使用亲脂荧光染料的果蝇胚胎运动神经元的逆行追踪

摘要

我们描述了一种使用亲脂荧光染料逆行追踪果蝇胚胎运动神经元的方法。

摘要

我们描述了一种在果蝇中逆行标记运动神经元的技术。我们使用一种油溶解的亲脂染料，并通过显微注射器将一小滴滴输送到胚胎圆角制剂中。其膜被滴接触的每个运动神经元可以迅速标记。单个运动神经元被连续标记，使精细的结构细节清晰地可视化。鉴于亲脂染料有多种颜色，该技术还提供了一种获取相邻神经元以多色标记的方法。因此，这种追踪技术对于研究果蝇运动神经元系统的神经元形态发生和突触连接非常有用。

引言

果蝇的胚胎运动神经元系统提供了一个强大的实验模型来分析中枢神经系统（CNS）1、2、3的发展机制。运动神经元系统适用于生化、遗传、成像和电生理技术。利用这些技术，基因操作和功能分析可以在单运动神经元^{2，4，5，6}的水平进行。

在神经系统的早期发育过程中，神经细胞分裂并产生大量的胶质和神经元。神经细胞的分层和基因表达特征之间的时空关系，以前曾详细研究过^7、8、9。在运动神经元系统的情况下，胚胎神经肌肉结（NMJ）的形成已经被广泛研究使用aCC（前角细胞），RP2（生虾2），和RP5运动神经元^2，10。例如，当RP5运动神经元形成新生的突触结时，突触前和突触后filopodia被混合11，12，13。这种直接的蜂窝通信对于启动NMJ的形成至关重要。与我们所知道的周围神经分支相反，我们对运动树突如何在CNS内启动突触连接的知识仍然是原始的。

在这份报告中，我们提出了一种技术，允许通过微移液介导的亲脂染料的传递，在胚胎中逆行标记运动神经元。这项技术使我们能够在产卵（AEL）14后15小时，追踪38个运动神经元在15小时内，在30个身体壁肌肉中各进行内蚀。通过利用这一技术，我们小组彻底调查了许多功能增益/功能损失等位基因15，16，17。我们最近解开了驱动运动树突连接启动的分子机制，并证明Dscam1-Dock-Pak相互作用定义了aCC运动神经元¹⁷中树突生长的部位。一般来说，这种技术适用于野生类型或突变菌株中任何胚胎运动神经元的型态分析，增强了我们对果蝇神经系统功能设计提供新见解的能力。

研究方案

1. 设备和用品

1. 收集胚胎和培训成人产卵的材料
   1. 通过切断 50 mL 管并切开盖上的孔来设置带 100 μm（材料表）的网状过滤器，从而在管和盖之间设置滤芯，从而准备过滤设备。
      注:或者，具有100μm孔（材料表）的细胞过滤器可用于胚胎收集的过滤步骤。
   2. 根据列出的说明，用葡萄琼脂预混料（材料表）制作琼脂板。简单，轻轻搅拌1包粉末混合成500 mL的室温（RT，23°C）dH₂O和微波溶解的混合物剧烈沸腾。冷却至 70~75 °C 后，将混合物倒入培养皿（60 mm）。琼脂凝固后，将板储存在4°C。
   3. 通过将活性干酵母（材料表）和水混合至糊状稠度，制备酵母糊，并保持在4°C。
   4. 使用蛋收集笼（对于60毫米培养皿，材料表），提供充足的气流。
2. 解剖针和染料注射微移液器的制备
   1. 从内径为0.6毫米、外径为1.2毫米（材料表）的同一毛细管中制备染料注射微管和解剖针。由微移管拉拔器以 7% 从 170 V 最大输出（材料表）处拉出毛细管，以形成长度为 ±0.4 厘米的尖针。
   2. 对于染料注射，使用微移液器（材料表）调整微移液器（材料表），采用仪器手册中描述的气泡转皮技术。
      1. 简而言之，用润湿剂（材料表）浸泡研磨机，以防止水"拖"针尖。将针头放在微移液夹上，温度为 25[30°]，并将针尖从倾斜表面中心向外倾斜到半径的三分之二。用管子注射器将空气推入针头时研磨针头，以确保微移液器没有玻璃剃须。
      2. 用细尖永久标记标记微移液器，以指示倾斜后开口在尖端的位置，因为要找到以一定角度形成的微移液器的窄开口是具有挑战性的。

2. 胚胎采集的准备

1. 确保成年苍蝇（20-40只野生型广州-S或白蝇），雄性与雌性，保持在年轻（<7天）和健康条件的理想卵子收集。
   注:为了刺激产卵，苍蝇在收集卵子前几天在卵子收集笼中训练，每天至少一次用酵母糊状的琼脂片收集卵子。

3. 胚胎分期

1. 让苍蝇在RT处产卵过夜（或至少15小时），在15小时AEL（即第¹⁶¹⁸阶段）收集胚胎，以观察aCC和RP3运动神经元的产卵。早上，用鸡蛋收集盘子。
   注:在15 h AEL的胚胎将有一个独特的4室肠道^18。对于成像的不同阶段遵循其特定的形态标准和老化条件。
2. 为了收集胚胎，用50%漂白剂将产在盘子上的卵子冷冻5分钟。
3. 清除切口后，通过过滤装置或细胞过滤器将板中的内容物倒入以分离胚胎。使用挤压瓶水，稀释留在盘子上的漂白剂，并通过将混合物倒入过滤器来收集尽可能多的胚胎。
4. 用更多的水清洗过滤器上的胚胎3⁄4倍，或直到漂白气味散去。从设备中取出过滤器，用清水将胚胎洗到另一块干净的盘子上。从胚胎上的新板上分水。
5. 将玻璃幻灯片覆盖在中间的两层乙烯基胶带上，形成一个矩形。使用剃刀刀片将矩形池从磁带上切出。在池的上端放置一条薄薄的双面胶带，这是胚胎放置的地方，如图1所示。
6. 使用精细的钳子，在 15 h AEL 下单独选择 5×10 个胚胎，并将其放在双面胶带上，背侧朝上。将昆虫林格的盐水¹⁹添加到解剖池中，以保护胚胎免受干燥（图1）。

4. 解剖和染色

1. 使用解剖显微镜下的玻璃针（材料表），从后部到前端穿过单个胚胎表面的中线。然后，将胚胎从胶带上从玻璃膜中拖出（如图1所示）。小心不要损坏胚胎的内部组织。
2. 从中心翻转上皮组织，并将表皮边缘附着在玻璃滑动的表面（图1，内接）。
3. 使用开口为 ±300 μm 的管连接针（通过打破解剖针的薄尖端进行准备），吸气或吹气以分离和取出背端纵向气管树干以及任何残留的肠道。
4. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用4%的甲醛（PFA），在RT处将胚胎固定5分钟。用PBS清洗胚胎3次。
5. 用1μL的抗马萝卜过氧化物酶抗体在PBS的200μL中与青宁3染料（抗HRP Cy3）（材料表）染色1μL，用PBS3x在染色后清洗胚胎。
   注:抗HRP染料可根据注射的首选亲脂染料进行更换。

5. 注塑微移液器的填充

1. 加热亲脂染料（5mg/mL的DiO或DiD，材料表）至60°C在1:10乙醇混合物:植物油使用前。
2. 为注射微移液器准备油溶解染料滑块。将微移液器放入毛细管支架（图2，#1）。使用微操作器（材料表），将微移液器调整到染料滑轨上。然后，调整舞台，将微移液器放在染料上（图2，#2）。
3. 要填充微液器，请使用显微注射器（材料表）（图2，#3）。通过将 P_i（注射压力）设置为 200~500 hPa（hectopascal）之间的 P i（注射压力），将 0.1±0.5 s 和 P_c（补偿压力）设置为 0 hPa 之间的 T_i（注射时间）至 0 hPa 5 分钟（图 2，#4）。在微移液器中收集染料。
4. 收集染料后，取出染料滑块并将样品放在显微镜台上。接下来，将P_c增加到20~60 hPa的范围，然后再将微移液器放入样品中，以防止毛细管作用污染PBS。

6. 染料注射到神经元

1. 使用显微镜使用10x物镜（材料表）定位中心中的胚胎，并将微移液器与胚胎对齐。
   注:通过改变P_i或微移液头开口的大小，可以调整染料液滴的大小。水滴应为10~20 μm，约为1块肌肉的宽度。
2. 将物镜更改为浸入式 40x 透镜（材料表），并将镜头浸入 PBS 中，以观察胚胎。
   1. 使用荧光显微镜检查以抗HRP Cy3标记的神经元形态并确定注射部位。
   2. 在注射过程中，使用明场显微镜观察染料液滴。当胚胎处于焦点时，改变微移液器的位置，以与感兴趣的斧头尖端（例如，aCC、RP3）进行温和接触。
   3. 使用标记为抗HRP Cy3的神经元，将染料滴在ACC或RP3（图3）的神经肌肉结处的右腹部（A2+A6）半段。使用手动控件（鼠标;图2，5）释放染料，并在用微操作器掉落染料后取出微移液器，并移动到下一个注射部位。
      注:与其他染料（例如，路西法黄、钙素）不同，这种染料通过间隙结扩散到邻近细胞，嗜脂染料与细胞膜有关，不会转移到邻居。然而，由于染料滴的尺寸相对较大，这种技术也会导致对搭档肌肉进行标记（图3A）。
3. 在成像前，在染料滴落后，在RT上孵育样品1小时。
   注:在安装之前，可以在此处暂停该协议，样品可在 4°C 过夜。如果细胞内直接耦合（DC）放大器一应俱全^，也可通过电泳来输送。

7. 使用共聚焦显微镜成像

1. 在钳子的帮助下，从玻璃滑块上取下双面胶带和乙烯基胶带。
2. 在四角用少量真空润滑脂（材料表）准备盖玻片（22 x 22 mm² 2 1 盖玻璃），并小心地放在样品上，避免气泡。使用任务雨刮器清除多余的 PBS。
3. 向下推盖滑移以调整物镜和样品之间的工作距离。用指甲油完全密封盖滑的边缘。
4. 使用共聚焦显微镜以 10 倍和 100 倍放大倍率进行图像。
5. 使用 ImageJ 软件处理来自显微镜的原始图像 （材料表）。
   注:安装最佳图像后 10 分钟内必须开始观察。否则，在RT，染料将扩散到注射部位附近的部位，从而产生不需要的成像背景。为了减缓染料的扩散，样品可以在4°C下储存几个小时。

结果

图3C显示了aCC和RP3运动神经元的代表性图像，以演示在15小时AEL下运动神经元的多色标记。它们的树突形态在胚胎之间基本上都是不变的。使用抗HRP抗体获得的染色模式以灰色显示。一小滴DiO或DiD分别沉积在肌肉1或6/7的NMJ上。图 4演示了定量测量兴趣表型的能力。我们计算了野生类型的树突尖总数，与突变体（例如，dscam1^-/-?...

讨论

与遗传细胞标记技术而言，使用染料标记来研究神经元形态学具有几个优点。染料标记技术可以最大限度地减少标记和成像运动神经元形态所需的时间。染料标记过程相当快，因为它需要不到2小时，使我们能够定义神经元投影的轮廓。作为替代方案，可以通过选择在aCC中表达酵母GAL4转录因子的GAL4线来可视化aCC运动神经元，并穿过由上游活化序列^（UAS）21控制的绿色荧光蛋白（GF...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)