Establecer un modelo porcino de infarto de infarto post-miocardio insuficiencia cardíaca para el tratamiento de células madre

Resumen

Buscamos establecer un modelo porcino de insuficiencia cardíaca inducida por la obstrucción de la arteria circunfleja izquierda y un ritmo rápido para probar el efecto y la seguridad de la administración intramiocardial de células madre para terapias basadas en células.

Resumen

Aunque se han logrado avances en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (HF) después del infarto de miocardio (MI), la IC después de la MI sigue siendo una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Las terapias basadas en células para la reparación cardíaca y la mejora de la función ventricular izquierda después de la MI han atraído una atención considerable. En consecuencia, la seguridad y eficacia de estos trasplantes de células debe probarse en un modelo animal grande preclínico de IC antes del uso clínico. Los cerdos son ampliamente utilizados para la investigación de enfermedades cardiovasculares debido a su similitud con los seres humanos en términos de tamaño del corazón y anatomía coronaria. Por lo tanto, buscamos presentar un protocolo eficaz para el establecimiento de un modelo de IC crónica porcina utilizando la oclusión del balón coronario de pecho cerrado de la arteria circunfleja izquierda (LCX), seguido de un ritmo ventricular rápido inducido con la implantación del marcapasos. Ocho semanas más tarde, las células madre fueron administradas por inyección intramiocardio en el área de peri-infarto. A continuación, se evaluó el tamaño del infarto, la supervivencia celular y la función ventricular izquierda (incluyendo ecocardiografía, parámetros hemodinámicos y electrofisiología). Este estudio ayuda a establecer un modelo estable de HF animal grande preclínico para el tratamiento de células madre.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares, la enfermedad de las arterias coronarias (CAD) en particular, siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en Hong Kong y en todo el mundo¹. En Hong Kong, se proyectó un aumento del 26% entre 2012 y 2017 del número de pacientes con CAD tratados en el marco de la Autoridad Hospitalaria². Entre todos los CAT, el infarto agudo de miocardio (MI) es una de las principales causas de muerte y complicaciones posteriores, como la insuficiencia cardíaca (HF). Estos contribuyen a cargas médicas, sociales y financieras significativas. En pacientes con MI, la terapia trombolítica o la intervención coronaria percutánea primaria (PCI) es una terapia eficaz para preservar la vida, pero estas terapias solo pueden reducir la pérdida de cardiomiocitos (CM) durante la E. Los tratamientos disponibles son incapaces de reponer la pérdida permanente de CM, lo que conduce a fibrosis cardíaca, remodelación miocárdica, arritmia cardíaca y, finalmente, insuficiencia cardíaca. La tasa de mortalidad a 1 año después de mima es de alrededor del 7% con más del 20% de los pacientes que desarrollan IC³. En pacientes con IC en etapa terminal, el trasplante de corazón es la única terapia efectiva disponible, pero está limitada por la escasez de órganos disponibles. Las terapias novedosas son necesarias para revertir el desarrollo de la IC post-MI. Como resultado, la terapia basada en células se considera un enfoque atractivo para reparar los CM deteriorados y mejorar la función ventricular izquierda (LV) en la IC después de la MI. Nuestros estudios previos encontraron que el trasplante de células madre es beneficioso para la mejora de la función cardíaca después del trasplante intramiocardio directo en modelos animales pequeños de MI^4,,5. Por lo tanto, se necesitan protocolos estandarizados preclínicos de LCA para animales grandes para probar aún más la eficacia y seguridad del trasplante de células madre antes del uso clínico.

En las últimas décadas se ha visto el uso generalizado de cerdos en la investigación cardiovascular para la terapia con células madre. Los cerdos HF son un modelo prometedor de investigación traslacional debido a su similitud con los seres humanos en términos de tamaño cardíaco, peso, ritmo, función y anatomía de la arteria coronaria. Además, los modelos de IC porcino pueden imitar a los pacientes con IC post-MI en términos de metabolismo de CM, propiedades electrofisiológicas y cambios neuroendocrinos en condiciones isquémicas^6. El protocolo presentado aquí utiliza un modelo de HF de cerdo estandarizado, empleando una oclusión de globo coronario de pecho cerrado de la arteria circunflex izquierda (LCX) seguida de un ritmo rápido inducido por la implantación del marcapasos. El estudio también optimiza la vía de administración intramiocardial de células madre para el tratamiento de la IC post-MI. El propósito es producir un modelo animal porcino de infarto crónico de miocardio que se puede utilizar para desarrollar tratamientos que sean clínicamente relevantes para pacientes con CAD grave.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y los reglamentos de la Universidad de Hong Kong, y el protocolo fue aprobado por el Comité para el Uso de Animales Vivos en La Enseñanza y la Investigación (CULTAR) en la Universidad de Hong Kong.

NOTA: Para este estudio se utilizaron cerdos de granja hembra de 35-40 kg (9-12 meses de edad). El diagrama de flujo de este experimento se muestra en la Figura 1.

1. Procedimientos quirúrgicos

1. Anestesia y preparación del animal
   1. Ayunar los animales durante 12 h y sujetos a la privación de agua durante 4 horas antes del experimento.
   2. Anestesiar a los cerdos a través de una inyección intramuscular de teja+zolezepam (2-7 mg/kg) y xilazina (0,5-1 mg/kg) preparada en 20 ml de solución salina normal. Monitoree los reflejos palpebrales del animal hasta que estén ausentes.
   3. Retire el pelo del cerdo y esterilizar la piel en el cuello y la ingle para las secciones 1.3-1.5. Desinfectar el área de operación 3x con 70% de etanol y betadina.
   4. Coloque un tubo endotraqueal de 7 mm en la tráquea porcina y coloque una aguja venosa de 22 G en la vena del oído.
   5. Mueva el cerdo a la mesa de operaciones y colóquelo en una posición supina. Conecte el tubo endotraqueal al respirador y ventile mecánicamente (relación de tiempo inspiratorio/espiratorio 1:2) al animal con isoflurano (1,5%-2,0% inhalación) y oxígeno (0,5-1,5 L/min inhalación).
   6. Supervise el electrocardiograma superficial y la presión arterial, y controle continuamente la frecuencia cardíaca, el ritmo cardíaco y la presión arterial a través de sistemas de registro electrofisiología.
2. Ecocardiografía
   1. Mueva el cerdo a la posición del decúbito lateral izquierdo y fije en la mesa.
   2. Coloque la sonda en la región pericárdica y realice ecocardiografía en serie, incluyendo imágenes en modo 2D y M, utilizando un sistema ecocardiográfico de alta resolución y un transductor de 3-9 MHz al inicio, antes del trasplante celular y 8 semanas después del trasplante celular (Figura complementaria 1).
   3. Analizar todas las imágenes obtenidas utilizando software comercial. Calcule la dimensión diastólica final (LVEDD), la dimensión sistólica final de LV (LVESD), el volumen diastólico final de LV (LVEDV), el volumen sistólico final lv (LVESV), la fracción de eyección del LV (LVEF) y el espesor de la pared después de obtener imágenes ecocardiográficas estándar de la vista de eje largo parasternal.
      NOTA: Todos los análisis fuera de línea fueron realizados por otro operador independiente utilizando una estación de trabajo informática. La variabilidad de las mediciones entre diferentes observadores fue del 4% sobre la base de 20 imágenes aleatorias repetidas. Todas las mediciones ecocardiográficas se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Sociedad Americana de Ecocardiografía.
3. Implantación del marcapasos
   1. Mueva el cerdo a la posición supina y fije las extremidades del cerdo en la mesa con correas.
   2. Localice la arteria carótida derecha y la vena yugular en el triángulo carótido (detrás del esternocleidomastoideo y rodeado por el estehioides, el músculo diestrico y el omohyoid) y aísle la arteria carótida derecha y la vena yugular con fórceps hemostáticos en condiciones estériles (Figura suplementaria 2). Ligar el extremo distal de la arteria carótida derecha y la vena yugular. Coser los dos músculos con 2-0 Vicryl.
   3. Canular la vena yugular derecha con una angiocath e insertar un marcapasos que conduce al ventrículo derecho bajo la guía de rayos X (Figura 2).
   4. Aísle el esternocleidomastoideo y el músculo de la escala anterior utilizando fórceps. Implantar un marcapasos entre los dos músculos y coser los dos músculos con 2-0 de seda. Conecte el marcapasos al plomo.
   5. Reprogramar el marcapasos para hacer una copia de seguridad del modo VVI (35 bpm) mediante un generador de marcapasos después del trasplante.
   6. Aplicar un ritmo ventricular rápido (150 latidos/min) para inducir la IC por un generador de marcapasos 4 semanas después de la inducción de MI. A continuación, vuelva a colocar el marcapasos en modo VVI de copia de seguridad a las 8 semanas.
4. Análisis de bucle de volumen de presión invasivo
   NOTA: Realice una evaluación hemodinámica invasiva al inicio, antes del trasplante celular y 8 semanas después del trasplante celular para evaluar los cambios en la función del VL.
   1. Aislar la arteria femoral derecha y la vena femoral en el triángulo femoral (rodeado por el ligamento inguinal, el músculo sartorius y el músculo aductor longus) (Figura suplementaria 2).
   2. Cannula la arteria femoral derecha con una angiocath y coloca un cable guía en la arteria a través de la angiocath. Retire la angiocato y cúmule una vaina 9F en la arteria bajo la guía del alambre guía. Retire el cable guía.
   3. Cannular la vena femoral derecha con una vaina 12F como se describe en el paso 1.4.2. Inserte un catéter de globo de la vaina 12F colocada en la vena cava inferior (IVC) bajo guía de rayos X.
   4. Calibre un catéter de volumen de presión (PV) de 7 fr en solución salina isotónica con un procesador de señal fotovoltaica.
   5. Inserte el catéter fotovoltaico en el ápice del LV desde la vaina 9F colocada bajo la guía de rayos X. Suspenda la ventilación y mida el derivado de presión positiva máxima ventricular izquierda (+dP/dt), la presión sistólica final (ESP) y las presiones diastólicas finales (EDP) con el procesador de señal fotovoltaica.
   6. Mida la relación presión-volumen sistólica final (ESPVR) por el procesador de señal fotovoltaica durante la oclusión del CIV.
   7. Reinicie la ventilación cuando finalice el procedimiento.
5. Inducción de MI
   1. Administrar por vía intravenosa amiodarona (5 mg/kg por vía intravenosa durante 1 h) y lidocaína (1,5 mg/kg de bolo intravenoso) al animal antes de la inducción de MI para prevenir arritmias ventriculares.
   2. Cannula la arteria carótida derecha con una vaina 8F como se menciona en el paso 1.4.3.
   3. Realice la angiografía coronaria a través de un catéter guía 6F JR4 sobre el alambre a través de la vaina colocada guiada por el equipo de fluoroscopia estándar del brazo C.
   4. Ocluir la arteria coronaria circunfleja izquierda (LCX) distal a la primera rama marginal obtusa con angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) dilatación inflación del catéter del globo de dilatación bajo la guía de rayos X (Figura 2).
   5. Inyectar 1 ml de microesferas de esponja de 700 m mezcladas con 3 ml de solución salina preparadas en una jeringa de 10 ml a través del catéter de globo para bloquear el LCX, luego desinflar el globo y realizar una angiografía para confirmar la oclusión.
   6. Repita el procedimiento de inyección para lograr un bloqueo completo y exitoso.
   7. Controla la frecuencia cardíaca y el ritmo cardíacos de los animales para detectar arritmias cardíacas. Si ocurrió una fibrilación ventricular, utilice un desfibrilador bifásico externo para restablecer un ritmo sinusal usando 150-300 choques J.
6. Inyección de células madre
   1. Asigne aleatoriamente todos los animales con notable deterioro de la función cardíaca (LVEF < 40% a las 8 semanas después de la inducción de MI) a dos grupos diferentes: uno que recibirá administración intramiocardio de 2 x 10⁸ células madre mesenquimales derivadas de células madre inducidas por humanos (hiPSC-MSC), y el otro que no recibirá hiPSC-MSC.
   2. Preparar los hiPSC-MSC en 2 ml de solución salina normal para trasplante intramiocardio. Antes del trasplante intramiocardio hiPSC-MSCs, repita los pasos de anestesia y preparación animal mencionados en la sección 1.1, esta vez esterilizando 10 cm alrededor de la zona del latido del ápice. Realizar la toracotomía izquierda en el espacio intercostal 4-5 con un retractor. Realice la pericardiotomía para exponer la pared lateral infarto.
      NOTA: La longitud de la incisión fue de 10-12 cm.
   3. Utilice 5-8 inyecciones intramiocardio (0,3 ml por inyección) alrededor de la zona infarto para administrar el medio de cultivo(Tabla de materiales) a un grupo de animales o 2 x 108 hiPSC-MSC al otro grupo ( Figura3). Evite cuidadosamente cualquier daño a las arterias coronarias para reducir el riesgo de hemorragia.
   4. Cierra el espacio intercostal con alambre de hierro y cierra la capa muscular con seda 2-0. Coser el tejido subcutáneo y la piel con 2-0 vicril.
7. Estimulación eléctrica programada intracardiaca
   1. Realizar estimulación eléctrica programada utilizando un estimulador programable para evaluar la inducibilidad de la taquiarritmia ventricular (V) después de la terapia de trasplante celular.
   2. Inserte un catéter electrofisiológico 6F en el ápice ventricular derecho a través de la vena femoral antes de sacrificar todos los animales.
   3. Visualice las grabaciones intracardiacas con los cables de electrocardiograma de superficie I, II y III en el sistema de grabación electrofisiológica a una velocidad de 200 mm/s. Proporcione un ancho de pulso de 2 ms a 2 veces el umbral diastólico usando un estimulador.
   4. Entregar un tren de ritmo de ocho estímulos (S1) en dos longitudes de ciclo de accionamiento (200 ms y 300 ms), seguido de uno (S2) o dos (S2 y S3) estímulos adicionales prematuros.
   5. Acortar secuencialmente los intervalos de acoplamiento hasta que se induzca un período refractario o arritmia eficaz ventricular. Tenga en cuenta la presencia de VT sostenido inducible (>10 s).

2. Protocolo postoperatorio

1. Medicina postoperatoria
   1. Realizar terapias farmacológicas convencionales para la IC. En resumen, administrar por vía oral metoprolol succinato (25 mg) y ramipril (2,5 mg) a todos los animales diariamente.
   2. Administrar intramuscularmente enrofloxacino (5 mg/kg) y buprenorfina (0,01 mg/kg) a todos los animales diariamente durante 1 semana después de la cirugía para prevenir la infección y aliviar el dolor.
   3. Para minimizar el rechazo inmunológico, administrar por vía oral un esteroide (40 mg/día por vía oral) y ciclosporina (200 mg/día por vía oral) a todos los animales desde 3 días antes del trasplante celular hasta 8 semanas después.
2. Evaluación del tamaño del infarto
   1. Eutanasiar a los animales mediante una sobredosis de dorminal (pentobarbital sódico, 100 mg/kg, IV) al final del experimento.
   2. Abre el pecho y recoge el corazón. Enjuague el corazón en un 0,9% de solución salina.
   3. Muestras de tejido LV de sección en serie con un bisturí a 1 cm de espesor en la dirección transversal del VI.
   4. Seleccione partes de las rebanadas que contienen el miocardio infarto para medir el espesor de la pared y el área de infarto.
   5. Capture la imagen de estas rebanadas y analice cuantitativamente el grosor de la pared y el área de infarto utilizando un software de análisis de imágenes comerciales.
   6. Fijar el tejido en 10% de formalina a 4 oC durante un mes. Incrustar el tejido dentro, adyacente y remoto a los sitios de infarto (1 cm² piezas) en parafina. Secise en rodajas de 5 m utilizando un microtomo para el examen histológico.
3. Supervivencia celular
   1. Detectar el injerto de las células trasplantadas mediante tinción inmunohistoquímica con antígeno nuclear antihumano (HNA) según el protocolo proporcionado por el fabricante.
   2. Capture la imagen en tres secciones diferentes en cinco campos aleatorios en cada animal y analice cuantitativamente las células positivas en la zona peri-infarto.
      NOTA: El sistema de captura de imágenes y el software de análisis de imágenes se utilizaron para capturar y analizar las imágenes de las secciones del corazón.

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Resultados

Mortalidad
En este estudio se utilizaron un total de 24 cerdos. Tres de ellos murieron durante la inducción de MI debido a la VT sostenida. Un animal murió en la cirugía a corazón abierto para la inyección celular debido al sangrado de la herida. Dos animales murieron a causa de una infección grave. Dos animales fueron excluidos debido a una ligera reducción de EF (reducción de la FEVI > 40% de la línea de base). Como resultado, 16 animales completaron todo el...

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Discusión

Los modelos animales estándar son de suma importancia para entender la fisiopatología y los mecanismos de las enfermedades y probar nuevas terapias. Nuestro protocolo establece un modelo porcino de HF inducido por el bloqueo de la arteria circunfleja izquierda y el ritmo rápido. Ocho semanas después de la inducción de MI, los animales desarrollaron un deterioro significativo de la FEVI, LVEDD, LVESD, +dP/dt y ESPVR. Este protocolo también prueba el método de administración de la terapia con células madre para la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam