Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Résumé

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Résumé

Nous décrivons une technique pour l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans Drosophila. Nous utilisons un colorant lipophile dissous à l'huile et livrons une petite gouttelette à une préparation de filet embryonnaire par un micro-injecteur. Chaque neurone moteur dont la membrane est contactée par la gouttelette peut alors être rapidement étiqueté. Les neurones moteurs individuels sont continuellement étiquetés, ce qui permet de visualiser clairement les détails structuraux fins. Étant donné que les colorants lipophiles viennent dans différentes couleurs, la technique fournit également un moyen d'obtenir des neurones adjacents étiquetés en multicolore. Cette technique de traçage est donc utile pour étudier la morphogénèse neuronale et la connectivité synaptique dans le système de neurones moteurs de Drosophila.

Introduction

Le système de neurones moteurs embryonnaires de Drosophila offre un modèle expérimental puissant pour analyser les mécanismes sous-jacents au développement du système nerveux central (SNC)^1,2,3. Le système de neurones moteurs est favorable aux techniques biochimiques, génétiques, d'imagerie et d'électrophysiologie. En utilisant les techniques, les manipulations génétiques et les analyses fonctionnelles peuvent être effectuées au niveau des neurones moteurs uniques^2,4,5,6.

Au début du développement du système nerveux, les neuroblastes se divisent et génèrent un grand nombre de glies et de neurones. La relation spatiotemporale entre la délamination et le profil d'expression génique des neuroblastes a déjà été étudiée en détail^7,8,9. Dans le cas du système de neurones moteurs, la formation de la jonction neuromusculaire embryonnaire (NMJ) a été largement étudiée en utilisant l'aCC (cellule d'angle antérieure), RP2 (crevette brute 2), et RP5 neurones moteurs^2,10. Par exemple, lorsque le neurone moteur RP5 forme une jonction synaptique naissante, la filopodia pré-synaptique et post-synaptique se mêle^11,12,13. Une telle communication cellulaire directe est essentielle pour initier la formation nMJ. Contrairement à ce que nous savons sur les branches nerveuses périphériques, notre connaissance de la façon dont les dendrites motrices initier la connectivité synaptique au sein du SNC est encore primitive.

Dans ce rapport, nous présentons une technique qui permet l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans les embryons au moyen de la livraison micropipette-négociée des colorants lipophiles. Cette technique nous permet de retracer les 38 neurones moteurs qui intériorisent chacun des 30 muscles de la paroi du corps dans un segment d'hémi à 15 h après la ponte (AEL)¹⁴. En utilisant cette technique, notre groupe a étudié à fond de nombreux gains de fonction/perte de fonction alleles^15,16,17. Nous avons récemment démêlé les mécanismes moléculaires qui conduisent l'initiation de la connectivité de dendrite moteur et démontré qu'une interaction Dscam1-Dock-Pak définit le site de la croissance dendrite dans le neurone moteur aCC¹⁷. En général, cette technique est adaptable pour l'analyse phénotypique de tous les neurones moteurs embryonnaires de type sauvage ou souches mutantes, ce qui améliore notre capacité à fournir de nouvelles informations sur la conception fonctionnelle du système nerveux Drosophila.

Protocole

1. Équipement et fournitures

1. Matériel pour la collecte d'embryons et la formation des adultes à pondre
   1. Préparer l'appareil de filtration en coupant un tube de 50 ml et en coupant un trou dans le bouchon pour régler un filtre à mailles avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)entre le tube et le bouchon.
      REMARQUE : Alternativement, les passoires cellulaires avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)peuvent être utilisées pour l'étape de filtration de la collecte d'embryons.
   2. Faire des assiettes d'agar avec du prémélange d'agar de raisin (Table des matériaux) selon les instructions énumérées. En bref, remuer doucement 1 sachet de mélange de poudre dans 500 ml de température ambiante (RT, 23 oC) dH₂O et cuire au micro-ondes le mélange dissous à ébullition vigoureuse. Après refroidissement jusqu'à 70 à 75 oC, verser le mélange dans la vaisselle Petri (60 mm). Une fois l'agar solidifié, entreposez les assiettes à 4 oC.
   3. Préparer la pâte de levure en mélangeant la levure sèche active(Tableau des matériaux)et l'eau à une consistance de pâte, et de garder à 4 oC.
   4. Utilisez des cages de collecte d'œufs (pour le plat Petri de 60 mm, Table of Materials)qui fournissent un débit d'air suffisant.
2. Préparation des aiguilles de dissection et micropipettes d'injection de colorant
   1. Préparer la micropipette d'injection de colorant et l'aiguille de dissection du même tube capillaire avec un diamètre intérieur de 0,6 mm et un diamètre extérieur de 1,2 mm (Tableau des matériaux). Tirez le tube capillaire par un puller micropipette à 7% à partir de 170 V sortie maximale (Tableau des matériaux) pour créer une aiguille pointue avec un cône de 0,4 cm de longueur.
   2. Pour l'injection de colorant, ajustez la micropipette à l'aide d'un beveler micropipette(Table of Materials)par une technique de biplage à bulles décrite dans le manuel de l'instrument.
      1. En bref, faire tremper le broyeur avec un agent mouillant (Table des matériaux) pour empêcher l'eau de «glisser» la pointe de l'aiguille. Placer l'aiguille sur la pince micropipette à 25-30 degrés et abaisser la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface de beveling. Broyer l'aiguille pendant qu'une seringue avec des tubes pousse l'air dans l'aiguille, pour s'assurer que la micropipette sera dégagée des copeaux de verre.
      2. Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l'ouverture à l'extrémité après le bifurcation, car il est difficile de localiser l'ouverture étroite de la micropipette qui se forme à un angle.

2. Préparation pour la collecte d'embryons

1. Veiller à ce que les mouches adultes (20 à 40 mouches de type sauvage Canton-S ou les mouches blanches), les mâles et les femelles, soient maintenues dans des conditions jeunes (7 jours) et des conditions saines pour la collecte idéale des œufs.
   REMARQUE : Pour stimuler la ponte, les mouches sont dressées dans leur cage de collecte d'œufs quelques jours avant la collecte des œufs sur des assiettes d'agar striées de pâte de levure au moins une fois par jour.

3. Mise en scène d'embryon

1. Permettre aux mouches de pondre des œufs pendant la nuit (ou au moins 15 h) à RT pour recueillir les embryons à 15 h AEL, c'est-à-dire, stade 16¹⁸, pour voir la dendritogénèse des neurones moteurs aCC et RP3. Le matin, recueillir l'assiette avec les œufs.
   REMARQUE: Les embryons à 15 h AEL auront un intestin distinct à 4 chambres¹⁸. Pour l'imagerie, différentes étapes suivent leurs critères morphologiques spécifiques et les conditions de vieillissement.
2. Pour recueillir les embryons, déchorioner les œufs pondus sur la plaque avec 50% d'eau de Javel pendant 5 min.
3. Une fois les corvées effacées, versez le contenu de la plaque à travers l'appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons. À l'aide d'une bouteille d'eau pressée, diluer l'eau de Javel laissée sur la plaque et recueillir autant d'embryons que possible en décantant le mélange dans le filtre.
4. Laver les embryons sur le filtre 3-4x avec plus d'eau ou jusqu'à ce que l'odeur d'eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l'appareil et lavez les embryons sur une autre plaque propre avec de l'eau. Décante l'eau de la nouvelle plaque sur laquelle se trouvent les embryons.
5. Préparer une lame de verre en la recouvrant de deux couches de ruban adhésif au centre, formant un rectangle. Couper une piscine rectangulaire de la bande à l'aide d'une lame de rasoir. Placez une fine bande de ruban adhésif à double face vers l'extrémité supérieure de la piscine, c'est là que les embryons seront placés comme indiqué à la figure 1.
6. À l'aide de forceps fins, sélectionnez individuellement des embryons de 5 à 10 à 15 h AEL et placez-les sur le ruban à double face avec le côté dorsal vers le haut. Ajouter le salin¹⁹ de l'insecte Ringer au bassin de dissection pour protéger les embryons de la dessiccation (Figure 1).

4. Dissection et coloration

1. À l'aide d'une aiguille en verre sous un microscope disséquant(Tableau des matériaux),coupez la ligne médiane d'un seul embryon à sa surface de son postérieur à son extrémité antérieure. Puis faites glisser l'embryon hors de la membrane vitelline de la bande sur le verre (encadré dans la figure 1). Veillez à ne pas endommager les tissus intérieurs de l'embryon.
2. Retourner les tissus épithéliales du centre et attacher le bord épidermique sur la surface de la glissière de verre(figure 1, enset).
3. À l'aide d'une aiguille reliée au tube avec une ouverture de pointe de 300 m (préparée en cassant la fine pointe d'une aiguille de dissection), aspirez ou soufflez de l'air pour détacher et enlever les troncs trachéaux longitudinaux dorsaux ainsi que les boyaux restants.
4. Utilisez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) pour fixer les embryons pendant 5 min à RT. Lavez les embryons 3x avec PBS.
5. Taïr les embryons avec 1 L d'anticorps peroxidase anti-raifort conjugué s'est rétorquer avec du colorant cyanine 3 (anti-HRP Cy3)(Tableau des matériaux)en 200 'L de PBS pendant 1 h. Laver les embryons avec PBS 3x après coloration.
   REMARQUE: Le colorant de l'anti-HRP peut être changé en fonction des colorants lipophiles de choix pour l'injection.

5. Remplissage de la micro-pipette d'injection

1. Chauffer les colorants lipophiles (5 mg/mL de DiO ou DeiD, Table of Materials) à 60 oC dans un mélange de 1:10 d'éthanol : huile végétale avant utilisation.
2. Préparer une glissière de colorant dissous à l'huile pour la micropipette d'injection. Placez la micropipette dans le support capillaire(figure 2,#1). À l'aide du micromanipulateur(Tableau des matériaux),ajustez la micropipette pour qu'elle soit au-dessus de la glissière de teinture. Ensuite, ajustez la scène pour placer la micropipette sur le colorant(figure 2, #2).
3. Pour remplir la micropipette, utilisez un micro-injecteur (Tableau des matériaux) (Figure 2, #3). Recueillir le colorant dans la micropipette en réglant le P_i (pression d'injection) entre 200 à 500 hPa (hectopascal), le T_i (temps d'injection) entre 0,1 et 0,5 s et P_c (pression de compensation) à 0 hPa pour 5 min (figure 2, #4).
4. Une fois le colorant recueilli, retirez la lame de teinture et placez l'échantillon sur le stade du microscope. Ensuite, augmenter le P_c à une plage de 20 à 60 hPa avant d'abaisser la micropipette dans l'échantillon pour prévenir la contamination du PBS par action capillaire.

6. Injection de teinture dans les neurones

1. Localiser l'embryon au centre à l'aide du microscope avec une lentille objective 10x (Tableau des matériaux) et aligner la micropipette avec l'embryon.
   REMARQUE : La taille de la gouttelette de colorant peut être ajustée en changeant le P_i ou la taille de l'ouverture de la pointe de micropipette. La gouttelette doit être de 10 à 20 m, ce qui est environ la largeur de 1 muscle.
2. Changer la lentille objective à une lentille d'immersion de l'eau 40x (Tableau des matériaux) et plonger la lentille dans PBS pour voir l'embryon.
   1. Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l'anti-HRP Cy3 et déterminer le site d'injection.
   2. Pendant l'injection, utilisez la microscopie brightfield pour voir la gouttelette de colorant. Lorsque l'embryon est mis au point, modifiez la position de la micropipette pour établir un contact doux avec la pointe de l'axone d'intérêt (p. ex., aCC, RP3).
   3. Déposez le colorant dans un hemi-segment abdominal droit (A2-A6) à la jonction neuromusculaire de l'aCC ou du RP3 (figure 3) avec DiD ou DiO, en utilisant les neurones marqués par l'anti-HRP Cy3. Utilisation du contrôle de la main (souris; Figure 2, 5) relâchez le colorant et retirez la micropipette après avoir laissé tomber le colorant avec le micromanipulateur et passez au site d'injection suivant.
      REMARQUE : Contrairement à d'autres colorants (p. ex. jaune Lucifer, calcéine) qui se propagent dans les cellules voisines par des jonctions d'écart, les colorants lipophiles s'associent aux membranes cellulaires et ne sont pas transférés aux voisins. Cependant, en raison de la taille relativement grande de la gouttelette de colorant, cette technique entraîne également l'étiquetage des muscles partenaires (figure 3A).
3. Incuber l'échantillon à RT pendant 1 h après la teinture-goutte avant l'imagerie.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici avant le montage, et l'échantillon peut être maintenu à 4 oC pendant la nuit. Les colorants lipophiles peuvent également être livrés à l'aide de l'iontophoresis, si un amplificateur intracellulaire couplé direct (DC) est facilement disponible²⁰.

7. Imagerie avec un microscope Confocal

1. Retirez le ruban à double face et le ruban vinyle de la glissière en verre à l'aide de forceps.
2. Préparer un bordereau de couverture (22 x 22 mm^{2 verre} de couverture No.1) avec une petite quantité de graisse sous vide ( Tablede matériaux) aux quatre coins et placer soigneusement sur l'échantillon, en évitant les bulles d'air. Supprimer tout excès de PBS à l'aide d'essuie-glaces.
3. Appuyez sur le bordereau de couverture pour ajuster la distance de travail entre la lentille objective et l'échantillon. Scellez complètement les bords de la glissière de couverture avec du vernis à ongles.
4. Image à 10x et 100x grossissement à l'aide d'un microscope confocal.
5. Utilisez le logiciel ImageJ pour le traitement des images brutes du microscope (Table of Materials).
   REMARQUE : L'observation doit commencer dans les 10 minutes après le montage pour les meilleures images. Sinon, à RT, le colorant se propagera aux sites adjacents au site d'injection créant l'arrière-plan non désiré pour l'imagerie. Pour ralentir la diffusion du colorant, l'échantillon peut être stocké à 4 oC pendant quelques heures.

Résultats

Une image représentative des neurones moteurs aCC et RP3 est montrée dans la figure 3C pour démontrer l'étiquetage multicolore des neurones moteurs à 15 h AEL. Leurs morphologies dendritiques sont en grande partie invariantes entre les embryons. Le modèle de coloration obtenu avec l'anticorps anti-HRP est montré en gris. Une petite gouttelette de DiO ou DiD a été déposée sur le NMJ du muscle 1 ou 6/7, respectivement. La figure 4 démo...

Discussion

L'utilisation de l'étiquetage des colorants pour l'étude de la morphologie neuronale présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d'étiquetage génétique des cellules. La technique d'étiquetage des colorants peut réduire au minimum le temps nécessaire à l'étiquetage et à l'imagerie des morphologies des neurones moteurs. Le processus d'étiquetage des colorants est assez rapide car il faut moins de 2 h et nous permet de définir le contour des projections neuronales. Comme alternative, on peut visual...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)