建立干细胞治疗心肌梗塞心力衰竭的猪模型

摘要

我们寻求建立一个猪模型的心力衰竭引起的左环弹性动脉阻塞和快速起搏，以测试心肌内给给干细胞的效果和安全性的细胞为基础的疗法。

摘要

虽然在心肌梗塞（MI）后心力衰竭的治疗方面已取得进步，但MI后HF仍然是全世界死亡和发病的主要原因之一。MI后心脏修复和改善左心室功能的细胞疗法引起了相当大的关注。因此，这些细胞移植的安全性和有效性应在临床使用前在HF的临床前大型动物模型中进行测试。猪由于在心脏大小和冠状动脉解剖学方面与人类相似，被广泛用于心血管疾病研究。因此，我们寻求提出一个有效的方案，建立一个猪慢性HF模型使用封闭胸冠状动脉闭塞的左环弹性动脉（LCX），其次是快速心室起搏诱导与心脏起搏器植入。八周后，干细胞通过心肌注射在近腹区施用。然后评估梗塞大小、细胞存活率和左心室功能（包括心电图、血流动力学参数和电生理学）。本研究有助于建立一个稳定的临床前大型动物HF模型的干细胞治疗。

引言

心血管疾病，特别是冠状动脉疾病，仍然是香港及全球^1月1日发病和死亡的主要原因。在香港，由2012至2017年，在医院管理局接受治疗的CAD病人人数预计增加^26%。在所有病症中，急性心肌梗塞 （MI） 是导致死亡和随后的并发症（如心力衰竭 （HF））的主要原因。这些都带来了巨大的医疗、社会和财政负担。在 MI 患者中，血栓整流治疗或初级皮下冠状动脉干预 （PCI） 是保护生命的有效疗法，但这些疗法只能减少 MI 期间心肌细胞 （CM） 损失。可用的治疗方法无法补充CMs的永久性损失，导致心脏纤维化、心肌重塑、心律失常，并最终心力衰竭。MI后1年的死亡率约为7%，超过20%的患者患有HF^3。在末期HF患者中，心脏移植是唯一可用的有效疗法，但受可用器官短缺的有限。新颖的疗法是扭转后MIHF的发展所必需的。因此，基于细胞的治疗被认为是一种有吸引力的方法，以修复受损的CMs和改善左心室（LV）功能在HF后MI。我们先前的研究发现，在^MI4、5,的小动物模型中直接进行心肌移植后，干细胞移植对心脏功能^{的改善是有益的}。因此，需要标准化的临床前大型动物HF方案，以进一步测试干细胞移植在临床使用前的有效性和安全性。

近几十年来，猪在心血管研究中的广泛使用，用于干细胞治疗。HF猪是一个很有前途的转化研究模式，由于其在心脏大小、体重、节律、功能和冠状动脉解剖方面与人类相似。此外，猪HF模型可以模仿后MIHF患者在CM代谢，电生理特性，神经内分泌变化在缺血条件下^6。此处提出的协议使用这种标准化的猪HF模型，采用左环状动脉（LCX）的闭胸冠状气球闭塞，随后由心脏起搏器植入诱导的快速起搏。该研究还优化了干细胞在心肌内注射的路径，用于治疗后MI HF。其目的是制作慢性心肌梗塞的猪动物模型，可用于开发与严重 CAD 患者临床相关的治疗方法。

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研究方案

所有动物实验都按照美国国家卫生研究院和香港大学法规所公布的《实验室动物护理和使用指南》进行，该议定书已获香港大学活动物教学及研究使用委员会（CULTAR）批准。

注:本研究使用体重35-40公斤（9-12个月大）的雌性农场猪。此实验的流程图如图 1 所示。

1. 外科手术

1. 动物的麻醉和准备
   1. 禁食动物12小时，在实验前被水剥夺4小时。
   2. 通过用20 mL正常盐水（2-7毫克/千克）和Xylazine（0.5-1毫克/千克）的肌肉注射麻醉猪。监测动物的苍白反应，直到它们缺席。
   3. 去除猪的头发，对颈部和腹股沟的皮肤进行消毒，用于第1.3-1.5节。用70%乙醇和β丁对作业区域进行3倍消毒。
   4. 将一个 7 mm 的气管管放入猪气管中，将 22 G 静脉内孔注射针放入耳道中。
   5. 将猪移动到操作台上，并放在一个向上的位置。将气管管连接到呼吸器和机械通气（呼吸/呼气时间比1:2），动物与异氟兰（1.5%-2.0%吸入）和氧气（0.5-1.5 L/min吸入）。
   6. 通过电生理学记录系统监测表面心电图和血压，持续监测心率、心律和动脉血压。
2. 超声 心动 图
   1. 将猪移动到左侧的二角体位置，并固定在桌子上。
   2. 将探头放在心上区域，在细胞移植前和细胞移植后8周使用高分辨率超声心动图系统和基线上的3-9 MHz传感器进行串行超声心动图，包括2D和M模式成像（补充图1）。
   3. 使用商业软件分析所有获得的图像。从准星长轴视图获取标准超声心动图后，计算 LV 端形舒张尺寸 （LVEDD）、LV 端形收缩尺寸 （LVESD）、LV 端形舒张体积 （LVEDV）、LV 端形收缩体积 （LVESV）、LV 喷射分数 （LVEF） 和壁厚。
      注:所有在线分析由另一个独立操作员使用计算机工作站进行。根据20个重复的随机图像，不同观测者之间的测量值变异性为4%。所有超声心动量测量都是按照美国超声心动图学会的建议进行的。
3. 起搏器植入
   1. 将猪移动到上肢位置，用带子将猪的四肢固定在桌子上。
   2. 在胡萝卜三角形中定位右胡萝卜状动脉和血管静脉（在尾体三角形后面，周围是软骨肌、结节肌和软体），并在无菌条件下用止血钳分离右胡萝卜状动脉和血管静脉（补充图2）。将右胡萝卜动脉和血管的后端拉开。以 2: 0 维里尔的两块肌肉。
   3. 用血管结节将右血管插入右血管，并在 X 射线指导下插入心脏起搏器引线到右心室（图 2）。
   4. 使用钳子隔离胸骨肌肽和前部规模肌肉。在两块肌肉之间植入一个心脏起搏器，用2-0的丝绸缝制两块肌肉。将心脏起搏器连接到引线。
   5. 移植后，通过心脏起搏器发生器重新编程心脏起搏器以备份 VVI 模式 （35 bpm）。
   6. 应用快速心室起搏（150 节拍/分钟），在 MI 感应后 4 周通过心脏起搏器发生器诱导 HF。然后将心脏起搏器设置回备份 VVI 模式 8 周。
4. 侵入性压力体积回路分析
   注:在基线、细胞移植前和细胞移植后8周进行侵入性血动力评估，以评估LV功能的变化。
   1. 在股骨三角形中分离右股动脉和股骨静脉（被内侧韧带、沙体肌和加法器长骨肌包围）（补充图2）。
   2. 用血管瘤将右股动脉拉大，然后通过血管瘤将导线插入动脉。取出血管，在导线的指导下将 9F 护套插入动脉。拆下导线。
   3. 如步骤 1.4.2 所述，使用 12F 护套可对右侧股骨静脉进行测量。在 X 射线指导下，将气球导管从放置的 12F 护套插入劣质的 Vena 卡瓦 （IVC） 中。
   4. 使用 PV 信号处理器在同位素盐水中校准 7 Fr 压力体积 （PV） 导管。
   5. 在 X 射线引导下，从放置的 9F 护套将 PV 导管插入 LV 顶点。使用 PV 信号处理器暂停通风并测量左心室最大正压导数 （+dP/dt）、端收缩压 （ESP） 和最终舒张压 （EDP）。
   6. 在 IVC 遮挡期间，由 PV 信号处理器测量端收缩压体积关系 （ESPVR）。
   7. 过程完成后重新启动通风。
5. MI 的诱导
   1. 在MI诱导之前，静脉注射给动物注射阿米奥达龙（5毫克/千克静脉注射超过1小时）和利多卡因（1.5毫克/千克静脉注射脂），以防止心室心律失常。
   2. 如步骤 1.4.3 中所述，用 8F 护套将右侧胡萝卜动脉进行扫描。
   3. 通过 6F JR4 线导导管，通过由标准 C 臂荧光镜设备引导的放置护套进行冠状动脉造影。
   4. 在 X 射线指导下，左环状冠状动脉 （LCX） 与皮下透骨血管成形术 （PTCA） 分离气球导管膨胀处关闭至第一个迟钝边缘分支（图2）。
   5. 注入 1 mL 的 700 μm 海绵微球，与 10 mL 注射器中制备的 3 mL 盐水混合，通过气球导管阻止 LCX，然后放气气球并进行动物图检查以确认遮挡。
   6. 重复喷射过程，实现完全堵塞。
   7. 监测动物心率和节奏，以检测心律失常。如果发生心室颤动，使用外部双相除颤器使用 150-300 J 冲击重新建立鼻窦节律。
6. 干细胞注射
   1. 随机将所有心脏功能明显受损的动物（LVEF < 40%在MI诱导后8周）分配给两个不同的组:一组接受2 x 10⁸ 人类诱导多能干细胞衍生的细胞（hiPSC-MSCs）的心肌内给用，另一组不会接受hiPSC-MSC。
   2. 在2mL的正常盐水中准备hiPSC-MSC进行心内移植。在心肌内 hiPSC-MSC 移植之前，重复第 1.1 节中提到的麻醉和动物准备步骤，这次在顶点节拍区域周围消毒 10 厘米。使用缩回器在 4-5 成本间空间进行左胸切除术。进行心内切除术，以暴露梗死的横向壁。
      注:切口长度为10-12厘米。
   3. 在梗塞区域周围使用5-8次心肌注射（每注射约0.3 mL），Table of Materials对一组动物进行培养介质（材料表），或向另一组动物施用2 x 108个hiPSC-MSC（图3）。小心避免对冠状动脉的任何损害，以减少出血的风险。
   4. 用铁丝关闭间空间，用2-0丝关闭肌肉层。用 2 - 0 的维克里布皮下组织和皮肤。
7. 心内编程电刺激
   1. 使用可编程刺激器执行编程电刺激，以评估细胞移植治疗后心室性。
   2. 在牺牲所有动物之前，通过股骨静脉将 6F 电生理导管插入右心室顶点。
   3. 在电生理记录系统中以 200 mm/s 的速度显示具有表面心电图引线 I、II 和 III 的心内记录。使用刺激器以 2 倍的舒张阈值提供 2 ms 脉冲宽度。
   4. 在两个驱动周期长度（200 ms 和 300 ms）内提供八个刺激 （S1） 的起搏列车，然后是一个 （S2） 或两个 （S2 和 S3） 过早的额外刺激。
   5. 顺序缩短耦合间隔，直到心室有效耐火期或心律失常被诱导。请注意存在可抑制的持续 VT （>10 s）。

2. 术后协议

1. 术后医学
   1. 对HF进行常规药理疗法。简言之，每天口头给所有动物施用甲醇（25毫克）和拉米普利（2.5毫克）。
   2. 手术后1周内，每天每天给所有动物服用环丙沙星（5毫克/千克）和丁丙诺啡（0.01毫克/千克），以防止感染和缓解疼痛。
   3. 为了尽量减少免疫排斥，口服类固醇（40毫克/天口服）和环孢素（200毫克/天口服）给所有动物从细胞移植前3天到8周后。
2. 梗塞大小评估
   1. 在实验结束时，过量服用宿舍（五巴比钠，100毫克/千克，IV），使动物安乐死。
   2. 打开胸膛，收集心脏。用0.9%盐水冲洗心脏。
   3. 串行部分LV组织样品与手术刀在1厘米厚的LV横向。
   4. 选择包含法外菌的切片部分，以测量壁厚和法外区域。
   5. 利用商业图像分析软件捕捉这些切片的图像，定量分析壁厚和梗塞区域。
   6. 在4°C下将组织固定在10%的甲醛中一个月。将组织嵌入石蜡中、相邻和远离梗塞点（±1 厘米² 片）。使用微原子进行组织学检查，切成5μm切片。
3. 细胞生存
   1. 根据制造商提供的协议，通过使用抗人体核抗原（HNA）的免疫组织化学染色来检测移植细胞的移植情况。
   2. 在每个动物的五个随机场中分三个不同部分捕获图像，并定量分析近游带的正细胞。
      注:图像采集系统和图像分析软件用于捕捉和分析心脏部分的图像。

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结果

死亡率
这项研究共使用了24头猪。其中三人在 MI 诱导期间因持续 Vt 死亡。一只动物因伤口出血在开胃手术中因细胞注射而死亡。两只动物因严重感染死亡。由于 EF 的轻微减少（LVEF 减少 > 基线的 40%），两种动物被排除在外。结果，16只动物完成了整个研究方案。

心脏功能和重塑
串行超声心动图?...

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讨论

标准动物模型对于了解疾病的病理生理学和机制以及测试新的治疗方法至关重要。我们的协议建立了由左环状动脉阻塞和快速起搏诱导的HF猪模型。在MI诱导八周后，这些动物对LVEF、LVEDD、LVESD、+dP/dt和ESPVR有显著损伤。该协议还测试了干细胞治疗的真菌方法，通过心内注射促进心脏再生。评估梗塞大小以及心脏收缩和舒张功能。本研究有助于建立一个稳定且可重复的临床前大型动物HF模型，用于干...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam