הקמת מודל חזירים של אי ספיקת לב לאחר שריר הלב לטיפול בתאי גזע

Summary

ביקשנו לבסס מודל חזירים של אי ספיקת לב המושרה על ידי חסימת עורק היקפית שמאל וצעידה מהירה כדי לבדוק את ההשפעה והבטיחות של ניהול פנים-לב של תאי גזע עבור טיפולים מבוססי תאים.

Abstract

למרות ההתקדמות הושגו בטיפול אי ספיקת לב (HF) בעקבות אוטם שריר הלב (MI), HF בעקבות MI נשאר אחד הגורמים העיקריים של תמותה ותאו נפש ברחבי העולם. טיפולים מבוססי תאים לתיקון לב ושיפור של תפקוד החדר השמאלי לאחר MI משכו תשומת לב ניכרת. בהתאם לכך, הבטיחות והיעילות של השתלות תאים אלה יש לבדוק במודל בעל חיים פרה-קליני גדול של HF לפני השימוש הקליני. חזירים נמצאים בשימוש נרחב למחקר מחלות לב וכלי דם בשל הדמיון שלהם לבני אדם במונחים של גודל הלב ואנטומיה כלילית. לכן, ביקשנו להציג פרוטוקול יעיל להקמת מודל HF כרוני porcine באמצעות חסימת בלון כלילי חזה סגור של עורק ההיקף השמאלי (LCX), ואחריו צעידה חדרית מהירה המושרה עם השתלת קוצב לב. שמונה שבועות לאחר מכן, תאי הגזע ניתנו על ידי הזרקת פנים-שריר הלב באזור האוטם פרי. לאחר מכן גודל האוטם, הישרדות התא, ותפקוד החדר השמאלי (כולל אקוקרדיוגרפיה, פרמטרים המודינמיים, אלקטרופיזיולוגיה) הוערכו. מחקר זה מסייע לבסס מודל HF בעל חיים גדול פרה-לקלינלי יציב לטיפול בתאי גזע.

Introduction

מחלות לב וכלי דם, מחלת עורקים כליליים (CAD) בפרט, להישאר הגורם העיקרי של חולות ותמותה בהונג קונג וברחבי העולם¹. בהונג קונג, עלייה של 26% בין 2012 ל-2017 של מספר חולי CAD שטופלו תחת רשות בתי^{החולים היה צפוי 2}. בין כל CADs, אוטם שריר הלב חריפה (MI) הוא גורם מוביל למוות וסיבוכים הבאים, כגון אי ספיקת לב (HF). אלה תורמים לנטל רפואי, חברתי וכלכלי משמעותי. בחולים עם MI, טיפול טרוממבוליטי או התערבות כלילית רדיפתית ראשונית (PCI) הוא טיפול יעיל בשימור החיים, אבל טיפולים אלה יכולים רק להפחית קרדיומיוציט (CM) אובדן במהלך MI. הטיפולים הזמינים אינם מסוגלים לחדש את האובדן הקבוע של CMs, מה שמוביל פיברוזיס לב, איחוי שריר הלב, הפרעה בקצב הלב, ובסופו של דבר אי ספיקת לב. שיעור התמותה בשנה שלאחר MI הוא סביב 7% עם יותר מ 20% חולים לפתח HF³. בחולים HF בשלב הסופי, השתלת לב הוא הטיפול היעיל הזמין היחיד, אבל זה מוגבל על ידי מחסור באיברים זמינים. טיפולים חדשניים נחוצים כדי להפוך את הפיתוח של HF שלאחר MI. כתוצאה מכך, טיפול מבוסס תאים נחשב גישה אטרקטיבית כדי לתקן את CMs לקוי ותפקוד החדר השמאלי (LV) ב HF בעקבות MI. המחקרים הקודמים שלנו מצאו השתלת תאי גזע להיות מועיל לשיפור תפקוד הלב לאחר השתלת פנים פנים ישירה במודלים בעלי חיים קטנים של MI^4,,5. פרוטוקולי HF בעלי חיים גדולים פרה-קליניים מתוקנים נדרשים כדי לבחון עוד יותר את היעילות והבטיחות של השתלת תאי גזע לפני השימוש הקליני.

העשורים האחרונים היו עדים לשימוש הנרחב של חזירים במחקר לב וכלי דם לטיפול בתאי גזע. חזירי HF הם מודל מבטיח של מחקר תרגום בשל הדמיון שלהם לבני אדם במונחים של גודל הלב, משקל, קצב, תפקוד, ואנטומיה עורקים כליליים. יתר על כן, מודלים HF porcine יכול לחקות לאחר MI HF חולים במונחים של חילוף חומרים CM, תכונות אלקטרופיזיולוגיות, ושינויים נוירואנדוקריניים בתנאים איסכמיים⁶. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש כזה מתוקנן חזיר HF מודל, העסקת חסימת בלון כלילי חזה סגור של עורק הימול השמאלי (LCX) ואחריו צעידה מהירה המושרה על ידי השתלת קוצב לב. המחקר גם מייעל את המסלול של ניהול פנים-לב של תאי גזע לטיפול ב-HF שלאחר MI. המטרה היא לייצר מודל של בעלי חיים של אוטם שריר הלב כרוני שיכול לשמש לפיתוח טיפולים הרלוונטיים קלינית עבור חולים עם CAD חמור.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותקנות של אוניברסיטת הונג קונג, והפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים בהוראה ומחקר (CULTAR) באוניברסיטת הונג קונג.

הערה: חזירי חווה נקבה במשקל 35-40 ק"ג (9-12 חודשים) שימשו למחקר זה. תרשים הזרימה של ניסוי זה מוצג באות 1.

1. הליכים כירורגיים

1. הרדמה והכנת החיה
   1. צם את בעלי החיים במשך 12 שעות וכפוף למחסור במים במשך 4 שעות לפני הניסוי.
   2. להנפין את החזירים באמצעות הזרקה תוך שרירית של tiletamine + zolezepam (2-7 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (0.5-1 מ"ג/ק"ג) מוכן 20 מ"ל של תמיסת מלח רגילה. נטר את רפלקסי פלורל של החיה עד שהם נעדרים.
   3. מסירים את שיער החזיר ומחטאים את העור בצוואר ובמפשעה למקטעים 1.3-1.5. חיטוי אזור הפעולה פי 3 עם 70% אתנול ובטאדין.
   4. מניחים צינור אנדוטרצ'יל 7 מ"מ לתוך קנה הנשימה של הקיצין ומניחים מחט וירידית 22 גרם לתוך וון האוזן.
   5. מעבירים את החזיר לשולחן הניתוחים וממקם בתנוחה סופית. חבר את צינור ה אנדוטרצ'ל למכונת ההנשמה ואוורור מכני (יחס זמן אינספירי/תפוגה 1:2) את בעל החיים עם שאיפה isoflurane (1.5%-2.0% שאיפה) וחמצן (0.5-1.5 L/min אינהלציה).
   6. נטרו את האלקטרוקרדיוגרם ולחץ הדם של פני השטח, עקבו באופן רציף אחר קצב הלב, קצב הלב ולחץ הדם העורקי באמצעות מערכות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות.
2. אקוקרדיוגרפיה (אקוקרדיוגרפיה)
   1. מעבירים את החזיר למיקום ההתפלה הירבי בצד שמאל ומסדרים על השולחן.
   2. לשים את הגשוש על אזור הלב ולבצע אקוקרדיוגרפיה טורית, כולל הדמיה דו-ממדית ו-M-מצב, באמצעות מערכת אקו-קרדיוגרפית ברזולוציה גבוהה ומתמר 3-9 MHz בקו הבסיס, לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר השתלת תאים(איור משלים 1).
   3. נתח את כל התמונות שהושגו באמצעות תוכנה מסחרית. חשב את ממד הקצה-דיאסטולי LV (LVEDD), ממד קצה-סיסטולי LV (LVESD), אמצעי אחסון סוף-דיאסטולי LV (LVEDV), אמצעי אחסון סוף-סיסטולי LV (LVESV), שבר פליטה LV (LVEF) ועובי הקיר לאחר מתקבלות תמונות אקו-קרדיוגרפיות סטנדרטיות מהתצוגה של ציר ארוך פארסטראלי.
      הערה: כל הניתוחים ההתנתקים בוצעו על-ידי מפעיל עצמאי אחר באמצעות תחנת עבודה במחשב. השונות של המדידות בין משקיפים שונים הייתה 4% בהתבסס על 20 תמונות אקראיות חוזרות ונשנות. כל המדידות הדקרדיוגרפיות בוצעו בהתאם להמלצות האגודה האמריקאית לאקוקרדיוגרפיה.
3. השתלת קוצב לב
   1. מעבירים את החזיר לתמונת העל-תתנוחה ומסדרים את איברי החזיר על השולחן ברצועות.
   2. אתר את העורק הראשי הימני ואת וריד הצוואר במשולש הראשי (מאחורי sternocleidomastoid ומוקף stylohyoid, שריר digastric, omohyoid) ולבודד את העורק הראשי הימני וריד הצוואר עם מכריחים hemostatic בתנאים סטריליים(איור משלים 2). לחתוך את הקצה הדיסטלי של העורק הראשי הימני וריד הצוואר. לתפור את שני השרירים עם 2-0 Vicryl.
   3. לתבל את וריד הצוואר הימני עם אנגיוקט ולהכניס קוצב לב להוביל לחדר הימני תחת הדרכת רנטגן(איור 2).
   4. לבודד את הסטרנוקלידום ואת שריר קנה המידה הקדמי באמצעות מרטטים. להשתיל קוצב לב בין שני השרירים ולתפור את שני השרירים עם 2-0 משי. חבר את קוצב הלב להובלה.
   5. לתכנת מחדש את קוצב הלב למצב VVI גיבוי (35 bpm) על ידי גנרטור קוצב לב לאחר ההשתלה.
   6. להחיל ריווח מהיר בחדר (150 פעימות / דקה) כדי לגרום HF על ידי גנרטור קוצב לב 4 שבועות לאחר אינדוקציה MI. לאחר מכן להגדיר את קוצב הלב בחזרה למצב VVI גיבוי ב 8 שבועות.
4. ניתוח לולאת נפח לחץ פולשנית
   הערה: לבצע הערכה המודינמית פולשנית בבסיס, לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר השתלת תאים כדי להעריך שינויים בתפקוד LV.
   1. לבודד את עורק הירך הימני ואת וורין הירך במשולש הירך (מוקף ברצועה העין, שריר sartorius, ושריר adductor longus)(דמות משלימה 2).
   2. תנקה את עורק הירך הימני עם אנגיוקה והנח חוט מנחה לתוך העורק דרך האנגיוקה. הסר את האנגיוקת וחוטף נדן 9F לתוך העורק תחת הדרכתו של חוט ההדרכה. הסר את חוט היישור.
   3. תוסכל את ויר הירך הימני עם נדן 12F כמתואר בשלב 1.4.2. הכנס צנתר בלון מן נדן 12F ממוקם לתוך קאווה וונה נחות (IVC) תחת הדרכת רנטגן.
   4. כייל צנתר 7 Fr בלחץ נפח (PV) בתמיסת מלח isotonic עם מעבד אותות PV.
   5. הכנס את צנתר PV לתוך שיא LV מתוך נדן 9F ממוקם תחת הדרכת רנטגן. השהה את האוורור ומדד את נגזרת הלחץ החיובית המקסימלית (+dP/dt), לחץ סוף-סיסטולי (ESP) ולחצים סופיים דיסטוליים (EDP) עם מעבד אותות PV.
   6. למדוד את קשרי הלחץ-נפח סיסטולי סוף (ESPVR) על-ידי מעבד אותות PV במהלך ההסתה של IVC.
   7. הפעל מחדש את האוורור לאחר סיום ההליך.
5. אינדוקציה של MI
   1. תוך וריד לנהל amiodarone (5 מ"ג/ ק"ג דרך הווריד מעל 1 שעות) ולידוקאין (1.5 מ"ג / ק"ג בולוס תוך וריד) לחיה לפני אינדוקציה של MI כדי למנוע הפרעות בקצב הלב בחדר.
   2. תחכל את העורק הראשי הימני עם נדן 8F כפי שהוזכר בשלב 1.4.3.
   3. בצע את אנגיוגרפיה כלילית באמצעות 6F JR4 מעל התיל מנחה צנתר באמצעות נדן ממוקם מונחה על ידי ציוד פלואורוסקופיה זרוע C סטנדרטי.
   4. תחסום את העורק הכלילי (LCX) היקטין לענף השולי האטומלי הראשון עם אנגיופלסטיקה כלילית רדקנית (PTCA) אינפלציה של צנתר בלון בלון תחת הדרכת רנטגן(איור 2).
   5. להזריק 1 מ"ל של 700 מיקרוספירות ספוג μm מעורבב עם 3 מ"ל של תמיסת מלח מוכן מזרק 10 מ"ל דרך צנתר הבלון כדי לחסום את LCX, לאחר מכן לנפח את הבלון ולבצע אנגיוגרמה כדי לאשר את החסימה.
   6. חזור על הליך ההזרקה כדי להשיג חסימה מלאה מוצלחת.
   7. לפקח על קצב הלב והקצב של בעלי החיים כדי לזהות הפרעות בקצב הלב. אם קרה פתפור בחדר, השתמש בדפיברילטור חיצוני דו-פי-זמני כדי לכונן מחדש קצב סינוסים באמצעות 150-300 J זעזועים.
6. הזרקת תאי גזע
   1. באופן אקראי להקצות את כל בעלי החיים עם פגיעה בולטת בתפקוד הלב (LVEF < 40% ב 8 שבועות לאחר אינדוקציה של MI) לשתי קבוצות שונות: אחד שיקבל ניהול פנים-לב של 2 x 10 8 תאי גזע^{פלורופוטנטיים} המושרה תאי גזע פלורופוטנטיים נגזר mesenchymal (hiPSC-MSCs), והשני שלא יקבל hiPSC-MSCs.
   2. הכן את hiPSC-MSCs ב 2 מ"ל של תמיסת מלח רגילה להשתלת תוך-שריר הלב. לפני השתלת hiPSC-MSCs תוך-לב, חזור על ההרדמה ועל שלבי הכנת בעלי חיים המוזכרים בסעיף 1.1, הפעם חיטוי 10 ס"מ סביב אזור פעימה apex. בצע את ניקור החזה השמאלי בחלל הבין-קוסטלי 4-5 עם מפשק. לבצע כריתת הלב כדי לחשוף את הקיר האוטם לחוץ.
      הערה: אורך החתך היה 10-12 ס"מ.
   3. השתמש 5-8 זריקות פנים-לב (~ 0.3 מ"ל לכל הזרקה) סביב האזור האוטם כדי לנהל מדיום תרבות (טבלת חומרים) לקבוצה אחת של בעלי חיים או 2 x 108 hiPSC-MSCs לקבוצההשנייה (איור 3). הימנע בזהירות כל נזק לעורקים הכליליים כדי להפחית את הסיכון לדימום.
   4. סגור את החלל הבין-קוסטלי עם חוט ברזל וסגור את שכבת השריר עם משי 2-0. לתפור את הרקמה התת עורית ועור עם 2-0 vicryl.
7. גירוי חשמלי מתוכנת תוך-לבבי
   1. לבצע גירוי חשמלי מתוכנת באמצעות ממריץ לתכנות כדי להעריך את הגירוי של tachyarrhythmia בחדר (VT) לאחר הטיפול השתלת התא.
   2. הכנס צנתר אלקטרופיזיולוגי 6F לתוך החלק הימני של החדר דרך וריד הירך לפני הקרבת כל בעלי החיים.
   3. הצג את הקלטות התוך לב עם פני השטח אלקטרוקרדיוגרם מוביל I, II, ו- III על מערכת ההקלטה אלקטרופיזיולוגית במהירות של 200 מ"מ / s. לספק רוחב פולס 2 ms ב 2x הסף הdiastolic באמצעות ממריץ.
   4. לספק רכבת צעידה של שמונה גירויים (S1) בשני אורכי מחזור נסיעה (200 ms ו 300 אלפיות השנייה), ואחריו אחד (S2) או שניים (S2 ו- S3) גירויים נוספים בטרם עת.
   5. קיצור רצף של מרווחי הזיווג עד לתקופת עשע יעילה בחדר או להפרעה בקצב הלב. שים לב לנוכחות של VT ממושך בלתי ניתן להוות (>10 s).

2. פרוטוקול לאחר הניתוח

1. רפואה לאחר הניתוח
   1. בצע טיפולים תרופתיים קונבנציונליים עבור HF. בקצרה, דרך אגב לנהל metoprolol succinate (25 מ"ג) ו ramipril (2.5 מ"ג) לכל בעלי החיים מדי יום.
   2. תוך שרירי לנהל enrofloxacin (5 מ"ג / ק"ג) ו buprenorphine (0.01 מ"ג/ ק"ג) לכל בעלי החיים מדי יום במשך 1 שבוע לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום ולהקל על כאב.
   3. כדי למזער את הדחייה החיסונית, דרך הפה לנהל סטרואידים (40 מ"ג ליום דרך הפה) ו ציקלוספורין (200 מ"ג ליום דרך הפה) לכל בעלי החיים מ 3 ימים לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר.
2. הערכת גודל אוטם
   1. המתת סד לבעלי החיים על ידי מנת יתר של dorminal (נתרן פנטוברביטל, 100 מ"ג/ ק"ג, IV) בסוף הניסוי.
   2. פתח את התיבה ואסוף את הלב. לשטוף את הלב ב 0.9% תמיסת מלח.
   3. באופן סדרתי סעיף LV רקמת דגימות עם אזמל ב1 ס"מ עובי בכיוון רוחבי LV.
   4. בחר חלקים מהפרוסות המכילות את שריר הלב האוטם כדי למדוד את עובי הקיר ואת אזור האוטם.
   5. ללכוד את התמונה של פרוסות אלה ולנתח כמותית את עובי הקיר ואת האזור האוטם באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מסחרית.
   6. לתקן את הרקמה ב 10% פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס לחודש. הטבע את הרקמה בתוך, סמוך ומרוחק לאתרי אוטם (~ 1^{ס"מ 2 חתיכות)} בפרפין. מקטע לפרוסות 5 μm באמצעות microtome לבדיקה היסטולוגית.
3. הישרדות תאים
   1. לזהות את ההטבעה של התאים המושתלים על ידי כתם חיסוני עם אנטיגן גרעיני אנטי אנושי (HNA) על פי הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
   2. ללכוד את התמונה בשלושה מקטעים שונים בחמישה שדות אקראיים בכל בעל חיים ולנתח כמותית את התאים החיוביים באזור peri-infarct.
      הערה: תוכנת לכידת המערכת וניתוח התמונות של התמונה שימשה ללכידת וניתוח התמונות של מקטעי הלב.

תוצאות

התמותה
בסך הכל 24 חזירים שימשו במחקר זה. שלושה מהם מתו במהלך אינדוקציה MI בגלל VT מתמשך. חיה אחת מתה בניתוח לב פתוח להזרקת תאים בגלל דימום בפצע. שתי חיות מתו בגלל זיהום חמור. שני בעלי חיים לא נכללו בשל הפחתה קלה של EF (הפחתה של LVEF > 40% מקו הבסיס). כתוצאה מכך, 16 בעלי חיים ה?...

Discussion

מודלים סטנדרטיים של בעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה כדי להבין את הפתופיזיולוגיה ומנגנונים של מחלות וטיפולים רומן בדיקה. הפרוטוקול שלנו קובע מודל של HF המושרה על ידי חסימת עורק הירק השמאלי וצעידה מהירה. שמונה שבועות לאחר האינדוקציה של MI, בעלי החיים פיתחו פגיעה משמעותית של LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/ dt, ו E...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam