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요약

detrusor-free 방광 모형은 소변의 저장 그리고 무효화 도중 suburothem/lamina propria에 있는 생물학적으로 활성 매개체 가용성의 규칙에 대한 지역 기계장치를 공부하기 위하여 suburothem에 직접 접근할 수 있습니다. 준비는 밀접하게 손상되지 않은 방광의 채우기를 닮은 및 압력 볼륨 연구는 전신 영향없이 수행 할 수 있습니다.

초록

이전 연구는 Ussing 챔버에 부착 된 평평한 방광 점막 시트에서 화학 물질의 방출을 확립하고 정수압 변화, 스트레칭, 세포 부종 또는 항력, 충전 말기의 방광 루멘에 따라 정수압 또는 기계적 스트레칭 및 배양 된 비뇨기 세포에서 변화에 노출되었습니다. 그 같은 사실 인정은 이 매개체가 또한 방광 충전 도중 suburothelium (SubU)/lamina propria (LP)에서 풀어 놓인다는 가정으로 이끌어 냈습니다, 어디 그(것)들은 궁극적으로 방광 흥분성을 통제하기 위하여 방광 벽에 깊은 세포에 영향을 미칩니다. 그러한 연구 결과에 있는 적어도 2개의 명백한 한계가 있습니다: 1) 이 접근의 아무도는 SubU/LP에 있는 중재자의 존재에 관하여 직접적인 정보를 제공하지 않으며, 2) 사용된 자극은 생리적이지 않으며 방광의 본격적인 충진을 되풀이하지 않습니다. 여기에서는 방광 을 채우는 과정에서 방광 점막의 지하 표면에 직접 접근 할 수있는 절차에 대해 논의합니다. 우리가 만든 뮤린 detrusor-free 준비는 그대로 방광의 채우기와 밀접하게 유사하고 척추 반사 및 detrusor 평활근에서 혼란스러운 신호가없는 방광에 압력 볼륨 연구를 수행 할 수 있습니다. 새로운 detrusor 자유로운 방광 모형을 사용하여, 우리는 최근에 방광 충전 도중 SubU/LP에서 풀어 놓인 무슨에 대리인으로 중재자의 내측정을 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다. 이 모델은 방광 충전 과정에서 신진 대사에 의해 생성되거나 SubU/LP로 이송되어 방광의 뉴런과 평활근에 정보를 전달하고 요실금 및 분뇨 중 흥분성을 조절하는 비뇨생식기 유래 신호 분자를 검사할 수 있습니다.

서문

이 모형의 목적은 방광 충진의 다른 단계 도중 방광 점막의 점막 측에 직접 접근을 가능하게 하기 위한 것입니다.

방광은 중요한 부피와 압력에 도달할 때 충전하는 동안 조기 수축을 자제하고 비어 있어야합니다. 소변의 이상한 요실금 또는 무효화는 방광 충진 의 과정에서 분리 평활근 (DSM)의 비정상적인 흥분성과 자주 연관됩니다. DSM의 흥분성은 평활근 세포에 내재된 요인과 방광 벽 내의 다른 세포 유형에 의해 생성된 영향에 의해 결정됩니다. 오줌 방광의 벽은 요로 외(점막), suburi(SubU)/라미나 프로피아(LP), 방파제 평활근(DSM) 및 세로사(그림1A)로구성됩니다. 요로 테륨은 우산 세포 (즉, 요로 류의 가장 바깥쪽 층), 중간 세포 및 기저 세포 (즉, 요로 의 가장 안쪽 층)로 구성됩니다. 간질 세포, 섬유아세포, 구심성 신경 말단, 작은 혈관 및 면역 세포를 포함한 다양한 유형의 세포가 SubU/LP에 있습니다. 방광 요로는 SubU/LP 및 DSM1,2,3의세포에 영향을 미치는 점막내로 매개체를 방출함으로써 반사 배뇨 및 요실금을 개시하는 감각 기관이라고 널리 가정됩니다. 대부분의 경우, 이러한 가정은 중재자의 방출을 입증 한 연구를 기반으로합니다 : 점막의 조각에서 정수압의 변화에 노출4,5; 배양 된 비뇨기 세포에서 스트레칭 에 노출6,7,hypotonicity 유도 세포 팽윤7 또는 드래그 힘8; 수용체 또는 신경 활성화 시 고립 된 방광 벽 스트립에서9,10,11,12,13,14; 그리고 방광 의 끝에 루멘15,16,17,18,19. 그 같은 연구 결과는 방광 벽 세그먼트 또는 배양된 비뇨기과 세포의 기계적인 자극에 중재자의 방출을 설명하는 중요한 동안, 방광 충전을 재생하는 생리적 자극에 의해 유도되는 submucosa에 있는 중재자의 방출을 위한 직접적인 증거에 의해 지원될 필요가 있습니다. 이것은 SubU/LP가 방광 충전 도중 SubU/LP의 부근에 간단한 접근을 방해하는 방광 벽의 깊은 곳에 있다는 것을 주어진 도전적인 작업입니다.

여기서, 우리는 방광 요로, DSM 및 방광 벽에 있는 그밖 세포 모형 사이 신호에 참여하는 메카노트랜스덕션의 국소 기계장치에 대한 연구를 촉진하기 위하여 개발된 detrusor 근육제거된 13를 가진 분권화된 (ex vivo) 뮤린 방광 모형을 예시합니다. 이 접근법은 방광의 생리적 압력 과 부피에 반응하여 방출되거나 형성되는 비뇨기과 유래 매개체의 SubU/LP 부근에서 직접 측정을 허용하고 세포 배양에서 잠재적인 현상학적 변화를 피하기 때문에 평평한 방광 벽 시트, 방광 벽 스트립 또는 배양 된 비뇨 기 세포를 사용하는 것이 우수합니다. 방광 충진의 상이한 단계에서 SubU/LP의 중재자의 가용성, 방출, 대사 및 경부 수송을 측정하는데 사용될 수있다(그림 1B). 준비는 또한 과민성 및 저활동 방광 증후군의 모형에 있는 비뇨기과 신호 및 mechanotransduction를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다.

프로토콜

이 원고에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소와 네바다 대학의 기관 동물 사용 및 관리위원회에 따라 수행되었습니다.

참고: 여기에 제시 된 모델은 비뇨기와 SubU / LP가 그대로 남아있는 동안 detrusor 근육의 제거로 구성되어 있습니다(그림 1B)연구원은 방광 충전 과정에서 SubU / LP에 직접 액세스 할 수 있도록.

1. 분리되지 않거나 방광 제제의 해부

  1. 분리된 방광을 차가운(10°C)로 채워진 해부 접시에 놓고 5% CO 2/95%O2 크렙스 중탄산염 용액(KBS)으로 산소를 공급하고 다음 조성물(mM)을 사용한다: 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 덱스트로스, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. 고립된 방광의 돔의 작은 부분을 KBS로 채워진 실가드 덮인 해부 접시에 고정합니다. 핀이 SubU/LP를 마주보고 있는 근육의 가장 안쪽 가장자리에서 멀리 떨어진 분리기 근육의 세로사 조각 또는 가장 바깥쪽 가장자리를 통과해야 합니다.
  3. 현미경을 사용하여 요도 및 요관을 식별하고 해부 접시의 바닥에 각각 고정합니다.
  4. 방광의 전체 본체, 요도 및 두 요관이 표시되도록 과도한 지방 및 결합 조직을 제거하십시오.
  5. 요관에 6-0 나일론 봉합사를 묶습니다. 그런 다음, 제조를 확보하기 위해 해부 접시의 바닥으로 요관의 열린 끝을 고정.
  6. 미세 팁 집게를 사용하여 요관과 방광 몸 사이의 모서리에있는 세로사의 조각을 부드럽게 당깁니다.
  7. 투명도를 높이고 detrusor 근육 아래 의 점막의 마진을 구별하기 위해 현미경의 빛을 조정합니다.
  8. 절단을 시작(박리하지 않음!) 방광 벽을 분지 근육 층의 안쪽 표면을 따라 미세 한 팁 가위로 가볍게 절단 부분을 준비에서 멀리 당깁니다. 항상 점막의 측면 가장자리를 볼 수 있는지 확인하고 만지지 마십시오.
  9. 해부 접시를 돌리면 배뇨기 근육을 완전히 제거하여 준비의 위치가 편해지므로 제거기 근육을 계속 해부하십시오.
  10. 프로토콜의 나머지 단계 동안 준비를 고정 할 수있는 능력을 보장하기 위해 방광 돔의 상단에 detrusor 근육의 작은 조각을 둡니다.
  11. 6-0 나일론 스레드의 이중 루프를 만들고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 느슨하게 둡니다.
  12. 6-0 실크 스레드의 두 번째 이중 루프를 추가하고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 잃어 버리십시오. 두 개의 봉합사를 사용하면 봉합사 주위의 누출을 방지할 수 있습니다.
  13. 20 PE 튜브 (카테터)의 약 2cm를 잘라, 불꽃에 가까운 팁을 천천히 이동하여 팁을 플레어.
  14. 카테터를 따뜻한(37°C)로 채우고 KBS에 산소를 공급합니다.
  15. 방광 요도의 오리피스에 카테터를 삽입하고 카테터 팁이 방광의 약 중간에 도달 할 때까지 카테터를 부드럽게 밀어 넣습니다.
  16. 카테터와 방광 목의 주변 조직 주위에 봉합사를 묶습니다.
  17. 약 50-100 μL의 따뜻한 (37 °C) 산소 로 방광을 천천히 채우고, KBS의 표면 위로 짧게 들어 올리고 봉합사및 방광 체에서 누출을 모니터링하십시오.
  18. 누출이 관찰되지 않으면 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 봉합사 주위의 누출이 관찰되면 봉합사를 제거하고 교체하십시오. 방광 체의 구멍에서 누출이 발견되면 준비를 폐기하십시오.

2. 방광 제제 의 충진

  1. KBS(37°C)를 실가드 바닥을 가진 3 mL 챔버(37°C)의 자켓 오르간 접시에 퍼퓨즈한다.
  2. 산소와 흡입 선을 조정합니다.
  3. 방광 준비를 챔버에 놓습니다.
  4. 카테터를 챔버 의 측면에 고정하여 전재가 관류 용액의 표면 위에 떠오르지 않도록하십시오.
  5. 방광 카테터를 동일한 크기의 피팅을 사용하여 3방향 스톱콕에 연결된 더 긴 PE20 튜브(주입 선)에 연결합니다.
  6. 주입 펌프, 압력 변환기 및 방광 사이의 선이 열려 있는지 확인하십시오.
  7. 주입 주사기를 신선하고 따뜻한 (37 °C)와 산소화 된 KBS로 채웁니다.
  8. 펌프 파라미터 를 조정합니다: 주사기의 유형/부피(즉, 1mL), 작동(즉, 주입), 유량(즉, 상수) 및 유량(즉, 15μL/min).
  9. 주사기 펌프의 시작 버튼을 눌러 방광을 채웁니다.
  10. 방광 충진 중 충진량과 내압력을 모니터링합니다.

3. 디누디 방광 제제의 SubU/LP 측면의 중재자 검출

  1. 얼음 차가운 미세 원심 분리튜브 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 인서트에 목욕 용액의 알리쿼트를 수집합니다.
  2. 적절한 검출 어플리케이션에 따라 샘플을 준비하고 처리합니다. purine 가용성을 검출하는 경우 형광 검출13,18로HPLC에 의해 샘플을 처리합니다.

결과

뮤린 detrusor 없는 방광 준비의 벽은 손상되지 않으며 DSM과 serosa를 제외한 모든 층을 포함합니다. 원리 증명 연구는 DSM이없는 방광 벽이 투로 신경과 수U / LP를 포함하고 튜니카 근육질및 혈청이 없는 것으로 입증되었습니다(그림 2)13.

방광이 없는 방광을 채우는 것은 정상적인 방?...

토론

방광에는 소변의 저장 그리고 무효화의 2개의 기능이 있습니다. 이러한 기능의 정상적인 작동은 방광 벽에 있는 세포를 통해 신호의 내발량 및 압력 및 전달의 적절한 기계적 감지를 필요로 하여 분리기 근육 흥분성을 조절합니다. 방광 점막 (urothelium)는 방광 벽에 있는 수많은 세포 모형에 영향을 미치는 SubU/LP에 있는 신호 분자의 다양한 방출해서 방광 흥분성을 통제하는 것으로 믿어집니다. 현?...

공개

이 작품의 일부는 이전에 생리학의 저널에 발표 되었다 (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). 이 출판물의 자료 사용에 대한 와일리와 Sons, Inc.의 허가가 부여되었습니다. 저자는 공개 할 재정적 또는 기타 충돌이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 당뇨병과 소화 및 신장 질환 보조금 DK41315의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl2FisherC79Source flexible
DextroseFisherD16Source flexible
Dissecting pinsFine Science Tools26002-20Source flexible
Infusion PumpKent ScientificGenieTouchSource flexible
KClFisherP217Source flexible
KH2PO4FisherP284Source flexible
Light sourceSCHOTT ACEISource flexible
MicroscopeOlympus SZX7Flexible to use any scope
MgCl2FisherM33Source flexible
NaClFisherS671Source flexible
NaHCO3FisherS233Source flexible
Needles 25GBecton Dickinson305122Source flexible
Organ bathCustom madeFlexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubingIntramedic427405Source flexible
Pressure transducerAD instrumentSource flexible
S&T ForcepsFine Science Tools00632-11Source flexible
Software pressure-volumeAD InstrumentsPower lab
Suture Nylon, 6-0AD surgicalS-N618R13Source flexible
Suture Silk, 6-0Deknatel via Braintree Scientific, Inc.07J1500190Source flexible
Syringes 1 mlBecton Dickinson309602Source flexible
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Source flexible
Water circulatorBaxterK-MOD 100Source flexible

참고문헌

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