.

1. Рассечение бездетного препарата мочевого пузыря

  1. Поместите изолированный мочевой пузырь в рассекающее блюдо, наполненное холодом (10 градусов по Цельсию) и насыщенное кислородом 5% CO2/95 % O2 Кребс бикарбонатный раствор (KBS) со следующим составом (mM): 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. Прикрепите небольшую часть купола изолированного мочевого пузыря к покрытой Сильгардом рассекающей тарелке, наполненной KBS. Убедитесь, что штифт проходит через кусок serosa или внешний край мышцы детрузора далеко от внутреннего края мышцы, которая сталкивается с SubU / LP.
  3. С помощью микроскопа, определить уретры и мочеточники и приколоть каждый из них на дно рассекающей блюдо.
  4. Удалите избыток жировой и соединительной ткани так, чтобы все основное тело мочевого пузыря, уретры и оба мочеточника отображаются.
  5. Свяжите мочеточники 6-0 нейлоновыми швами. Затем прикрепите открытые концы мочеточников к нижней части рассекающей тарелки, чтобы обеспечить приготовление.
  6. Используя тонкие наконечникщицы, осторожно потяните кусок serosa на углу между мочеточник омичи и мочевого пузыря тела.
  7. Отрегулируйте свет микроскопа для того чтобы увеличить транспарентность и различить край submucosa под мышцей detrusor.
  8. Начните резки(не пилинг!) стенки мочевого пузыря с тонкой кончик ножницами вдоль внутренней поверхности слоя мышц детрузора при осторожно потянув сократить сегмент от подготовки. Во все времена убедитесь, что боковой край слизистой оболочки можно увидеть и не прикасаться к нему.
  9. Удалите мышцы детрузора полностью, оборачиваясь рассекая блюдо так, чтобы положение препарата удобно продолжать вскрытие детрузорной мышцы.
  10. Оставьте небольшой кусочек детрузорной мышцы на верхней части купола мочевого пузыря, чтобы обеспечить способность обездвиживать препарат во время оставшихся этапов протокола.
  11. Сделайте двойную петлю 6-0 нейлоновой нити, поместите его вокруг шеи приготовления мочевого пузыря, и оставить петлю свободно.
  12. Добавьте вторую двойную петлю из 6-0 шелковых нитей, поместите ее вокруг шеи приготовления мочевого пузыря и оставьте петлю проиграть. Наличие двух швов предотвращает утечки вокруг швов.
  13. Вырезать около 2 см 20 PE трубки (катетер), вспыхнуть кончик, медленно двигаясь кончик близко к пламени.
  14. Заполните катетер теплым (37 градусов по Цельсию) кислородом KBS.
  15. Вставьте катетер в норис мочевого пузыря уретры и осторожно нажмите катетер, пока кончик катетера достигает примерно в середине мочевого пузыря.
  16. Свяжите шов вокруг катетера и окружающих тканей шеи мочевого пузыря.
  17. Медленно заполните мочевой пузырь примерно 50-100 л тепла (37 градусов по Цельсию) оксигенированным KBS, поднимите его кратко (lt;10 s) над поверхностью KBS, и следите за утечками в швах и теле мочевого пузыря.
  18. Если утечки не наблюдается, препарат готов к эксперименту. Если наблюдается утечка вокруг шва, снимите шов и замените его. Если обнаружена утечка из отверстия в теле мочевого пузыря, отбросьте препарат.

2. Заполнение Denuded мочевого пузыря Подготовка

  1. Perfuse KBS (37 градусов по Цельсию) в камеру 3 мл воды (37 градусов по Цельсию) куртку орган блюдо с Сильгард дно.
  2. Отрегулируйте линии кислорода и всасывания.
  3. Поместите денонсированный препарат мочевого пузыря в камере.
  4. Закрепите катетер в сторону камеры, чтобы препарат не плавал над поверхностью перфузионного раствора.
  5. Подключите катетер мочевого пузыря к более длинной трубе PE20 (линия инфузии), соединенной с трехсторонним стоп-коном, используя примерку того же размера.
  6. Убедитесь, что линии между инфузионным насосом, преобразователем давления и мочевым пузырем открыты.
  7. Заполните настой шприц свежим, теплым (37 градусов по Цельсию) и кислородом KBS.
  8. Отрегулируйте параметры насоса: тип/объем шприца (т.е. 1 мл), эксплуатацию (т.е. инфуз), поток (т.е. постоянный) и скорость потока (т.е. 15 л/мин).
  9. Нажмите кнопку "Пуск" на шприц насос, чтобы заполнить мочевой пузырь.
  10. Мониторинг объема наполнения и внутривесического давления при заполнении мочевого пузыря.

3. Обнаружение посредников в Аспекте СубУ/ЛП по подготовке к денированному мочевому пузыри

  1. Сбор аликвотов раствора ванны в ледяные микроцентрифугные трубки или высокопроизводительные жидкие хроматографии (HPLC) вставки.
  2. Подготовка и обработка образцов в соответствии с соответствующим приложением обнаружения. В случае обнаружения доступности пурина, обработать образцы HPLC с флуоресценцией обнаружения13,18.

Результаты

Стена мурин детрузора подготовки мочевого пузыря нетронутыми и содержит все слои, кроме DSM и serosa. Доказательство принципа исследования показали, что DSM-свободной стенки мочевого пузыря включает в себя urothelium и SubU / LP в то время как туника muscularis и serosa отсутствуют (

Обсуждение

Мочевой пузырь имеет две функции: хранение и аннулирование мочи. Нормальная работа этих функций требует надлежащего механического зондирования внутрилюмительного объема и давления и трансдукции сигналов через клетки в стенке мочевого пузыря для регулирования возбуждания мышц детру...

Раскрытие информации

Часть этой работы была ранее опубликована в журнале физиологии (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Разрешение было предоставлено Wiley and Sons, Inc. на использование материалов этой публикации. Авторы не имеют финансовых или других конфликтов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек Грант DK41315.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl2FisherC79Source flexible
DextroseFisherD16Source flexible
Dissecting pinsFine Science Tools26002-20Source flexible
Infusion PumpKent ScientificGenieTouchSource flexible
KClFisherP217Source flexible
KH2PO4FisherP284Source flexible
Light sourceSCHOTT ACEISource flexible
MicroscopeOlympus SZX7Flexible to use any scope
MgCl2FisherM33Source flexible
NaClFisherS671Source flexible
NaHCO3FisherS233Source flexible
Needles 25GBecton Dickinson305122Source flexible
Organ bathCustom madeFlexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubingIntramedic427405Source flexible
Pressure transducerAD instrumentSource flexible
S&T ForcepsFine Science Tools00632-11Source flexible
Software pressure-volumeAD InstrumentsPower lab
Suture Nylon, 6-0AD surgicalS-N618R13Source flexible
Suture Silk, 6-0Deknatel via Braintree Scientific, Inc.07J1500190Source flexible
Syringes 1 mlBecton Dickinson309602Source flexible
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Source flexible
Water circulatorBaxterK-MOD 100Source flexible

Ссылки

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены