Établissement d’un modèle porcin d’insuffisance cardiaque d’infarctus post-myocardique pour le traitement des cellules souches

Résumé

Nous avons cherché à établir un modèle porcin de l’insuffisance cardiaque induite par le blocage de l’artère circonflexe gauche et le rythme rapide pour tester l’effet et l’innocuité de l’administration intramyocardique des cellules souches pour les thérapies à base de cellules.

Résumé

Bien que des progrès aient été réalisés dans le traitement de l’insuffisance cardiaque (HF) à la suite d’un infarctus du myocarde (MI), le HF suivant l’IM demeure l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. Les thérapies à base de cellules pour la réparation cardiaque et l’amélioration de la fonction ventriculaire gauche après MI ont attiré l’attention considérable. Par conséquent, l’innocuité et l’efficacité de ces transplantations cellulaires devraient être testées dans un modèle préclinique de HF avant l’utilisation clinique. Les porcs sont largement utilisés pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires en raison de leur similitude avec les humains en termes de taille cardiaque et d’anatomie coronarienne. Par conséquent, nous avons cherché à présenter un protocole efficace pour l’établissement d’un modèle chronique de HF porcin utilisant l’occlusion coronaire fermée-poitrine de l’artère circonflexe gauche (LCX), suivie du rythme ventriculaire rapide induit avec l’implantation de stimulateur cardiaque. Huit semaines plus tard, les cellules souches ont été administrées par injection intramyocardique dans la zone péri-infarctus. Ensuite, la taille infarctus, la survie cellulaire et la fonction ventriculaire gauche (y compris l’échocardiographie, les paramètres hémodynamiques et l’électrophysiologie) ont été évalués. Cette étude aide à établir un modèle préclinique stable de grand animal HF pour le traitement des cellules souches.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires, les maladies coronariennes (CAD) en particulier, restent la principale cause de morbidité et de mortalité à Hong Kong et dans le monde¹. À Hong Kong, une augmentation de 26 % entre 2012 et 2017 du nombre de patients atteints de CAO traités dans le cadre de l’Autorité hospitalière était prévue^{de 2}. Parmi tous les CAO, l’infarctus aigu du myocarde (MI) est l’une des principales causes de décès et de complications subséquentes, comme l’insuffisance cardiaque (HF). Celles-ci contribuent à des charges médicales, sociales et financières importantes. Chez les patients atteints de MI, la thérapie thrombolytique ou l’intervention coronaire percutanée primaire (PCI) est une thérapie efficace dans la préservation de la vie, mais ces thérapies ne peuvent réduire la perte de cardiomyocyte (CM) pendant l’IM. Les traitements disponibles sont incapables de reconstituer la perte permanente de CMs, qui conduit à la fibrose cardiaque, le remodelage myocardique, l’arythmie cardiaque, et finalement l’insuffisance cardiaque. Le taux de mortalité à 1 an après l’IM est d’environ 7% avec plus de 20% de patients développant HF³. Dans les patients HF en phase finale, la transplantation cardiaque est la seule thérapie efficace disponible, mais elle est limitée par une pénurie d’organes disponibles. De nouvelles thérapies sont nécessaires pour inverser le développement de l’après-MI HF. En conséquence, la thérapie à base de cellules est considérée comme une approche attrayante pour réparer les CM altérés et la fonction ventriculaire gauche d’amélioration (LV) dans HF suivant MI. Nos études précédentes ont trouvé la transplantation de cellules souches pour être bénéfique pour l’amélioration de la fonction cardiaque après la transplantation intramyocardique directe dans les modèles de petits animaux de MI^4,5. Des protocoles précliniques normalisés de HF pour les grands animaux sont donc nécessaires pour tester davantage l’efficacité et l’innocuité de la transplantation de cellules souches avant l’utilisation clinique.

Au cours des dernières décennies, on a assisté à l’utilisation généralisée de porcs dans la recherche cardiovasculaire pour la thérapie par cellules souches. Les porcs HF sont un modèle prometteur de recherche translationnelle en raison de leur similitude avec les humains en termes de taille cardiaque, poids, rythme, fonction, et anatomie des artères coronaires. En outre, les modèles HF porcins peuvent imiter les patients post-MI HF en termes de métabolisme CM, propriétés électrophysiologiques, et les changements neuroendocrines dans des conditions ischémiques⁶. Le protocole présenté ici utilise un tel modèle standardisé de HF de porc, employant une occlusion de ballon coronaire fermé-coffre de l’artère circonflexe gauche (LCX) suivie par le rythme rapide induit par l’implantation de stimulateur cardiaque. L’étude optimise également la voie de l’administration intramyocardique des cellules souches pour le traitement de la post-MI HF. Le but est de produire un modèle animal porcin de l’infarctus chronique du myocarde qui peut être utilisé pour développer des traitements qui sont cliniquement pertinents pour les patients atteints de CAO sévère.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par les National Institutes of Health and regulations des États-Unis de l’Université de Hong Kong, et le protocole a été approuvé par le Comité sur l’utilisation des animaux vivants dans l’enseignement et la recherche (CULTAR) de l’Université de Hong Kong.

REMARQUE : Des porcs de ferme femelles pesant de 35 à 40 kg (9-12 mois) ont été utilisés pour cette étude. Le diagramme de cette expérience est illustré à la figure 1.

1. Interventions chirurgicales

1. Anesthésie et préparation de l’animal
   1. Jeûnez les animaux pendant 12 h et soumettementmentmentmentmentment.
   2. Anesthésier les porcs par une injection intramusculaire de tiletamine+zolezepam (2-7 mg/kg) et de xylazine (0,5-1 mg/kg) préparée en 20 mL de solution saline normale. Surveillez les réflexes palpébraux de l’animal jusqu’à ce qu’ils soient absents.
   3. Retirer les poils du porc et stériliser la peau au cou et l’aine pour les sections 1.3-1.5. Désinfecter la zone d’opération 3x avec 70% d’éthanol et de bétadine.
   4. Placez un tube endotrachéal de 7 mm dans la trachée porcine et placez une aiguille veineuse de 22 G dans la vena.
   5. Déplacer le porc sur la table d’opération et placer en position supination. Connectez le tube endotrachéal au respirateur et ventilez mécaniquement (rapport temps d’inspiration/expiration 1:2), l’animal avec isoflurane (inhalation de 1,5%-2,0%)) et d’oxygène (inhalation de 0,5-1,5 L/min).
   6. Surveillez l’électrocardiogramme de surface et la pression artérielle, et surveillez en permanence la fréquence cardiaque, le rythme cardiaque et la pression artérielle par l’intermédiaire de systèmes d’enregistrement d’électrophysiologie.
2. Échocardiographie
   1. Déplacez le porc vers la position latérale latérale de decubitus gauche et fixer sur la table.
   2. Placez la sonde sur la région péricardique et effectuez l’échocardiographie en série, y compris l’imagerie en mode 2D et M, à l’aided’unsystème échocardiographique à haute résolution et d’un transducteur de 3 à 9 MHz à la ligne de base, avant la transplantation cellulaire et 8 semaines après la transplantation cellulaire ( Figure supplémentaire 1 ).
   3. Analyser toutes les images obtenues à l’aide d’un logiciel commercial. Calculer la dimension lv end-diastolique (LVEDD), la dimension systolique de fin de LV (LVESD), le volume fin-diastolique de LV (LVEDV), le volume fin-systolique de LV (LVESV), la fraction d’éjection de LV (LVEF), et l’épaisseur de mur après que des images échocardiographiques standard soient obtenues à partir de la vue parasternal à long axe.
      REMARQUE : Toutes les analyses hors ligne ont été effectuées par un autre opérateur indépendant à l’aide d’un poste de travail informatique. La variabilité des mesures entre les différents observateurs était de 4 % sur la base de 20 images aléatoires répétées. Toutes les mesures échocardiographiques ont été effectuées conformément aux recommandations de l’American Society of Echocardiography.
3. Implantation de stimulateurs cardiaques
   1. Déplacez le porc à la position de supination et fixer les membres du porc sur la table avec des sangles.
   2. Localisez l’artère carotide droite et la veine jugulaire dans le triangle carotide (derrière le sternocleidomastoid et entouré par le stylohyoïde, le muscle digastrique, et l’omohyoïde) et isoler l’artère carotide droite et la veine jugulaire avec des forceps hémostatiques dans des conditions stériles (Figure supplémentaire 2). Lier l’extrémité distale de l’artère carotide droite et de la veine jugulaire. Coudre les deux muscles avec 2-0 Vicryl.
   3. Canule la veine jugulaire droite avec un angiocath et insérer un stimulateur cardiaque conduire au ventricule droit sous guidage à rayons X (Figure 2).
   4. Isoler le sternocleidomastoid et le muscle scalene antérieur à l’aide de forceps. Implantez un stimulateur cardiaque entre les deux muscles et coudre les deux muscles avec de la soie 2-0. Connectez le stimulateur cardiaque au plomb.
   5. Reprogrammer le stimulateur cardiaque pour remplacer le mode VVI (35 bpm) par un générateur de stimulateur cardiaque après la transplantation.
   6. Appliquer le rythme ventriculaire rapide (150 battements/min) pour induire la HF par un générateur de stimulateur cardiaque 4 semaines après l’induction de MI. Ensuite, réglez le stimulateur cardiaque en mode VVI de sauvegarde à 8 semaines.
4. Analyse invasive de la boucle de volume de pression
   REMARQUE : Effectuer l’évaluation hémodynamique invasive à la ligne de base, avant la transplantation cellulaire et 8 semaines après la transplantation cellulaire pour évaluer les changements dans la fonction de LV.
   1. Isoler l’artère fémorale droite et la veine fémorale dans le triangle fémoral (entouré par le ligament inguinal, le muscle sartorius et le muscle adducteur longus) (Figure supplémentaire 2).
   2. Cannuler l’artère fémorale droite avec un angiocath et placer un fil de guidage dans l’artère par l’intermédiaire de l’angiocath. Retirez l’angiocath et canulez une gaine 9F dans l’artère sous la direction du fil de guidage. Retirez le fil de guidage.
   3. Cannuler la veine fémorale droite avec une gaine de 12F comme décrit à l’étape 1.4.2. Insérez un cathéter de ballon de la gaine 12F placée dans le vena cava inférieur (IVC) sous guidage de rayon X.
   4. Calibrer un cathéter à volume de pression (PV) de 7 Fr en solution saline isotonique à l’aide d’un processeur de signal PV.
   5. Insérez le cathéter PV dans l’apex LV de la gaine 9F placée sous guidage aux rayons X. Suspendre la ventilation et mesurer le dérivé de pression positive maximale ventriculaire gauche (+dP/dt), la pression systolique fin (ESP) et les pressions diastoliques finnelles (EDP) avec le processeur de signal PV.
   6. Mesurer la relation systolique fin de pression-volume (ESPVR) par le processeur de signal PV pendant l’occlusion de l’IVC.
   7. Redémarrez la ventilation lorsque la procédure est terminée.
5. Induction de MI
   1. Administrer par voie intraveineuse l’amiodarone (5 mg/kg par voie intraveineuse sur 1 h) et la lidocaïne (1,5 mg/kg de bolus intraveineux) à l’animal avant l’induction de l’IM pour prévenir les arythmies ventriculaires.
   2. Cannuler l’artère carotide droite avec une gaine de 8F comme mentionné à l’étape 1.4.3.
   3. Effectuer l’angiographie coronaire à travers un cathéter de guidage 6F JR4 sur le fil via la gaine placée guidée par l’équipement standard de fluoroscopie de bras C.
   4. Occlude de l’artère coronaire circonflexe gauche (LCX) distale à la première branche marginale obtus avec angioplastie coronaire transluminale percutané (PTCA) inflation de cathéter de ballon de dilatation sous la direction de rayon X (figure 2).
   5. Injecter 1 mL de 700 microsphères d’éponge s’y rapportant, mélangées à 3 mL de solution saline préparée dans une seringue de 10 mL à travers le cathéter de ballon pour bloquer le LCX, puis dégonfler le ballon et effectuer une angiographie pour confirmer l’occlusion.
   6. Répétez la procédure d’injection pour obtenir un blocage complet réussi.
   7. Surveillez la fréquence cardiaque et le rythme de l’animal pour détecter les arythmies cardiaques. Si la fibrillation ventriculaire s’est produite, utilisez un défibrillateur biphasique externe pour rétablir un rythme sinusal à l’aide de chocs de 150 à 300 J.
6. Injection de cellules souches
   1. Assigner au hasard tous les animaux ayant une déficience notable de la fonction cardiaque (LVEF < 40% à 8 semaines après l’induction de l’IM) à deux groupes différents: l’un qui recevra l’administration intramyocardiale de 2 x^{10 8} cellules souches pluripotentes induites par l’homme souches souches dérivées de cellules souches mésenchymales (hiPSC-MSC), et l’autre qui ne recevra pas hiPSC-MSCs induits par l’homme.
   2. Préparer le hiPSC-MSCs dans 2 mL de saline normale pour la transplantation intramyocardique. Avant la transplantation intramyocardique hiPSC-MSCs, répétez les étapes d’anesthésie et de préparation animale mentionnées à la section 1.1, cette fois en stérilisant 10 cm autour de la zone de battement d’apex. Effectuer la thoracotomie gauche à l’espace intercostal 4-5 avec un rétractateur. Effectuer la péricardotomie pour exposer la paroi latérale infarctus.
      REMARQUE : La longueur de l’incision était de 10 à 12 cm.
   3. Utilisez 5 à 8 injections intramyocardiques (~0,3 mL par injection) autour de la zone infarctus pour administrer le milieu de culture (Table des matériaux) à un groupe d’animaux ou 2 x 108 hiPSC-MSC à l’autre groupe (Figure 3). Évitez soigneusement tout dommage aux artères coronaires pour réduire le risque d’hémorragie.
   4. Fermez l’espace intercostal avec du fil de fer et fermez la couche musculaire avec de la soie 2-0. Coudre le tissu sous-cutané et la peau avec 2-0 vicryl.
7. Stimulation électrique programmée intracardiaque
   1. Effectuer la stimulation électrique programmée à l’aide d’un stimulateur programmable pour évaluer l’inducibilité de la tachyarrhythmie ventriculaire (VT) après la thérapie de transplantation cellulaire.
   2. Insérez un cathéter électrophysiologique 6F dans l’apex ventriculaire droit via la veine fémorale avant de sacrifier tous les animaux.
   3. Affichez les enregistrements intracardiaques avec l’électrocardiogramme de surface conduit I, II et III sur le système d’enregistrement électrophysiologique à une vitesse de 200 mm/s. Délivrez une largeur d’impulsion de 2 ms à 2 fois le seuil diastolique à l’aide d’un stimulateur.
   4. Livrer un train de huit stimuli (S1) à deux longueurs de cycle d’entraînement (200 ms et 300 ms), suivi d’un (S2) ou deux (S2 et S3) stimuli supplémentaires prématurés.
   5. Raccourcissez séquentiellement les intervalles de couplage jusqu’à ce qu’une période réfractaire ou arythmie efficace ventriculaire soit induite. Notez la présence de VT durable inductible (>10 s).

2. Protocole postopératoire

1. Médecine postopératoire
   1. Effectuer des thérapies pharmacologiques conventionnelles pour HF. En bref, administrer oralement le succinate de métoprolol (25 mg) et le ramipril (2,5 mg) à tous les animaux par jour.
   2. Administrer l’enrofloxacine (5 mg/kg) et la buprénorphine (0,01 mg/kg) à tous les animaux par jour pendant une semaine après la chirurgie afin de prévenir l’infection et de soulager la douleur.
   3. Pour minimiser le rejet immunologique, administrer oralement un stéroïde (40 mg/jour par voie orale) et de la cyclosporine (200 mg/jour par voie orale) à tous les animaux de 3 jours avant la transplantation cellulaire à 8 semaines après.
2. Évaluation de la taille des infarctus
   1. Euthanasier les animaux par une surdose de dorminal (pentobarbital sodium, 100 mg/kg, IV) à la fin de l’expérience.
   2. Ouvrez la poitrine et rassemblez le cœur. Rincer le cœur en solution saline à 0,9%.
   3. Échantillons de tissu LV de section en série avec un scalpel à 1 cm d’épaisseur dans la direction transversale de LV.
   4. Sélectionnez des parties des tranches qui contiennent le myocarde infencté pour mesurer l’épaisseur du mur et la zone infarctus.
   5. Capturez l’image de ces tranches et analysez quantitativement l’épaisseur du mur et la zone infarctus à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images commerciale.
   6. Fixer le tissu dans 10% de formaline à 4 °C pendant un mois. Incorporer le tissu à l’intérieur, à côté et à distance des sites infarctus (~1 cm² morceaux) dans la paraffine. Section en tranches de 5 μm à l’aide d’un microtome pour l’examen histologique.
3. Survie cellulaire
   1. Détecter l’engraftment des cellules transplantées par coloration immunohistochimique avec l’antigène nucléaire anti-humain (HNA) selon le protocole fourni par le fabricant.
   2. Capturez l’image en trois sections différentes à cinq champs aléatoires dans chaque animal et analysez quantitativement les cellules positives dans la zone péri-infarctus.
      REMARQUE : Le système de capture d’images et le logiciel d’analyse d’images ont été utilisés pour capturer et analyser les images des sections cardiaques.

Résultats

Mortalité
Au total, 24 porcs ont été utilisés dans cette étude. Trois d’entre eux sont morts pendant l’induction de MI en raison du VT soutenu. Un animal est mort dans la chirurgie à cœur ouvert pour l’injection cellulaire en raison du saignement de blessure. Deux animaux sont morts à cause d’une infection grave. Deux animaux ont été exclus en raison d’une légère réduction de l’EF (réduction du LVEF > 40 % de la base de référence). En consé...

Discussion

Les modèles animaux standards sont d’une importance capitale pour comprendre la pathophysiologie et les mécanismes des maladies et tester de nouvelles thérapies. Notre protocole établit un modèle porcin de HF induit par le blocage d’artère circonflexe gauche et le rythme rapide. Huit semaines après l’induction de l’IM, les animaux ont développé une déficience significative de LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/dt, et ESPVR. Ce protocole teste également la méthode d’administration de la thérapie de cellules so...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam