Istituzione di un modello suina di infarto post-miocardico per il trattamento delle cellule staminali

Riepilogo

Abbiamo cercato di stabilire un modello suine di insufficienza cardiaca indotta dal blocco dell'arteria circumflex sinistra e dal rapido ritmo per testare l'effetto e la sicurezza della somministrazione intramiocardiale delle cellule staminali per terapie basate sulle cellule.

Abstract

Anche se sono stati raggiunti progressi nel trattamento dell'insufficienza cardiaca (HF) dopo l'infarto miocardico (MI), HF dopo MI rimane una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Le terapie a base cellulare per la riparazione cardiaca e il miglioramento della funzione ventricolare sinistra dopo l'MI hanno attirato notevole attenzione. Di conseguenza, la sicurezza e l'efficacia di questi trapianti di cellule devono essere testate in un modello animale preclinico di grandi dimensioni di HF prima dell'uso clinico. I maiali sono ampiamente utilizzati per la ricerca sulle malattie cardiovascolari a causa della loro somiglianza con gli esseri umani in termini di dimensioni cardiache e anatomia coronarica. Pertanto, abbiamo cercato di presentare un protocollo efficace per la creazione di un modello HF cronico porcina utilizzando l'occlusione a palloncino coronarico a torso chiuso dell'arteria circumflex sinistra (LCX), seguita da un rapido ritmo ventricolare indotto dall'impianto del pacemaker. Otto settimane dopo, le cellule staminali sono state somministrate mediante iniezione intramiocardia nell'area peri-infarta. Poi sono state valutate le dimensioni dell'infarto, la sopravvivenza cellulare e la funzione ventricolare sinistra (compresa l'ecocardiografia, i parametri emodinamici e l'elettrofisiologia). Questo studio aiuta a stabilire un modello stabile preclinico di grandi animali HF per il trattamento delle cellule staminali.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari, in particolare la malattia coronarica (CAD), rimangono la principale causa di morbilità e mortalità a Hong Kong e nel mondo¹. A Hong Kong, un aumento del 26% dal 2012 al 2017 del numero di pazienti CAD trattati sotto l'Autorità Ospedaliera è^{stato proiettato 2}. Tra tutti i CAD, l'infarto miocardico acuto (MI) è una delle principali cause di morte e complicazioni successive, come l'insufficienza cardiaca (HF). Questi contribuiscono a notevoli oneri medici, sociali e finanziari. Nei pazienti con MI, la terapia trombolitica o l'intervento coronarica percutaneo primario (PCI) è una terapia efficace per preservare la vita, ma queste terapie possono solo ridurre la perdita di cardiomiocito (CM) durante l'MI. I trattamenti disponibili non sono in grado di ricostituire la perdita permanente di CMs, che porta alla fibrosi cardiaca, al rimodellamento miocardico, all'aritmia cardiaca e infine all'insufficienza cardiaca. Il tasso di mortalità a 1 anno dopo l'MI è di circa il 7% con oltre il 20% di pazienti che sviluppano HF³. Nei pazienti con HF in fase finale, il trapianto di cuore è l'unica terapia efficace disponibile, ma è limitata dalla carenza di organi disponibili. Sono necessarie nuove terapie per invertire lo sviluppo di HF post-MI. Di conseguenza, la terapia cellulare è considerata un approccio interessante per riparare le C compromesse e migliorare la funzione ventricolare sinistra (LV) in HF dopo MI. I nostri studi precedenti hanno scoperto che il trapianto di cellule staminali è utile per il miglioramento della funzione cardiaca dopo il trapianto intramiocardiale diretto in piccoli modelli animali di MI^4,5. Sono quindi necessari protocolli HF di grandi animali preclinici standardizzati per testare ulteriormente l'efficacia e la sicurezza del trapianto di cellule staminali prima dell'uso clinico.

Negli ultimi decenni è stato assistito all'uso diffuso di suini nella ricerca cardiovascolare per la terapia con cellule staminali. I maiali HF sono un modello promettente di ricerca traslazione a causa della loro somiglianza con gli esseri umani in termini di dimensioni cardiache, peso, ritmo, funzione e anatomia coronarica. Inoltre, i modelli HF di porcina possono imitare i pazienti post-MI HF in termini di metabolismo CM, proprietà elettrofisiologiche e cambiamenti neuroendocrini in condizioni ischemiche⁶. Il protocollo qui presentato utilizza un modello HF suini standardizzato, che impiega un'occlusione a palloncino coronarica a torso chiuso dell'arteria circonflessa sinistra (LCX) seguita da un ritmo rapido indotto dall'impianto del pacemaker. Lo studio ottimizza anche il percorso della somministrazione intramiocardiale delle cellule staminali per il trattamento dell'HF post-MI. Lo scopo è quello di produrre un modello animale porcina di infarto miocardico cronico che può essere utilizzato per sviluppare trattamenti che sono clinicamente rilevanti per i pazienti con CAD grave.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dai National Institutes of Health e dai regolamenti dell'Università di Hong Kong, e il protocollo è stato approvato dal Comitato sull'uso degli animali vivi nell'insegnamento e nella ricerca (CULTAR) presso l'Università di Hong Kong.

NOTA: per questo studio sono stati utilizzati suini da allevamento di sesso femminile del peso di 35-40 kg (9-12 mesi). Il diagramma di flusso di questo esperimento è illustrato nella Figura 1.

1. Procedure chirurgiche

1. Anestesia e preparazione dell'animale
   1. Velocizza gli animali per 12 h e soggetti a privazione d'acqua per 4 h prima dell'esperimento.
   2. Anestesizzare i suini attraverso un'iniezione intramuscolare di tiletamine-zolezepam (2-7 mg/kg) e xylazina (0,5-1 mg/kg) preparati in 20 mL di salina normale. Monitorare i riflessi palpebri dell'animale fino a quando non sono assenti.
   3. Togliere i capelli del maiale e sterilizzare la pelle al collo e all'inguine per le sezioni 1.3-1.5. Disinfettare l'area di funzionamento 3x con 70% di etanolo e betadina.
   4. Inserire un tubo endotracheale da 7 mm nella trachea dei suri e inserire un ago di 22 G nell'orecchio vena.
   5. Spostare il maiale sul tavolo operatorio e posizionarlo in posizione supina. Collegare il tubo endotracheale al respiratore e ventilare meccanicamente (rapporto tempospiratorio/spiratorio 1:2) l'animale con isoflurane (1,5%-2,0% di inalazione) e ossigeno (0,5-1,5 L/min inalazione).
   6. Monitorare l'elettrocardiogramma superficiale e la pressione sanguigna e monitorare continuamente la frequenza cardiaca, il ritmo cardiaco e la pressione arteriosa attraverso sistemi di registrazione elettrofisiologia.
2. Ecocardiografia
   1. Spostare il maiale nella posizione del decubito laterale sinistro e fissare sul tavolo.
   2. Mettere la sonda sulla regione pericardica ed eseguire l'ecocardiografia seriale, compresa l'imaging in modalità 2D e M, utilizzando un sistema ecocardiografico ad alta risoluzione e un trasduttore da 3-9 MHz alla linea di base, prima del trapianto di cellule e 8 settimane dopo il trapianto di cellule (Figura supplementare 1).
   3. Analizzare tutte le immagini ottenute utilizzando un software commerciale. Calcolare la dimensione diastolica finale LV (LVEDD), la dimensione end-sintolica LV (LVESD), il volume diastolico finale LV (LVEDV), il volume distolico finale LV (LVESV), la frazione di espulsione LV (LVEF) e lo spessore della parete dopo che le immagini ecocardiografiche standard vengono ottenute dalla vista parasternale dell'asse lungo.
      NOTA: tutte le analisi off-line sono state condotte da un altro operatore indipendente utilizzando una workstation per computer. La variabilità delle misurazioni tra diversi osservatori era del 4% basata su 20 immagini casuali ripetute. Tutte le misurazioni ecocardiografiche sono state eseguite in conformità con le raccomandazioni dell'American Society of Echocardiography.
3. Impianto pacemaker
   1. Spostare il maiale in posizione supina e fissare gli arti del maiale sul tavolo con le cinghie.
   2. Individuare l'arteria carotide destra e la vena giugulare nel triangolo carotide (dietro lo sternocleidomastoide e circondato dallo stylohyoide, il muscolo digastrico e l'omoidoide) e isolare l'arteria carotide destra e la vena giugulare con forceppo emostatico in condizioni sterili (Figura supplementare 2). Ligate l'estremità distale dell'arteria carotide destra e vena giugulare. Cucire i due muscoli con 2-0 Vicryl.
   3. Cannulate la vena giugulare destra con un angiocath e inserire un pacemaker piombo al ventricolo destro sotto guida a raggi X (Figura 2).
   4. Isolare lo sternocleidomastoid e il muscolo scaleno anteriore utilizzando le forceccie. Impiantare un pacemaker tra i due muscoli e cucire i due muscoli con seta 2-0. Collegare il pacemaker al piombo.
   5. Riprogrammare il pacemaker per eseguire il backup della modalità VVI (35 bpm) da un generatore di pacemaker dopo il trapianto.
   6. Applicare una stimolazione ventricolare rapida (150 battiti/min) per indurre HF da un generatore di pacemaker 4 settimane dopo l'induzione mi. Quindi impostare il pacemaker di nuovo alla modalità VVI di backup a 8 settimane.
4. Analisi del ciclo del volume di pressione invasiva
   NOTA: Eseguire una valutazione emodinamica invasiva al basale, prima del trapianto di cellule e 8 settimane dopo il trapianto di cellule per valutare i cambiamenti nella funzione LV.
   1. Isolare l'arteria femorale destra e la vena femorale nel triangolo femorale (circondato dal legamento inguinale, dal muscolo sartorio e dal muscolo adduttore longus) (Figura supplementare2).
   2. Cannulate l'arteria femorale destra con un angiocath e inserire un filo guida nell'arteria attraverso l'angiocath. Rimuovere l'angiocata e puònulate una fasa 9F nell'arteria sotto la guida del filo guida. Rimuovere il filo guida.
   3. Cannulate la vena femorale destra con una mannaia 12F come descritto al punto 1.4.2. Inserire un catetere a palloncino dalla fosera 12F posizionata nella vena cava inferiore (IVC) sotto la guida a raggi X.
   4. Calibrare un catetere a volume di pressione (PV) da 7 Fr in salina isotonica con un processore di segnale fotovoltaico.
   5. Inserire il catetere fotovoltaico nell'apice LV dalla fosera 9F posizionata sotto la guida a raggi X. Sospendere la ventilazione e misurare la derivata a pressione massima positiva ventricolare sinistra (dP/dt), pressione end-sitolica (ESP) e pressioni end-diastolica (EDP) con il processore del segnale fotovoltaico.
   6. Misurare la relazione pressione-volume sistolica finale (ESPVR) da parte del processore del segnale PV durante l'occlusione dell'IVC.
   7. Riavviare la ventilazione al termine della procedura.
5. Induzione di MI
   1. Somministrare per via endovenosa amiodarone (5 mg/kg per via endovenosa sopra 1 h) e lidocaina (1,5 mg/kg di bolo endovenoso) all'animale prima dell'induzione di MI per prevenire aritmie ventricolari.
   2. Cannulate l'arteria carotide destra con una mannaia 8F come indicato al punto 1.4.3.
   3. Eseguire l'angiografia coronarica attraverso un catetere guida over-the-wire 6F JR4 tramite la foca posizionata guidata da apparecchiature standard di fluoroscopia del braccio C.
   4. Occlude l'arteria coronaria circonflessa sinistra (LCX) distale al primo ramo marginale ottuso con angioplastica coronarica transluminale percutanea (PTCA) dilatazione a palloncino inflazione sotto la guida a raggi X (Figura 2).
   5. Iniettare 1 mL di microsfere di spugna da 700 m mescolate con 3 mL di salina preparate in una siringa da 10 mL attraverso il catetere a palloncino per bloccare l'LCX, quindi sgonfiare il palloncino ed eseguire un angiogramma per confermare l'occlusione.
   6. Ripetere la procedura di iniezione per ottenere un blocco completo riuscito.
   7. Monitorare la frequenza cardiaca e il ritmo degli animali per rilevare le aritmie cardiache. Se si è verificato una fibrillazione ventricolare, utilizzare un defibrillatore bifasico esterno per ristabilire un ritmo del seno utilizzando shock 150-300 J.
6. Iniezione di cellule staminali
   1. Assegnare casualmente tutti gli animali con notevole compromissione della funzione cardiaca (LVEF < 40% a 8 settimane dopo l'induzione di MI) a due gruppi diversi: uno che riceverà la somministrazione intramiocardica di 2 x 10⁸ cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-MSC), e l'altro che non riceverà hiPSC-MSC.
   2. Preparare l'hiPSC-MSCs in 2 mL di salina normale per il trapianto intramiocardiale. Prima del trapianto di hiPSC-MSCs intramiocardiale, ripetere l'anestesia e i passaggi di preparazione degli animali menzionati nella sezione 1.1, questa volta sterilizzando 10 cm intorno all'area di battito dell'apice. Eseguire la toracotomia sinistra nello spazio intercostale 4-5 con un retrattore. Eseguire pericardiotomia per esporre la parete laterale infarto.
      NOTA: La lunghezza dell'incisione era di 10-12 cm.
   3. Utilizzare 5-8 iniezioni intramiocardali (0,3 mL per iniezione) intorno all'area infartata per somministrare il mezzo dicoltura( Tabella dei materiali ) a un gruppo di animali o 2 x 108 hiPSC-MSC all'altro gruppo(Figura 3). Evitare con attenzione qualsiasi danno alle arterie coronarie per ridurre il rischio di emorragia.
   4. Chiudere lo spazio intercostale con filo di ferro e chiudere lo strato muscolare con seta 2-0. Cucire il tessuto sottocutaneo e la pelle con 2-0 vicryl.
7. Stimolazione elettrica programmata Intracardiac
   1. Eseguire la stimolazione elettrica programmata utilizzando uno stimolatore programmabile per valutare l'indubilità della tachyarrhythmia ventricolare (VT) dopo la terapia di trapianto cellulare.
   2. Inserire un catetere elettrofisiologico 6F nell'apice ventricolare destro attraverso la vena femorale prima di sacrificare tutti gli animali.
   3. Visualizzare le registrazioni intratracardiac con l'elettrocardiogramma superficiale I, II e III sul sistema di registrazione elettrofisiologica ad una velocità di 200 mm/s. Fornire una larghezza di impulso di 2 ms a 2x la soglia diastolica utilizzando uno stimolatore.
   4. Consegnare un treno di stimolazione di otto stimoli (S1) a due lunghezze del ciclo di azionamento (200 ms e 300 ms), seguito da uno (S2) o due (S2 e S3) stimoli extra prematuri.
   5. Abbreviare in sequenza gli intervalli di accoppiamento fino a quando non viene indotto un periodo refrattario efficace ventricolare o aritmia. Si noti la presenza di VT sostenuto inducibile (>10 s).

2. Protocollo postoperatorio

1. Medicina postoperatoria
   1. Eseguire terapie farmacologiche convenzionali per HF. In breve, somministrare per via orale metoprololo succinato (25 mg) e ramiprile (2.5 mg) a tutti gli animali al giorno.
   2. Somministrare intramuscolare enrofloxacina (5 mg/kg) e buprenorfina (0,01 mg/kg) a tutti gli animali al giorno per 1 settimana dopo l'intervento chirurgico per prevenire l'infezione e alleviare il dolore.
   3. Per ridurre al minimo il rigetto immunologico, somministrare per via orale uno steroide (40 mg/giorno per via orale) e la ciclosporina (200 mg/giorno per via orale) a tutti gli animali da 3 giorni prima del trapianto di cellule a 8 settimane dopo.
2. Valutazione delle dimensioni infarto
   1. Eutanasia gli animali da un sovradosaggio di dorminale (sodio pentobarbitale, 100 mg/kg, IV) alla fine dell'esperimento.
   2. Apri il petto e raccogli il cuore. Sciacquare il cuore in 0,9% salina.
   3. Sezione seriale campioni di tessuto LV con un bisturi a spessori di 1 cm nella direzione trasversale LV.
   4. Selezionare parti delle fette che contengono il miocardio infarto per misurare lo spessore della parete e l'area infarta.
   5. Catturare l'immagine di queste sezioni e analizzare quantitativamente lo spessore della parete e l'area infarta utilizzando un software di analisi delle immagini commerciali.
   6. Fissare il tessuto in formalina 10% a 4 gradi centigradi per un mese. Incorporare il tessuto all'interno, adiacente e remoto nei siti infarti (pezzi di 1 cm²⁾ in paraffina. Sezione in 5 fette di zm utilizzando un microtomo per l'esame istologico.
3. Sopravvivenza cellulare
   1. Rilevare l'innesto delle cellule trapiantate mediante colorazione immunohistochimica con antigene nucleare anti-umano (HNA) secondo il protocollo fornito dal produttore.
   2. Catturare l'immagine in tre diverse sezioni in cinque campi casuali in ogni animale e analizzare quantitativamente le cellule positive nella zona peri-infarta.
      NOTA: il sistema di acquisizione immagini e il software di analisi delle immagini sono stati utilizzati per acquisire e analizzare le immagini delle sezioni cardiache.

Risultati

Mortalità
In questo studio sono stati utilizzati 24 suini. Tre di loro sono morti durante l'induzione mi a causa di VT sostenuta. Un animale è morto nell'intervento a cuore aperto per iniezione cellulare a causa di sanguinamento della ferita. Due animali sono morti a causa di una grave infezione. Due animali sono stati esclusi a causa di una leggera riduzione del MEF (riduzione LVEF > 40% del basale). Di conseguenza, 16 animali hanno completato l'intero protocollo di...

Discussione

I modelli animali standard sono di fondamentale importanza per comprendere la fisiofisiologia e i meccanismi delle malattie e testare nuove terapie. Il nostro protocollo stabilisce un modello porcino di HF indotto dal blocco dell'arteria circumflex sinistra e dal rapido ritmo. Otto settimane dopo l'induzione di MI, gli animali hanno sviluppato una compromissione significativa di LVEF, LVEDD, LVESD, .dP/dt ed ESPVR. Questo protocollo testa anche il metodo di somministrazione della terapia con cellule staminali per la rige...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone	Mylan	-	-
Anaesthetic machines and respirator	Drager	Fabius plus XL	-
Angiocath	Becton Dickinson	381147	-
Anti-human nuclear antigen	abcam	ab19118	-
Axio Plus image capturing system	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 software	Zeiss	-	-
Baytril	Bayer	-	enrofloxacin
Betadine	Mundipharma	-	-
CardioLab Electrophysiology Recording Systems	GE Healthcare	G220f	-
Culture media	MesenCult	05420	-
Cyclosporine	Novartis	-	-
Defibrillator	GE Healthcare	CardioServ	-
Dorminal	TEVA	-	-
Echocardiographic system	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac software	GE Vingmed	-	-
Electrophysiological catheter	Cordis Corp	-	-
Embozene Microsphere	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
Endotracheal tube	Vet Care	VCPET70PCW	Size 7
Ethanol	VWR chemicals	20821.33	-
Formalin	Sigma	HT501320	10%
IVC balloon Dilatation Catheter	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 guiding catheter	Cordis Corp	67208200	6F
Lidocaine	Quala	-	-
Mersilk	Ethicon	W584	2-0
Metoprolol succinate	Wockhardt	-	-
Microtome	Leica	RM2125RT	-
Mobile C arm fluoroscopy equipment	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
Pacemaker	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI pacemaker
Pacemaker generator	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
Pressure-volume catheter	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
Pressure–volume signal processor	CD Leycom	SIGMA-M	-
Programmable Stimulator	Medtronic Inc	5328	-
PTCA Dilatation balloon Catheter	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
Ramipril	TEVA	-	-
Sheath introducer	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
Steroid	Versus Arthritis	-	-
Temgesic	Nindivior	-	buprenorphine
Venous indwelling needle	TERUMO	SR+OX2225C	22G
Vicryl	Ethicon	VCP320H	2-0
Xylazine	Alfasan International B.V.	-	-
Zoletil	Virbac New Zealand Limited	-	tiletamine+zolezepam