Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

Resumo

Buscamos estabelecer um modelo suíno de insuficiência cardíaca induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido para testar o efeito e a segurança da administração intramiocárdia de células-tronco para terapias baseadas em células.

Resumo

Embora tenham sido alcançados avanços no tratamento da insuficiência cardíaca (HF) após o infarto do miocárdio (MI), o HF após o MI continua sendo uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. As terapias baseadas em células para reparação cardíaca e melhoria da função ventricular esquerda após o MI têm atraído considerável atenção. Assim, a segurança e a eficácia desses transplantes celulares devem ser testadas em um modelo animal de grande porte pré-clínico de HF antes do uso clínico. Os suínos são amplamente utilizados para pesquisas de doenças cardiovasculares devido à sua semelhança com os humanos em termos de tamanho cardíaco e anatomia coronária. Por isso, buscamos apresentar um protocolo eficaz para o estabelecimento de um modelo de HF crônico porcino utilizando oclusão de balão coronário de peito fechado da artéria circunflexo esquerda (LCX), seguido de ritmo ventricular rápido induzido à implantação do marca-passo. Oito semanas depois, as células-tronco foram administradas por injeção intramocárida na área peri-infarto. Em seguida, foram avaliados o tamanho do infarto, a sobrevivência celular e a função ventricular esquerda (incluindo ecocardiografia, parâmetros hemodinâmicos e eletrofisiologia). Este estudo ajuda a estabelecer um modelo de HF animal de grande porte pré-clínico estável para o tratamento de células-tronco.

Introdução

As doenças cardiovasculares, a doença arterial coronariana (CAD), em particular, continuam sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em Hong Kong e em todo o mundo¹. Em Hong Kong, foi projetado um aumento de 26% de 2012 para 2017 do número de pacientes do CAD tratados sob a Autoridade Hospitalar^. Entre todos os CADs, o infarto agudo do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte e complicações subsequentes, como insuficiência cardíaca (HF). Estes contribuem para cargas médicas, sociais e financeiras significativas. Em pacientes com MI, a terapia trombolítica ou intervenção coronária percutânea primária (ICI) é uma terapia eficaz na preservação da vida, mas essas terapias só podem reduzir a perda de cardiomiócito (CM) durante o MI. Os tratamentos disponíveis são incapazes de repor a perda permanente de CMs, o que leva à fibrose cardíaca, remodelação do miocárdio, arritmia cardíaca e, eventualmente, insuficiência cardíaca. A taxa de mortalidade em 1 ano pós-MI é de cerca de 7% com mais de 20% dos pacientes desenvolvendo HF³. Em estágio terminal, o transplante de coração é a única terapia eficaz disponível, mas é limitado pela escassez de órgãos disponíveis. Novas terapias são necessárias para reverter o desenvolvimento do HF pós-MI. Como resultado, a terapia baseada em células é considerada uma abordagem atraente para reparar os CMs prejudicados e a função ventricular esquerda (LV) em HF após a MI. Nossos estudos anteriores descobriram que o transplante de células-tronco é benéfico para a melhoria da função cardíaca após transplante intramial direto em pequenos modelos animais de MI^4,5. Protocolos de HF de animais de grande porte pré-clínicos padronizados são, portanto, necessários para testar melhor a eficácia e a segurança do transplante de células-tronco antes do uso clínico.

Décadas recentes têm testemunhado o uso generalizado de suínos em pesquisas cardiovasculares para terapia com células-tronco. Os porcos HF são um modelo promissor de pesquisa translacional devido à sua semelhança com os humanos em termos de tamanho cardíaco, peso, ritmo, função e anatomia da artéria coronária. Além disso, os modelos de HF suínos podem imitar pacientes pós-MI HF em termos de metabolismo cm, propriedades eletrofiológicas e alterações neuroendócrinas em condições isquêmicas⁶. O protocolo aqui apresentado utiliza um modelo HF de porco padronizado, empregando uma oclusão de balão coronário de peito fechado da artéria circunflexa esquerda (LCX), seguida de ritmo rápido induzido pela implantação do marca-passo. O estudo também otimiza a rota da administração intramialcardial de células-tronco para o tratamento de HF pós-MI. O objetivo é produzir um modelo animal suíno de infarto crônico do miocárdio que possa ser utilizado para desenvolver tratamentos clinicamente relevantes para pacientes com CAD grave.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA e regulamentos da Universidade de Hong Kong, e o protocolo foi aprovado pelo Comitê sobre o Uso de Animais Vivos no Ensino e Pesquisa (CULTAR) da Universidade de Hong Kong.

NOTA: Foram utilizados neste estudo suínos de fazenda fêmeas que pesam 35-40 kg (9-12 meses de idade). O fluxograma deste experimento é mostrado na Figura 1.

1. Procedimentos cirúrgicos

1. Anestesia e preparação do animal
   1. Acelere os animais por 12h e sujeito à privação de água por 4h antes do experimento.
   2. Anestesiar os suínos através de uma injeção intramuscular de tiletamina+zolezepam (2-7 mg/kg) e xilazina (0,5-1 mg/kg) preparada em 20 mL de soro fisiológico normal. Monitore os reflexos palpebrais do animal até que eles estejam ausentes.
   3. Remova o cabelo do porco e esterilize a pele no pescoço e na virilha para as seções 1.3-1.5. Desinfetar a área de operação 3x com 70% de etanol e betadina.
   4. Coloque um tubo endotraqueal de 7 mm na traqueia suína e coloque uma agulha de 22 G de indwelling na vena do ouvido.
   5. Mova o porco para a mesa de operação e coloque em uma posição supina. Conecte o tubo endotraqueal ao respirador e ventile mecanicamente (razão de tempo inspiratória/expiratória 1:2) o animal com isoflurano (inalação de 1,5%-2,0%) e oxigênio (inalação de 0,5-1,5 L/min).
   6. Monitore o eletrocardiograma da superfície e a pressão arterial, e monitore continuamente a frequência cardíaca, o ritmo cardíaco e a pressão arterial através de sistemas de gravação eletrofisiologia.
2. Ecocardiografia
   1. Mova o porco para a posição de decúbito lateral esquerdo e fixe na mesa.
   2. Coloque a sonda na região pericárdia e realize a ecocardiografia serial, incluindo imagens em modo 2D e M, utilizando um sistema ecocardiográfico de alta resolução e um transdutor de 3-9 MHz na linha de base, antes do transplante celular e 8 semanas após o transplante celular(Figura Suplementar 1).
   3. Analise todas as imagens obtidas usando software comercial. Calcule a dimensão diastólica final lv (LVEDD), a dimensão sistólica final de LV (LVESD), o volume diastólico final lv (LVEDV), o volume final-sistólico lv (LVESV), a fração de ejeção lv (LVEF) e a espessura da parede após a obtenção de imagens ecocardiográficas padrão a partir da visão parasternal do eixo longo.
      NOTA: Todas as análises off-line foram conduzidas por outro operador independente usando uma estação de trabalho de computador. A variabilidade das medições entre diferentes observadores foi de 4% com base em 20 imagens aleatórias repetidas. Todas as medições ecocardiográficas foram realizadas de acordo com as recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia.
3. Implantação de marca-passo
   1. Mova o porco para a posição supina e fixe os membros do porco sobre a mesa com alças.
   2. Localize a artéria carótida direita e a veia jugular no triângulo carótida (atrás do estenicleidomastoide e cercado pelo estiloide, o músculo digastrico e o omoidóide) e isole a artéria carótida direita e a veia jugular com fórceps hemostáticos em condições estéreis(Figura Suplementar 2). Ligate a extremidade distal da artéria carótida direita e veia jugular. Costurem os dois músculos com 2-0 Vicryl.
   3. Cannula a veia jugular direita com um angiocato e insira um marca-passo levar ao ventrículo direito sob orientação de raio-X(Figura 2).
   4. Isole o esternocleidomastoide e o músculo escelho anterior usando fórceps. Implante um marca-passo entre os dois músculos e costurem os dois músculos com seda 2-0. Conecte o marca-passo à liderança.
   5. Reprograme o marca-passo para backup do modo VVI (35 bpm) por um gerador de marca-passo após o transplante.
   6. Aplique ritmo ventricular rápido (150 batidas/min) para induzir HF por um gerador de marca-passo 4 semanas após a indução de MI. Em seguida, ajuste o marca-passo de volta para o modo VVI de backup em 8 semanas.
4. Análise invasiva do loop de volume de pressão
   NOTA: Realizar avaliação hemodinâmica invasiva na linha de base, antes do transplante celular e 8 semanas após o transplante celular para avaliar as alterações na função LV.
   1. Isole a artéria femoral direita e a veia femoral no triângulo femoral (cercado pelo ligamento inguinal, músculo sartório e músculo adutor longus)(Figura Suplementar 2).
   2. Cannula a artéria femoral direita com um angiocato e coloque um fio-guia na artéria através do angiocato. Remova o angiocato e cannulate uma baia 9F na artéria sob a orientação do fio-guia. Remova o fio-guia.
   3. Cannula a veia femoral direita com bainha de 12F como descrito na etapa 1.4.2. Insira um cateter de balão da baia 12F colocada na cava vena inferior (IVC) sob orientação de raio-X.
   4. Calibrar um cateter de volume de pressão (PV) de 7 Fr em soro fisiológico isotônico com um processador de sinal PV.
   5. Insira o cateter FOTOvoltaico no ápice lv da baia 9F colocada sob orientação de raio-X. Suspenda a ventilação e meça o derivado de pressão máxima positiva ventricular esquerda (+dP/dt), pressão sistólica final (ESP) e pressões diatólicas finais (EDP) com o processador de sinal PV.
   6. Meça a relação final sistólica de volume de pressão (ESPVR) pelo processador de sinal PV durante a oclusão do IVC.
   7. Reinicie a ventilação quando o procedimento estiver concluído.
5. Indução de MI
   1. Administrá-lo por via intravenosa (5 mg/kg por via intravenosa acima de 1h) e lidocaína (1,5 mg/kg de bolus intravenoso) ao animal antes da indução de MI para evitar arritmias ventriculares.
   2. Cannulate a artéria carótida direita com uma baia 8F como mencionado na etapa 1.4.3.
   3. Realize a angiografia coronária através de um cateter orientador de 6F JR4 através da baia colocada guiada pelo equipamento padrão de fluoroscopia do braço C.
   4. Ocluir a artéria coronária circunflexa esquerda (LCX) distal ao primeiro ramo marginal obtuso com angioplastia coronariana transluminal percutânea (PTCA) inflação do cateter de dilatação sob orientação de raio-X(Figura 2).
   5. Injete 1 mL de microesferas de esponja de 700 μm misturadas com 3 mL de soro fisiológico preparadas em uma seringa de 10 mL através do cateter de balão para bloquear o LCX, depois esvazie o balão e realize um angiograma para confirmar a oclusão.
   6. Repita o procedimento de injeção para obter um bloqueio completo bem sucedido.
   7. Monitore a frequência cardíaca animal e o ritmo para detectar arritmias cardíacas. Se a fibrilação ventricular aconteceu, use um desfibrilador externo e bifásico para restabelecer um ritmo sinusal usando choques de 150-300 J.
6. Injeção de células-tronco
   1. Atribuir aleatoriamente todos os animais com notável comprometimento da função cardíaca (LVEF < 40% às 8 semanas após a indução do MI) a dois grupos diferentes: um que receberá administração intramyocardial de 2 x 10⁸ células-tronco pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas de células-tronco (hiPSC-MSCs), e o outro que não receberá hiPSC-MSCs.
   2. Prepare os hiPSC-MSCs em 2 mL de soro fisiológico normal para transplante intramocárdio. Antes do transplante intramyocárdio hiPSC-MSCs, repita as etapas de anestesia e preparação animal mencionadas na seção 1.1, desta vez esterilizando 10 cm em torno da área de batida do ápice. Faça a toracotomia esquerda no espaço intercostal 4-5 com um retrátil. Realize a pericardiotomia para expor a parede lateral infarta.
      NOTA: O comprimento da incisão foi de 10-12 cm.
   3. Use 5-8 injeções intramyocárdicas (~0,3 mL por injeção) ao redor da área infarto para administrar o meio de cultura(Tabela de Materiais) a um grupo de animais ou 2 x 108 hiPSC-MSCs para o outro grupo(Figura 3). Evite cuidadosamente qualquer dano às artérias coronárias para reduzir o risco de hemorragia.
   4. Feche o espaço intercostal com fio de ferro e feche a camada muscular com 2-0 de seda. Costurar o tecido subcutâneo e a pele com 2-0 vicryl.
7. Estimulação elétrica programada intracardiac
   1. Realizar estimulação elétrica programada utilizando um estimulador programável para avaliar a inducibilidade da taquiarritmia ventricular (TV) após a terapia de transplante celular.
   2. Insira um cateter eletrofisiológico 6F no ápice ventricular direito através da veia femoral antes de sacrificar todos os animais.
   3. Exibir as gravações intracardicascas com os condutores de eletrocardiograma de superfície I, II e III no sistema de gravação eletrofisiológica a uma velocidade de 200 mm/s. Entregue uma largura de pulso de 2 ms a 2x o limiar diastólico usando um estimulador.
   4. Entregue um trem de oito estímulos (S1) em dois comprimentos de ciclo de unidade (200 ms e 300 ms), seguido por um (S2) ou dois (S2 e S3) estímulos extras prematuros.
   5. Reduza sequencialmente os intervalos de acoplamento até que um período refratário ou arritmia eficaz ventricular seja induzido. Observe a presença de VT sustentado indutível (>10 s).

2. Protocolo pós-operatório

1. Medicina pós-operatória
   1. Realizar terapias farmacológicas convencionais para HF. Em suma, administre oralmente o succinato de metoprolol (25 mg) e ramipril (2,5 mg) a todos os animais diariamente.
   2. Administrou intramuscularmente enrofloxacina (5 mg/kg) e buprenorfina (0,01 mg/kg) a todos os animais diariamente durante uma semana após a cirurgia para prevenir infecções e aliviar a dor.
   3. Para minimizar a rejeição imunológica, administre oralmente um esteroide (40 mg/dia oralmente) e ciclosporina (200 mg/dia oralmente) a todos os animais de 3 dias antes do transplante celular até 8 semanas depois.
2. Avaliação do tamanho do infarto
   1. Eutanize os animais por uma overdose de dormitório (sódio pentobarbital, 100 mg/kg, IV) no final do experimento.
   2. Abra o peito e pegue o coração. Enxágüe o coração em 0,9% salino.
   3. Seção serial com amostras de tecido LV com bisturi de 1 cm de espessura na direção transversal lv.
   4. Selecione porções das fatias que contenham o miocárdio infartado para medir a espessura da parede e a área de infarto.
   5. Capture a imagem dessas fatias e analise quantitativamente a espessura da parede e a área de infarto usando software de análise de imagem comercial.
   6. Fixar o tecido em 10% de formalina a 4 °C por um mês. Incorpore o tecido dentro, adjacente e remoto aos locais de infarto (~1 cm² pedaços) em parafina. Seção em fatias de 5 μm usando um microtome para exame histológico.
3. Sobrevivência celular
   1. Detecte o enxerto das células transplantadas por coloração imunohistoquímica com antígeno nuclear anti-humano (HNA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.
   2. Capture a imagem em três seções diferentes em cinco campos aleatórios em cada animal e analise quantitativamente as células positivas na zona peri-infarto.
      NOTA: O sistema de captura de imagens e o software de análise de imagens foram usados para capturar e analisar as imagens das seções cardíacas.

Resultados

Mortalidade
Neste estudo, foram utilizados 24 suínos. Três deles morreram durante a indução de MI por causa de VT sustentado. Um animal morreu na cirurgia de coração aberto para injeção celular por causa de sangramento na ferida. Dois animais morreram por infecção grave. Dois animais foram excluídos por causa da ligeira redução do EF (redução de LVEF > 40% da linha de base). Como resultado, 16 animais completaram todo o protocolo de estudo.

Discussão

Modelos animais padrão são de suma importância para entender a fisiopatologia e mecanismos de doenças e testar novas terapêuticas. Nosso protocolo estabelece um modelo suíno de HF induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido. Oito semanas após a indução de MI, os animais desenvolveram prejuízo significativo de LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/dt e ESPVR. Este protocolo também testa o método de administração da terapia de células-tronco para regeneração cardíaca por injeção intramocá...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam