מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

Melissa Ana Inal; Kota Banzai; Daichi Kamiyama

doi:10.3791/60716

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

Abstract

אנו מתארים טכניקה לנסיגה של הנוירונים מוטוריים בדרוסופילה. אנו משתמשים בדיו מומס שמן ולספק droplet קטן להכנת פילה עובריים על ידי מיקרומזרק. כל תא העצב מנוע שהקרום שלו נוצר על ידי ה-droplet יכול להיות מתויג במהירות. מנוע נוירונים בודדים מתויג ברציפות, המאפשר פרטים מבניים עדינים להיות דמיינו בבירור. בהינתן כי הצבעים ליפופילית מגיעים בצבעים שונים, הטכניקה מספקת גם אמצעי לקבל הנוירונים סמוכים המסומנים בצבע רב. טכניקת העקיבה הזאת שימושית לצורך לימוד מורפולגנזה וקישוריות סינפטית במערכת העצב המוטורית של דרוזוהילה.

Introduction

מערכת העצב המוטורית העובריים של דרוסופילה מציעה מודל ניסיוני רב-עוצמה כדי לנתח את המנגנונים שבבסיס הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית (cn)¹^,²^,³. מערכת העצב המוטורית היא קלה לטכניקות ביוכימיות, גנטיות, דימות ואלקטרופיזיולוגיה. באמצעות טכניקות, מניפולציות גנטיות וניתוחים פונקציונליים ניתן לבצע ברמת הנוירונים מנוע יחיד²^,⁴^,⁵^,⁶.

במהלך ההתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים, הפער המפורז ויצירת מספר רב של גליה ונוירונים. מערכת היחסים הטמפורלית בין הדלאמנציה לבין ביטוי הגנים פרופיל של neuroblasts נחקרו בעבר בפירוט⁷^,⁸^,⁹. במקרה של מערכת תא העצב מנוע, היווצרות של הצומת העצבי העובריים (NMJ) נחקרו בהרחבה באמצעות aCC (תא בפינה הקדמית), RP2 (סרטנים גולמיים 2), ו RP5 מוטוריים נוירונים²^,¹⁰. למשל, כאשר תא העצב המוטורי RP5 מהווה צומת סינפטיות המתהווה, הפרה-סינפטית ופוסט-סינפטית התערבבו בין¹¹^,¹²^,¹³. תקשורת סלולרית ישירה כזו חיונית ליזום את היווצרות NMJ. בניגוד למה שאנחנו יודעים על הענפים העצביים ההיקפית, הידע שלנו איך הדנדריטים מוטוריים ליזום קישוריות סינפטית בתוך ה-CN הוא עדיין פרימיטיבי.

בדו ח זה, אנו מציגים טכניקה המאפשרת התיוג נסיגה של נוירונים מוטוריים העוברים באמצעות מיקרופיפטה-תיווך משלוח של צבעי ליפוליים. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר 38 הנוירונים מנוע innervating כל אחד 30 שרירי הקיר הגוף בפלח חמי ב 15 h לאחר הנחת ביצה (ח. א.)¹⁴. על-ידי שימוש בטכניקה זו, הקבוצה שלנו חקרה ביסודיות מספר רב של כולל של הפונקציה/אובדן של התפקוד הכולל,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. לאחרונה יש לנו את המנגנונים המולקולריים כי הכונן ייזום של קישוריות מוטורית של דנדריטים והפגינו כי Dscam1-Dock-פאק האינטראקציה מגדירה את האתר של דנדריטים מוצלח בתוך תא מנוע aCC¹⁷. באופן כללי, טכניקה זו היא להתאמה לניתוח פנוטיפ של כל הנוירונים מוטוריים מתחלקים בסוג פראי או זנים מוטציה, שיפור היכולת שלנו לספק תובנות חדשות לתוך העיצוב הפונקציונלי של מערכת העצבים Drosophila ילה .

Protocol

1. ציוד ואספקה

חומרים לאיסוף עוברים והכשרת מבוגרים להטיל ביצים
1. הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק שפופרת 50 mL וחיתוך לפתוח חור כובע כדי להגדיר מסנן רשת שינוי עם נקבוביות של 100 יקרומטר (טבלת חומרים) בין הצינור לבין הכובע.
  הערה: לחלופין, משתמשים בתאים עם נקבוביות של 100 יקרומטר (טבלת חומרים) יכולים לשמש לשלב הסינון של אוסף העובר.
2. הפוך את הצלחות אגר עם ענבים אגרמראש (לוח חומרים) לפי ההוראות המפורטות. בקצרה, מערבבים בעדינות חבילה אחת של תערובת אבקת לתוך 500 mL של טמפרטורת החדר (RT, 23 ° c) dH₂O ו מיקרוגל את התערובת מומס לרתיחה נמרץ. לאחר הצינון עד 70 מעלות צלזיוס, יוצקים את התערובת לתוך מנות פטרי (60 מ"מ). לאחר אגר מתחזק, לאחסן צלחות ב 4 ° c.
3. הכינו משחה שמרים על ידי ערבוב שמרים יבשים פעילים (לוח חומרים) ומים כדי עקביות הדבקה, ולשמור ב 4 ° c.
4. השתמש בכלובים לאיסוף ביצים (עבור צלחת פטרי 60 מ"מ, לוח חומרים) המספקים זרימת אוויר מספקת.
הכנת מחטי חיתוך ומיקרופיפטות להזרקת צבע
1. הכנת מיקרופיפטה הזרקת צבע והמחט לחיתוך מצינור נימי אותו עם קוטר פנימי של 0.6 מ"מ וקוטר חיצוני של 1.2 מ"מ (טבלת חומרים). משוך את אבובים נימי ידי פולר מיקרופיפטה ב 7% מ 170 V התפוקה המקסימלית (טבלת חומרים) כדי ליצור מחט חדה עם להתחדד של ~ 0.4 ס מ אורך.
2. להזרקת צבע, התאימו את המיקרופיפטה עם מיקרופיפטה בובליר (טבלת חומרים) בטכניקת מסתובב בועה המתוארת במדריך לכלי.
  1. בקיצור, להשרות את המטחנה עם סוכן הרטבה (טבלת חומרים) כדי למנוע את המים מתוך "גרירת" קצה המחט. הניחו את המחט על מהדק המיקרו-פיפטה ב -25 לחצי והורידו את הקצה לשני שלישים מרדיוס היציאה ממרכז המשטח הפנימי. לטחון את המחט בעוד מזרק עם אבובים דוחף אוויר לתוך המחט, כדי להבטיח כי המיקרופיפטה יהיה ברור של שבבי זכוכית.
  2. סמן את המיקרו-פיפטה עם סמן קבוע של עצה קבועה כדי לציין את מיקום הפתיחה בטיפ לאחר שיפוע כפי שהוא מאתגר לאתר את הפתיחה הצר של המיקרופיפטה שנוצר בזווית.

2. הכנה לקולקציית העובר

ודא שהמבוגרים מעופפים (20-40 לאחד מהקנטון או הלבן זבובים), זכרים ונקבות, מתוחזקים בגיל צעיר (< 7 ימים) ותנאים בריאים לאוסף הביצים האידיאלי.
הערה: כדי לעודד הנחת ביצים, זבובים מאומנים בכלוב אוסף הביציות שלהם כמה ימים לפני איסוף ביצים על צלחות אגר מושחז עם שמרים להדביק לפחות פעם אחת בכל יום.

3. העובר הזמני

לאפשר זבובים להטיל ביצים בלילה (או לפחות 15 h) ב RT כדי לאסוף את העוברים ב 15 h ח, כלומר, שלב 16¹⁸, כדי להציג את הדנדטוגנזה של ACC ו RP3 מוטוריים נוירונים. בבוקר, אספו את הצלחת. עם הביצים
הערה: העוברים ב-15 למטה יהיו בעלי בטן בעלת4 מונים. עבור הדמיה בשלבים שונים בעקבות קריטריונים מורפולוגיים ספציפיים שלהם תנאי ההזדקנות.
כדי לאסוף את העוברים, הביצים הניח על הצלחת עם 50% אקונומיקה עבור 5 דקות.
לאחר הורמונים נוקו, יוצקים את התוכן של הצלחת דרך מכשיר סינון או מסננת תאים כדי לבודד את העוברים. באמצעות בקבוק מים לסחוט, לדלל את האקונומיקה שמאל על הצלחת ולאסוף כמו עוברים רבים ככל האפשר על ידי בקבוקי את התערובת לתוך המסנן.
שטפו את העוברים על הפילטר 3-4x עם מים נוספים או עד שהריח האקונומיקה מתמוסס. הסירו את הפילטר מהמנגנון ושטפו את העוברים על צלחת נקייה אחרת עם מים. הללו את המים מהצלחת הלוח החדש שהעוברים מעליהם.
הכינו שקופית זכוכית על-ידי כיסוי הנייר עם שתי שכבות של קלטת ויניל במרכז, ויצרו מלבן. חותכים בריכה מלבנית מתוך הקלטת באמצעות להב תער. הניחו רצועה דקה של קלטת דו צדדית לכיוון הקצה העליון של הבריכה, שם ימוקמו העוברים כמוצג באיור 1.
בעזרת מלקחיים עדינים, בוחרים באופן אינדיבידואלי 5-10 עוברים ב -15 ומניחים אותם על הקלטת הדו כאשר הצד השני פונה כלפי מעלה. מוסיפים את מתמיסת המלח של החרק¹⁹ לבריכת החיתוך כדי להגן על העוברים מפני ייבוש (איור 1).

4. חיתוך וצביעת

שימוש במחט זכוכית מתחת למיקרוסקופ מבתר (שולחן חומרים), חותכים דרך קו האמצע של עובר אחד על פני השטח שלו מאחורי שלו לקצה הקדמי. ואז לגרור את העובר החוצה קרום vitelline מן הקלטת על הזכוכית (בקופסה באיור 1). לדאוג לא לפגוע ברקמות הפנים של העובר.
הפוך את רקמות האפיתל מהמרכז ולצרף את הקצה באפידרמיס על פני השטח של שקופית זכוכית (איור 1, שיבוץ).
באמצעות המחט מחובר צינור עם הפתיחה טיפ של ~ 300 יקרומטר (מוכן על ידי שבירת קצה דק של מחט לנתיחה), מחית או לנשוף אוויר כדי לנתק ולהסיר את הצינור האורך האורכי של הקנה האחרון, כמו גם כל המעיים שנותרו.
השתמש ב-4% פאראפורמלדהיד (למעלה) בתמיסת מלח (PBS) כדי לתקן את העוברים עבור 5 דקות ב-RT. שטוף את העוברים 3x עם PBS.
כתם את העוברים עם 1 μL של אנטי מחזרת נוגדן peroxidase מצועם עם cyanine 3 צבע (anti-HRP Cy3) (טבלת חומרים) ב 200 μl של pbs עבור 1 h. לשטוף את העוברים עם PBS 3x לאחר כתמי.
הערה: הצבע של anti-HRP ניתן לשנות בהתבסס על הצבעים ליפופילית של בחירה להזרקה.

5. מילוי הזרקת מיקרו-פיפטה

צבע ליפופילית חום (5 מ"ג/mL של דיו או עשה, טבלת חומרים) עד 60 ° c בתערובת 1:10 של אתנול: שמן צמחי לפני השימוש.
הכינו שקופית צבע מומס שמן עבור מיקרופיפטה ההזרקה. הניחו את המיקרופיפטה לתוך מחזיק הקפילר (איור 2, #1). באמצעות המיקרומניפולציה (טבלת חומרים), כוונן את המיקרו-פיפטה כדי להיות מעבר לשקופית הצבע. לאחר מכן, התאימו את השלב למיקום המיקרו-פיפטה על הצבע (איור 2, #2).
כדי למלא את המיקרופיפטה, השתמשו במיקרו-מזרק (שולחן החומרים) (איור 2, #3). לאסוף את הצבע במיקרופיפטה על ידי הגדרת P_i (הזרקת הלחץ) בין 200 ל-500 hpa (ההקטו), T_i (זמן הזרקה) בין 0.1 לערך 0.5 ו-P_c (הלחץ פיצוי) כדי 0 Hpa עבור 5 דקות (איור 2, #4).
לאחר הצבע נאסף, להסיר את שקופית הצבע ולמקם את המדגם על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדילו את ה-P_c לטווח של 20 עד 60 hpa לפני הנמכת המיקרופיפטה למדגם, כדי למנוע זיהום של PBS בפעולה קפילר.

6. הזרקת צבע לנוירונים

אתר את העובר במרכז באמצעות המיקרוסקופ עם עדשת המטרה 10x (טבלת חומרים) וליישר את המיקרופיפטה עם העובר.
הערה: ניתן לכוונן את גודל ה-droplet של הצבע על-ידי_שינוי ה-P i או גודל הפתיחה של העצה המיקרופיפטה. ה-droplet צריך להיות 10-20 μm, שהוא בערך ברוחב של שריר אחד.
לשנות את העדשה האובייקטיבית לעדשה 40x טבילה המים (טבלה של חומרים) ולהטביע את העדשה לתוך PBS כדי לראות את העובר.
1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לבדוק את המבנה העצבי מסומן על ידי anti-HRP Cy3 ולקבוע את אתר ההזרקה.
2. במהלך ההזרקה, השתמשו במיקרוסקופיה ברייטפילד כדי לראות את droplet הצבע. כאשר העובר הוא בפוקוס, לשנות את המיקום של המיקרופיפטה כדי ליצור קשר עדין עם קצה האקסון של עניין (למשל, aCC, RP3).
3. הנח את הצבע בבטן הימנית (A2-A6) המי-קטע בצומת העצבי של aCC או RP3 (איור 3) עם או או דיו, באמצעות הנוירונים המסומנים על ידי ANTI-Hrp Cy3. שימוש בבקרת היד (עכבר; איור 2, 5) לשחרר את הצבע ולהסיר את המיקרופיפטה לאחר שחרור הצבע עם המיקרומניפולציה ולעבור אל אתר ההזרקה הבא.
  הערה: שלא כמו צבעים אחרים (למשל, לוציפר צהוב, calcein) אשר התפשט לתוך התאים הסמוכים באמצעות צמתים הפער, צבע ליפופילית שותף ממברנות תאים לא להעביר לשכנים. בגלל הגודל הגדול יחסית של droplet לצבוע, עם זאת, טכניקה זו גם גורמת לתיוג של שרירי השותפות (איור 3א).
מודטה את המדגם ב RT עבור 1 h לאחר לצבוע טיפה לפני הדמיה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לפני ההרכבה, וניתן לשמור את המדגם ב-4 ° c בלילה. צבעי ליפוהיפילית יכול גם להיות מועברת באמצעות iontophoresis אם בשילוב ישיר (DC) מגבר זמין בקלות²⁰.

7. הדמיה עם מיקרוסקופ קונמוקד

הסר את הקלטת דו צדדית וקלטת ויניל מתוך שקופית זכוכית בעזרת מלקחיים.
הכן שובר כיסוי (22 x 22 מ"מ² מס ' 1 זכוכית מכסה) עם כמות קטנה של שומן ואקום (טבלת חומרים) בארבע פינות ובמקום בזהירות על המדגם, הימנעות בועות אוויר. הסר את כל הPBS העודפת באמצעות מנקי משימות.
דחוף את המכסה למטה כדי לכוונן את מרחק העבודה בין העדשה האובייקטיבית לבין המדגם. אטום לחלוטין את קצות שובר הכיסוי עם לק.
תמונה בהגדלה של 10x ו-100x בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד.
השתמש בתוכנת ImageJ לעיבוד תמונות גולמיים מהמיקרוסקופ (טבלת חומרים).
הערה: ההשגחה חייבת להתחיל בתוך 10 דקות לאחר ההרכבה על התמונות הטובות ביותר. אחרת, ב-RT, הצבע יתפשט לאתרים הסמוכים לאתר ההזרקה ויוצרים רקע לא רצוי לדימות. כדי להאט את הפצת הצבע, ניתן לאחסן את המדגם ב-4 ° c למשך מספר שעות.

תוצאות

דמות מייצגת של הנוירונים aCC ו RP3 מוטוריים מוצג באיור 3C כדי להדגים את התיוג ריבוי צבעים של נוירונים מוטוריים ב 15 h. מורפולוגיות דנדריטים שלהם הם קבוע במידה רבה בין העוברים. דפוס הצביעת המתקבל עם נוגדן anti-HRP מוצג באפור. Droplet קטן של DiO או עשה הופקד על NMJ של שריר 1 או 6/7, בהתא?...

Discussion

השימוש בתיוג צבע ללימוד מורפולוגיה עצבית יש מספר יתרונות על טכניקות גנטיות של תיוג תאים. הטכניקה תיוג צבע יכול למזער את כמות הזמן הדרוש לתיוג והדמיה של מורפולוגיות של נוירונים מוטוריים. תהליך תיוג הצבע הוא מהיר למדי כפי שלוקח פחות מ 2 h ומאפשר לנו להגדיר את המתאר של התחזיות הנוירואליות. כחל...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת קמיאיאמה על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R01 NS107558 (למ, K.B. ו-D.K.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)

References

Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
. Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: