Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Resumen

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Resumen

Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.

Introducción

El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)^1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales^2,4,5,6.

Durante el desarrollo temprano del sistema nervioso, los neuroblastos se dividen y generan un gran número de glia y neuronas. La relación espaciotemporal entre la delaminación y el perfil de expresión génica de los neuroblastos se ha investigado previamente en detalle^7,8,9. En el caso del sistema de neuronas motoras, la formación de unión neuromuscular embrionaria (NMJ) se ha estudiado ampliamente utilizando el aCC (célula de esquina anterior), RP2 (camarón crudo 2), y las neuronas motoras RP5^2,10. Por ejemplo, cuando la neurona motora RP5 forma una unión sináptica naciente, la filopodia presináptica y postsináptica se entremezcla^{nitora 11,12,13}. Dicha comunicación celular directa es vital para iniciar la formación de NMJ. Contrariamente a lo que sabemos sobre las ramas nerviosas periféricas, nuestro conocimiento de cómo las dendritas motoras inician la conectividad sináptica dentro del SNC sigue siendo primitivo.

En este informe, presentamos una técnica que permite el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en embriones mediante la administración mediada por micropipette de colorantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear las 38 neuronas motoras que inertan cada uno de los 30 músculos de la pared corporal en un hemisegmento a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL)¹⁴. Mediante el uso de esta técnica, nuestro grupo ha investigado a fondo numerosos alelos de ganancia de función/pérdida de función^15,16,17. Recientemente hemos desentrañado los mecanismos moleculares que impulsan el inicio de la conectividad de dendrita motora y hemos demostrado que una interacción Dscam1-Dock-Pak define el sitio de crecimiento de dendrita en la neurona motora aCC¹⁷. En general, esta técnica es adaptable para el análisis fenotípico de cualquier neurona motora embrionaria en cepas de tipo salvaje o mutantes, mejorando nuestra capacidad de proporcionar nuevos conocimientos sobre el diseño funcional del sistema nervioso Drosophila.

Protocolo

1. Equipos y suministros

1. Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos
   1. Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.
      NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones.
   2. Hacer platos de agar con premezcla de agar de uva(Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones enumeradas. Revuelva brevemente 1 paquete de la mezcla de polvo en 500 ml de temperatura ambiente (RT, 23 oC) dH₂O y microonda la mezcla disuelta a hervir vigorosamente. Después de enfriar a 70 o75 oC, vierta la mezcla en los platos de Petri (60 mm). Después de solidificarse el agar, guarde las placas a 4oC.
   3. Preparar la pasta de levadura mezclando levadura seca activa(Tabla de Materiales)y agua a una consistencia de pasta, y manténgala a 4oC.
   4. Utilice jaulas de recolección de huevos (para plato Petri de 60 mm, Tabla de materiales)que proporcionen suficiente flujo de aire.
2. Preparación de agujas de disección y micropipetas de inyección de tinte
   1. Preparar micropipette de inyección de tinte y aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 0,6 mm y un diámetro exterior de 1,2 mm(Tabla de materiales). Tire del tubo capilar por un tirador de micropipeta al 7% de la salida máxima de 170 V(Tabla de materiales)para crear una aguja afilada con un cónico de 0,4 cm de longitud.
   2. Para la inyección de tinte, ajuste el micropipeta con un beveler de micropipeta(Tabla de materiales)mediante una técnica de biselado de burbujas descrita en el manual del instrumento.
      1. En resumen, remoje la amoladora con un agente humectante(Tabla de Materiales)para evitar que el agua 'arrastre' la punta de la aguja. Coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 x 30o y baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire dentro de la aguja, para asegurarse de que el micropipeta estará libre de virutas de vidrio.
      2. Marque el micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que es difícil localizar la abertura estrecha de la micropipeta que se forma en un ángulo.

2. Preparación para la recogida de embriones

1. Asegúrese de que las moscas adultas (20-40 de tipo salvaje Canton-S o moscas blancas), machos y hembras, se mantengan en condiciones jóvenes (<7 días) y saludables para la recolección ideal de huevos.
   NOTA: Para estimular la puesta de huevos, las moscas son entrenadas en su jaula de recolección de huevos un par de días antes de la recolección de huevos en placas de agar rayadas con pasta de levadura al menos una vez al día.

3. Escenificación de embriones

1. Permita que las moscas pongan huevos durante la noche (o al menos 15 h) en RT para recoger los embriones a 15 h AEL, es decir, etapa 16^18,para ver la dendritogénesis de las neuronas motoras aCC y RP3. Por la mañana, recoge el plato con los huevos.
   NOTA: Los embriones a 15 h AEL tendrán un intestino de 4 cámaras^{distinto 18.} Para obtener imágenes, las diferentes etapas siguen sus criterios morfológicos específicos y las condiciones de envejecimiento.
2. Para recoger los embriones, deschorionar los huevos puestos en el plato con 50% de lejía durante 5 min.
3. Una vez que los coros se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones. Usando una botella de agua, diluir la lejía que queda en la placa y recoger tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro.
4. Lavar los embriones en el filtro de 3 x 4 x con más agua o hasta que el olor de lejía se disipate. Retire el filtro del aparato y lave los embriones en otra placa limpia con agua. Decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones.
5. Preparar una diapositiva de vidrio cubriéndola con dos capas de cinta de vinilo en el centro, formando un rectángulo. Corte una piscina rectangular de la cinta con una cuchilla de afeitar. Coloque una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara hacia el extremo superior de la piscina, aquí es donde se colocarán los embriones como se muestra en la Figura 1.
6. Usando fórceps finos, seleccione individualmente 5 x 10 embriones a 15 h AEL y colóquelos en la cinta de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Añadir la salina de insectos Ringer¹⁹ a la piscina de disección para proteger los embriones de la desecación(Figura 1).

4. Disección y tinción

1. Usando una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección(Tabla de Materiales), corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior a su extremo anterior. A continuación, arrastre el embrión fuera de la membrana vitelina de la cinta al vidrio (en caja en la Figura 1). Tenga cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión.
2. Voltear los tejidos epiteliales desde el centro y fijar el borde epidérmico en la superficie de la diapositiva de vidrio(Figura 1, recuadro).
3. Usando una aguja conectada a un tubo con una abertura de punta de 300 m (preparada rompiendo la punta delgada de una aguja de disección), aspirar o soplar aire para separar y eliminar los troncos tracatos longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes.
4. Utilice un 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) para fijar los embriones durante 5 minutos en RT. Lavar los embriones 3 veces con PBS.
5. Manchar los embriones con 1 l de anticuerpo anti-caballo peroxidasa conjugado con tinte cianina 3 (anti-HRP Cy3)(Tabla de Materiales)en 200 éL de PBS durante 1 h. Lavar los embriones con PBS 3x después de la tinción.
   NOTA: El tinte de anti-HRP se puede cambiar en función de los tintes lipofílicos de elección para la inyección.

5. Relleno de la micropipeta de inyección

1. Caliente los colorantes lipofílicos (5 mg/ml de DiO o DiD, Tabla de Materiales)a 60oC en una mezcla de 1:10 de etanol:aceite vegetal antes de su uso.
2. Prepare un portaobjetos de colorante disuelto con aceite para la micropipeta de inyección. Coloque el micropipeta en el soporte capilar(Figura 2,#1). Usando el micromanipulador(Tabla de Materiales),ajuste el micropipeta para que esté sobre el tobogán de tinte. A continuación, ajuste el escenario para colocar el micropipeta en el tinte(Figura 2,#2).
3. Para llenar el micropipeta, utilice un microinyector(Tabla de materiales)(Figura 2,#3). Recoja el tinte en el micropités ajustando el P_i (presión de inyección) entre 200-500 hPa (hectopascal), el T_i (tiempo de inyección) entre 0,1 x 0,5 s y P_c (presión de compensación) a 0 hPa durante 5 min(figura 2, #4).
4. Una vez recogido el tinte, retire el tobogán de colorante y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente el P_c a un rango de 20 a 60 hPa antes de bajar el micropipeta en la muestra para evitar la contaminación de PBS por acción capilar.

6. Inyección de tinte en las neuronas

1. Localice el embrión en el centro utilizando el microscopio con una lente objetivo 10x(Tabla de Materiales)y alinee la micropipeta con el embrión.
   NOTA: El tamaño de la gota de tinte se puede ajustar cambiando la P_i o el tamaño de la abertura de la punta del micropipeta. La gota debe ser de 10 a 20 m, que es aproximadamente el ancho de 1 músculo.
2. Cambie la lente objetivo a una lente 40x de inmersión en agua(Tabla de materiales)y sumerja la lente en PBS para ver el embrión.
   1. Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.
   2. Durante la inyección, utilice la microscopía de campo brillante para ver la gota de tinte. Cuando el embrión esté enfocado, cambie la posición del micropipeta para establecer un contacto suave con la punta del axón de interés (por ejemplo, aCC, RP3).
   3. Suelte el tinte en un hemi-segmento abdominal derecho (A2-A6) en la unión neuromuscular de aCC o RP3(Figura 3)con DiD o DiO, utilizando las neuronas marcadas por anti-HRP Cy3. Uso del control manual (ratón; Figura 2, 5) liberar el tinte y quitar el micropipeta después de dejar caer el tinte con el micromanipulador y pasar al siguiente lugar de inyección.
      NOTA: A diferencia de otros tintes (por ejemplo, amarillo Lucifer, calceína) que se propagan a las células vecinas a través de uniones de separación, los tintes lipofílicos se asocian con las membranas celulares y no se transfieren a los vecinos. Debido al tamaño relativamente grande de la gota de tinte, sin embargo, esta técnica también resulta en el etiquetado de los músculos asociados(Figura 3A).
3. Incubar la muestra a RT durante 1 h después de la gota de tinte antes de la toma de imágenes.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes del montaje, y la muestra se puede mantener a 4 oC durante la noche. Los disteéticos lipofílicos también se pueden administrar utilizando iontoforesis, si un amplificador intracelular de acoplamiento directo (DC) está disponible²⁰.

7. Imágenes con un microscopio confocal

1. Retire la cinta de doble cara y la cinta de vinilo de la corredera de vidrio con la ayuda de fórceps.
2. Preparar un resbalón de la cubierta (22 x 22 mm² Vidrio de cubierta No.1) con una pequeña cantidad de grasa al vacío(Tabla de Materiales)en las cuatro esquinas y colocar cuidadosamente en la muestra, evitando las burbujas de aire. Elimine cualquier exceso de PBS con limpiaparabrisas de tareas.
3. Empuje hacia abajo el deslizamiento de la cubierta para ajustar la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la muestra. Selle completamente los bordes del deslizamiento de la cubierta con esmalte de uñas.
4. Imagen a 10x y 100x aumento utilizando un microscopio confocal.
5. Utilice el software ImageJ para procesar imágenes raw desde el microscopio(Tabla de materiales).
   NOTA: La observación debe comenzar dentro de los 10 minutos después del montaje para obtener las mejores imágenes. De lo contrario, en RT, el tinte se extenderá a sitios adyacentes al lugar de inyección creando fondo no deseado para la toma de imágenes. Para ralentizar la difusión del tinte, la muestra se puede almacenar a 4 oC durante un par de horas.

Resultados

Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad d...

Discusión

El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)