Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

Riepilogo

Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.

Abstract

Descriviamo una tecnica per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni in Drosophila. Usiamo un coloranti lipofilo disciolto di olio e forniamo una piccola gocciolina a una preparazione di filetto embrionale da un microiniettore. Ogni neurone motorio la cui membrana viene contattata dalla goccia può quindi essere rapidamente etichettato. I singoli motoneuroni sono continuamente etichettati, consentendo di visualizzare chiaramente i dettagli strutturali fini. Dato che i coloranti lipofili sono disponibili in vari colori, la tecnica fornisce anche un mezzo per ottenere neuroni adiacenti etichettati in multicolore. Questa tecnica di tracciamento è quindi utile per studiare la morfogenesi neuronale e la connettività sinaptica nel sistema dei neuroni motori della Drosophila.

Introduzione

Il sistema di motoneuroni embrionali della Drosophila offre un potente modello sperimentale per analizzare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS)^1,2,3. Il sistema dei motoneuroni è suscettibile alle tecniche biochimiche, genetiche, di imaging ed elettrofisiologiche. Utilizzando le tecniche, le manipolazioni genetiche e le analisi funzionali possono essere effettuate a livello di singoli motoneuroni^2,4,5,6.

Durante lo sviluppo precoce del sistema nervoso, i neuroblasti si dividono e generano un gran numero di glia e neuroni. La relazione spatiotemporale tra la delaminazione e il profilo di espressione genica dei neuroblasti è stata precedentemente studiata nel dettaglio^7,8,9. Nel caso del sistema dei motoneuroni, la formazione di giunzione neuromuscolare embrionale (NMJ) è stata ampiamente studiata utilizzando l'aCC (cellula d'angolo anteriore), RP2 (gambero grezzo 2) e i motoneuroni RP5^2,10. Ad esempio, quando il motoneurone RP5 forma una giunzione sinaptica nascente, la filopodia pre-sinaptica e post-sinaptica viene mescolata^11,12,13. Tale comunicazione cellulare diretta è vitale per avviare la formazione di NMJ. Contrariamente a quanto sappiamo sui rami nervosi periferici, la nostra conoscenza di come i dendriti motori avviano la connettività sinaptica all'interno del SNC è ancora primitiva.

In questa relazione, presentiamo una tecnica che permette l'etichettatura retrograda dei motoneuroni negli embrioni attraverso la somministrazione mediata da micropipette di coloranti lipofili. Questa tecnica ci permette di tracciare i 38 motoneuroni innervando ciascuno dei 30 muscoli della parete del corpo in un emi-segmento a 15 h dopo la deposizione delle uova (AEL)¹⁴. Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo ha studiato a fondo numerosi atleti di funzione/perdita di funzione^{alleli 15,16,17}. Recentemente abbiamo svelato i meccanismi molecolari che guidano l'avvio della connettività dendrite motoria e dimostrato che un'interazione Dscam1-Dock-Pak definisce il sito di crescita dendrite nel motoneurone aCC¹⁷. In generale, questa tecnica è adattabile per l'analisi fenotipica di eventuali motoneuroni embrionali in ceppi di tipo selvatico o mutanti, migliorando la nostra capacità di fornire nuove intuizioni sulla progettazione funzionale del sistema nervoso della Drosophila.

Protocollo

1. Attrezzature e forniture

1. Materiali per la raccolta di embrioni e formazione degli adulti a deporre le uova
   1. Preparare l'apparato di filtrazione tagliando un tubo da 50 mL e tagliando un foro nel tappo per impostare un filtro a rete con pori di 100 m (Tabella dei Materiali) tra il tubo e il tappo.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare i colini cellulari con pori di 100 m (Tabella dei materiali) per la fase di filtrazione della raccolta degli embrioni.
   2. Fare piatti di agar con premiscela di agar d'uva (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni elencate. In breve, mescolare delicatamente 1 confezione della miscela di polvere in 500 mL di temperatura ambiente (RT, 23 c) dH₂O e microonde la miscela disciolta a ebollizione vigorosa. Dopo aver raffreddato a 70-75 gradi centigradi, versare il composto in piatti Petri (60 mm). Dopo che l'agar è solidificato, conservare le piastre a 4 gradi centigradi.
   3. Preparare la pasta di lievito mescolando lievito secco attivo (Tabella dei materiali) e acqua a una consistenza di pasta, e tenere a 4 gradi centigradi.
   4. Utilizzare gabbie per la raccolta delle uova (per piatto Petri da 60 mm, Tavola dei materiali)che forniscono un flusso d'aria sufficiente.
2. Preparazione degli aghi di dissezione e micropipette per l'iniezione di tintura
   1. Preparare micropipet a iniezione di tintura e ago di dissezione dallo stesso tubo capillare con un diametro interno di 0,6 mm e un diametro esterno di 1,2 mm (Tabella dei materiali). Tirare il tubo capillare con un estrattore di micropipette al 7% da 170 V massima di uscita (Tabella dei materiali) per creare un ago affilato con un cono di 0,4 cm di lunghezza.
   2. Per l'iniezione di tintura, regolare la micropipetta con una sguvatrice micropipetta (Tabella dei materiali) con una tecnica di svalutazione a bolle descritta nel manuale dello strumento.
      1. In breve, immergere la smerigliatrice con un agente bagnante (Tabella dei materiali) per evitare che l'acqua 'trascinamento' la punta dell'ago. Posizionare l'ago sul morsetto della micropipetta a 25-30 gradi e abbassare la punta su due terzi del raggio fuori dal centro della superficie di smussata. Macinare l'ago mentre una siringa con tubi spinge l'aria nell'ago, per garantire che la micropipetta sia libera dai trucioli di vetro.
      2. Contrassegnare la micropipetta con un pennarello permanente a punta fine per indicare la posizione dell'apertura sulla punta dopo la smussatura in quanto è difficile individuare l'apertura stretta della micropipetta che si forma ad angolo.

2. Preparazione per la raccolta degli embrioni

1. Assicurarsi che le mosche per adulti (20-40 mosche bianche di tipo selvaggio, i maschi e le femmine, siano mantenute in giovani (<7 giorni) e in condizioni salutari per la raccolta ideale delle uova.
   NOTA: Per stimolare la deposizione delle uova, le mosche vengono addestrate nella loro gabbia di raccolta delle uova un paio di giorni prima della raccolta delle uova su piastre di agar striate con pasta di lievito almeno una volta al giorno.

3. Staging degli embrioni

1. Lasciare che le mosche depongano le uova durante la notte (o almeno 15 h) a RT per raccogliere gli embrioni a 15 h AEL, vale a dire, stadio 16¹⁸, per visualizzare la dendritogenesi dei motoneuroni aCC e RP3. Al mattino, raccogliere il piatto con le uova.
   NOTA: Gli embrioni a 15 h AEL avranno un distinto intestino a 4 camere¹⁸. Per l'imaging di diverse fasi seguire i loro criteri morfologici specifici e le condizioni di invecchiamento.
2. Per raccogliere gli embrioni, dechorionate le uova deposte sul piatto con 50% candeggina per 5 min.
3. Una volta che i chorions sono stati cancellati, versare il contenuto della piastra attraverso l'apparato di filtrazione o il colino cellulare per isolare gli embrioni. Utilizzando una bottiglia di spremere di acqua, diluire la candeggina lasciata sul piatto e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni decantando la miscela nel filtro.
4. Lavare gli embrioni sul filtro 3x con più acqua o fino a quando l'odore di candeggina si dissipa. Rimuovere il filtro dall'apparecchio e lavare gli embrioni su un'altra piastra pulita con acqua. Decant l'acqua dalla nuova piastra che gli embrioni sono su.
5. Preparare uno scivolo di vetro coprendolo con due strati di nastro in vinile al centro, formando un rettangolo. Tagliare una piscina rettangolare dal nastro utilizzando una lama di rasoio. Posizionare una sottile striscia di nastro a doppio lato verso l'estremità superiore della piscina, questo è dove gli embrioni saranno collocati come mostrato Figura 1.
6. Utilizzando pinze fini, selezionare singolarmente 5-10 embrioni a 15 h AEL e posizionarli sul nastro a due lati con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere l'insetto Ringer's salline¹⁹ al pool di dissezione per proteggere gli embrioni dalla disidratazione (Figura 1).

4. Dissezione e colorazione

1. Utilizzando un ago di vetro al microscopio dissezionale (Tabella dei Materiali), tagliare attraverso la linea mediana di un singolo embrione alla sua superficie dalla sua estremità posteriore a quella anteriore. Quindi trascinare l'embrione fuori dalla membrana vitelline dal nastro sul vetro (scatolato nella Figura 1). Fare attenzione a non danneggiare i tessuti interni dell'embrione.
2. Capovolgere i tessuti epiteliali dal centro e fissare il bordo epiderlico sulla superficie dello scivolo di vetro (Figura 1, interno).
3. L'uso di un ago collegato al tubo con un'apertura a punta di 300 m (preparato rompendo la punta sottile di un ago di dissezione), aspira o soffia aria per staccare e rimuovere i tronchi tracheali longitudinali dorsali così come le budella rimanenti.
4. Utilizzare il 4% di paraformaldeide (PFA) nella salina tamponata da fosfato (PBS) per fissare gli embrioni per 5 min a RT. Lavare gli embrioni 3x con PBS.
5. Macchiare gli embrioni con 1 Ll L di anticorpo anti-rafano perossico coniugato con cianina 3 colorante (anti-HRP Cy3) (Tabella dei materiali) in 200 l di PBS per 1 h. Lavare gli embrioni con PBS 3x dopo la colorazione.
   NOTA: Il colorante dell'anti-HRP può essere modificato in base ai coloranti lipofilici di scelta per l'iniezione.

5. Riempimento della Micro-pipetta di iniezione

1. Coloranti lipofilici termifici (5 mg/mL di DiO o DiD, Tabella dei Materiali)a 60 gradi centigradi in una miscela di 1:10 di etanolo:olio vegetale prima dell'uso.
2. Preparare un colorante disciolto dall'olio per la micropipetta di iniezione. Posizionare la micropipetta nel supporto capillare(Figura 2,#1). Utilizzando il micromanipolatore (Tabella dei materiali), regolare la micropipetta per essere sopra il vetrino di tintura. Quindi, regolare lo stage per posizionare la micropipetta sul tinri(Figura 2, #2).
3. Per riempire la micropipetta, utilizzare un microiniettore (Tabella dei materiali) ( Figura2, #3). Raccogliere il tintura nella micropipetta impostando il P_i (pressione di iniezione) tra 20-500 hPa (ectopascal), il T_i (tempo di iniezione) tra 0,1-0,5 s e P_c (pressione di compensazione) a 0 hPa per 5 min (Figura 2, #4).
4. Una volta raccolto il tinrito, rimuovere il vetrino del tinrieto e posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Successivamente, aumentare la P_c a un intervallo di 20-60 hPa prima di abbassare la micropipetta nel campione per evitare la contaminazione di PBS mediante azione capillare.

6. Iniezione di tinture nei neuroni

1. Individuare l'embrione al centro utilizzando il microscopio con obiettivo 10x (Tabella dei materiali) e allineare la micropipetta con l'embrione.
   NOTA: La dimensione della goccia di colore può essere regolata cambiando la P_i o la dimensione dell'apertura della punta della micropipetta. La goccia deve essere di 10-20 m, che è approssimativamente la larghezza di 1 muscolo.
2. Cambiare la lente dell'obiettivo in una lente 40x ad immersione dell'acqua (Tabella dei materiali) e immergere la lente in PBS per vedere l'embrione.
   1. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la morfologia neuronale contrassegnata da anti-HRP Cy3 e determinare il sito di iniezione.
   2. Durante l'iniezione, utilizzare la microscopia a campo luminoso per vedere la goccia coloranti. Quando l'embrione è a fuoco, modificare la posizione della micropipetta per un contatto delicato con la punta dell'assone di interesse (ad esempio, aCC, RP3).
   3. Eliminare il colorante in un emi-segmento addominale destro (A2-A6) alla giunzione neuromuscolare di aCC o RP3 (Figura 3) con DiD o DiO, utilizzando i neuroni contrassegnati da anti-HRP Cy3. Utilizzo del controllo mano (mouse; Figura 2, 5) rilasciare il tintura e rimuovere la micropipetta dopo aver lasciato il tinrito con il micromanipolatore e passare al sito di iniezione successiva.
      NOTA: A differenza di altri coloranti (ad esempio, giallo Lucifero, calceina) che si diffondono nelle cellule vicine attraverso giunzioni gap, coloranti lipofilici si associano alle membrane cellulari e non si trasferiscono ai vicini. A causa delle dimensioni relativamente grandi della goccia di colore, tuttavia, questa tecnica si traduce anche nell'etichettatura dei muscoli di partnership (Figura 3A).
3. Incubare il campione a RT per 1 h dopo la caduta di coloranti prima dell'imaging.
   NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui prima del montaggio e il campione può essere conservato a 4 gradi durante la notte. I coloranti lipofili possono anche essere consegnati utilizzando la iontoforesi, se un amplificatore intracellulare accoppiato a filo diretto (DC) è prontamente disponibile²⁰.

7. Imaging con microscopio confocale

1. Rimuovere il nastro a due lati e il nastro in vinile dallo scivolo di vetro con l'aiuto di pinze.
2. Preparare un coperchio di copertura (22 x 22 mm² No.1 bicchiere di copertura) con una piccola quantità di grasso sottovuoto (Tavolo dei materiali) ai quattro angoli e posizionare con cura sul campione, evitando bolle d'aria. Rimuovere l'eventualissile PBS in eccesso utilizzando i tergicristalli.
3. Premere verso il basso lo slittamento di copertura per regolare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il campione. Sigillare completamente i bordi dello slittamento di copertura con smalto.
4. Immagine all'ingrandimento 10x e 100x utilizzando un microscopio confocale.
5. Utilizzare il software ImageJ per l'elaborazione di immagini raw dal microscopio (Tabella dei materiali).
   NOTA: l'osservazione deve iniziare entro 10 min dopo il montaggio per le immagini migliori. In caso contrario, a RT, il tinrisi si diffonderà ai siti adiacenti al sito di iniezione creando uno sfondo indesiderato per l'imaging. Per rallentare la diffusione del tinri, il campione può essere conservato a 4 gradi centigradi per un paio d'ore.

Risultati

Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni aCC e RP3 è mostrata nella Figura 3C per dimostrare l'etichettatura multicolore dei motoneuroni a 15 h AEL. Le loro morfologie dendritiche sono in gran parte invariabili tra gli embrioni. Il modello di colorazione ottenuto con anticorpo anti-HRP è mostrato in grigio. Una piccola goccia di DiO o DiD è stata depositata sull'NMJ del muscolo 1 o 6/7, rispettivamente. La figura 4 dimostra la capacità di...

Discussione

L'uso dell'etichettatura dei coloranti per studiare la morfologia neuronale ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche di etichettatura delle cellule genetiche. La tecnica di etichettatura dei colori può ridurre al minimo il tempo necessario per etichettare e immaginare le morfologie dei motoneuroni. Il processo di etichettatura del colore è abbastanza veloce in quanto ci vuole meno di 2 h e ci permette di definire il contorno delle proiezioni neuronali. In alternativa, si può visualizzare il neurone motore aCC scegli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)