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요약

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

초록

우리는 Drosophila에있는 모터 신경의 역행 표지를 위한 기술을 기술합니다. 우리는 오일 용해 된 친유성 염료를 사용하고 마이크로 인젝터에 의해 배아 필렛 제제에 작은 물방울을 전달합니다. 그 막이 물방울에 의해 접촉되는 각 모터 신경은 그 때 급속하게 표지될 수 있습니다. 개별 운동 뉴런은 지속적으로 라벨을 부착하여 미세한 구조적 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 친유성 염료가 다양한 색상으로 제공된다는 점을 감안할 때, 이 기술은 또한 인접한 뉴런을 여러 가지 색으로 표시할 수 있는 수단을 제공한다. 이 추적 기술은 따라서 Drosophila의모터 뉴런 시스템에서 신경 형태 형성 및 시냅스 연결을 연구하는 데 유용합니다.

서문

Drosophila의 배아 운동 뉴런 시스템은 중추 신경계 (CNS)1,2,3의발달의 기초가되는 메커니즘을 분석하는 강력한 실험 모델을 제공합니다. 모터 뉴런 시스템은 생화학적, 유전적, 이미징 및 전기 생리학적 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 유전 적 조작 및 기능 분석은 단일 운동 뉴런2,4,5,6의수준에서 수행 될 수있다.

신경계의 초기 발달 도중, neuroblasts는 분할하고 glia와 신경의 다수를 생성합니다. 신경아세포의 배분과 유전자 발현 프로필 사이의 시공간적 관계는 이전에 상세히 조사되어왔다 7,8,9. 운동 뉴런 시스템의 경우, 배아 신경근육 접합부(NMJ)의 형성은 aCC(전방 코너 셀), RP2(원시 새우 2), 및 RP5 운동 뉴런2,10을사용하여 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, RP5 운동 뉴런이 초기 시냅스 접합을 형성할 때, 시냅스 전 및 시냅스 후 필로포디아는11,12,13을혼합한다. 이러한 직접적인 세포 통신은 NMJ 형성을 시작하는 데 필수적이다. 우리가 말초 신경 지점에 관하여 알고 있는 것과는 반대로, 어떻게 모터 수상돌이 CNS 내의 시냅스 연결을 개시하는지의 우리의 지식은 아직도 원시적입니다.

이 보고에서는, 우리는 친유성 염료의 micropipette 중재한 납품을 통해 태아에 있는 모터 신경의 역행 표지를 허용하는 기술을 제시합니다. 이 기술은 우리가 계란 누워 후 15 시간 (AEL)14에서헤미 세그먼트에 30 신체 벽 근육의 각각을 내음 38 모터 뉴런을 추적 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 철저하게 수많은 기능 의 이득 / 기능 상실 - 기능 의 상실 을 조사했다15,16,17. 우리는 최근에 모터 모수석 연결의 개시를 구동하는 분자 메커니즘을 해명하고 Dscam1-Dock-Pak 상호 작용이 aCC 모터뉴런(17)에서모수석 의 자성장 부위를 정의한다는 것을 입증했다. 일반적으로, 이 기술은 야생 형 또는 돌연변이 균주에 있는 어떤 배아 운동 뉴런든지의 표현형 분석에 적응할 수 있습니다, Drosophila 신경계의 기능적인 디자인에 새로운 통찰력을 제공하는 우리의 기능을 강화하.

프로토콜

1. 장비 및 소모품

  1. 배아 를 수집하고 알을 낳기 위해 성인을 훈련하기위한 자료
    1. 튜브와 캡 사이에 100μm(재료표)의기공이 있는 메쉬 필터를 설정하도록 캡에 구멍을 열어 50 mL 튜브를 절단하여 여과 장치를 준비한다.
      참고: 또는, 100 μm(재료표)의기공을 가진 세포 스트레이너는 배아 수집의 여과 단계에 사용될 수 있다.
    2. 나열된 지침에 따라 포도 한천 프리 믹스(재료 표)로한천 접시를 만듭니다. 간단히, 분말 혼합물 1 패킷을 실온(RT, 23°C)dH2O의 500 mL로 부드럽게 저어주고 용해된 혼합물을 전자레인지에 넣고 힘차게 끓입니다. 70-75 °C로 냉각 한 후, 페트리 접시 (60mm)에 혼합물을 부어. 한천이 고화된 후 플레이트를 4°C로 저장합니다.
    3. 활성 건식 효모(재료표)와물을 페이스트 일관성에 혼합하여 효모 페이스트를 준비하고 4 °C에서 유지합니다.
    4. 충분한 공기 흐름을 제공하는 계란 수집 케이지 (60mm 페트리 접시, 재료 표)를사용합니다.
  2. 해부 바늘 및 염료 주입 마이크로 파이펫의 준비
    1. 내경 0.6 mm와 외경 1.2 mm(재료 표)와같은 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로 파이펫 및 해부 바늘을 준비합니다. 170V 최대 출력(재료 표)에서7 %의 마이크로 파이펫 풀러로 모세관 튜브를 당겨 길이 ~ 0.4cm의 테이퍼로 날카로운 바늘을 만듭니다.
    2. 염료 주입의 경우, 기기 매뉴얼에 설명된 기포 베벨링 기술로 마이크로파이펫 베벨러(재료표)로마이크로파이펫을 조정합니다.
      1. 즉, 바늘 끝을 '끌기'에서 물을 방지하기 위해 젖은 제(재료의 표)로분쇄기를 담급니다. 마이크로파이펫 클램프에 바늘을 25-30°로 놓고 경외도의 3분의 2로 기울어진 표면의 중심에서 팁을 낮춥습니다. 튜빙이 있는 주사기가 바늘에 공기를 밀어 넣는 동안 바늘을 갈아서 마이크로파이펫이 유리 면도를 제거하도록 합니다.
      2. 마이크로파이펫을 미세팁 영구 마커로 표시하여 비스듬히 형성되는 마이크로파이펫의 좁은 개구부를 찾기가 어렵기 때문에 경구 후 팁에서 개구부위치를 나타낸다.

2. 배아 수집 준비

  1. 성인 파리 (20-40 야생 형 캔톤-S 또는 흰 파리), 수컷과 암컷이 어린 (&7 일)에서 유지되고 이상적인 계란 수집을위한 건강한 조건이 유지되도록하십시오.
    참고 : 계란 누워를 자극하기 위해, 파리는 적어도 매일 한 번 효모 페이스트 줄무늬 한천 접시에 계란 수집 전에 며칠 자신의 계란 수집 케이지에서 훈련된다.

3. 배아 스테이징

  1. 파리가 RT에서 하룻밤 동안 알을 낳을 수 있도록 (또는 적어도 15 시간) 15 시간 AEL에서 배아를 수집, 즉, 단계 1618,aCC 및 RP3 운동 뉴런의 dendritogenesis를 볼 수 있습니다. 아침에, 계란과 접시를 수집합니다.
    참고 : 15 시간 AEL의 배아는 뚜렷한 4 챔버 창자18을갖습니다. 화상 진찰을 위해 다른 단계는 그들의 특정 형태학 기준 및 노화 조건을 따릅니다.
  2. 배아를 수집하기 위해 접시에 놓인 계란을 50 % 표백제5 분 동안 dechorionate.
  3. chorions가 삭제되면, 배아를 격리하기 위하여 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 판의 내용을 부어. 물 짜기 병을 사용하여 접시에 남아있는 표백제를 희석하고 혼합물을 필터에 디캔팅하여 가능한 한 많은 배아를 수집합니다.
  4. 배아를 필터3-4x로 더 많은 물로 씻거나 표백제 냄새가 사라질 때까지 씻으소서. 장치에서 필터를 제거하고 배아를 물로 다른 깨끗한 접시에 씻으소서. 배아가 있는 새 접시에서 물을 데미트합니다.
  5. 사각형을 형성, 중앙에 비닐 테이프의 두 층으로 덮여 유리 슬라이드를 준비합니다. 면도날을 사용하여 테이프에서 직사각형 풀을 잘라냅니다. 풀의 위쪽 끝쪽으로 양면 테이프의 얇은 스트립을 배치하면 그림 1과같이 배아가 배치됩니다.
  6. 미세 한 집게를 사용하여 15 시간 AEL에서 5-10 배아를 개별적으로 선택하고 등쪽쪽이 위를 향하도록 양면 테이프에 놓습니다. 탈수로부터 배아를 보호하기 위해 해부 풀에 곤충 링거의 식염수19를 추가합니다(그림1).

4. 해부 및 염색

  1. 해부 현미경(재료의 표)에서유리 바늘을 사용하여, 그것의 뒤쪽끝에서 그것의 전방 끝에 그것의 표면에 있는 단 하나 태아의 중간선을 통해 잘라냅니다. 그런 다음 배아를 테이프에서 비텔린 막에서 유리로 드래그합니다(그림 1에있는 상자). 배아의 내부 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오.
  2. 중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드의 표면에 부착합니다(그림 1, 인세트).
  3. ~300 μm의 팁 개구부와 튜브 연결 바늘을 사용하여 (해부 바늘의 얇은 끝을 파괴하여 제조), 흡인 또는 불어 공기를 분리하고 등쪽 세로 기관 줄기뿐만 아니라 나머지 용기를 제거합니다.
  4. 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 RT에서 5 분 동안 배아를 고정하십시오.
  5. 1 μL의 항고추냉이 과산화항체로 배아를 염색하여 시안 3염료(anti-HRP Cy3)(재료표)로공액을 1시간 동안 PBS의 200 μL에 결합하였다.
    참고 : 안티 HRP의 염료는 주입을위한 선택의 친유성 염료에 따라 변경할 수 있습니다.

5. 주입 마이크로 파이펫의 충전

  1. 사용 전에 에탄올: 식물성 기름을 1:10 혼합하여 친유성 염료(DiO 또는 DiD, 재료 표5 mg/mL)를 60°C로 가열합니다.
  2. 주입 마이크로 파이펫오일 용해 염료 슬라이드를 준비합니다. 마이크로파이펫을 모세관 홀더에 넣습니다(그림2, #1). 마이크로 조작기(재료표)를사용하여 미세 파이펫을 염료 슬라이드 위에 조정합니다. 그런 다음, 마이크로파이펫을 염료 위에 놓도록 스테이지를 조정한다(도2,#2).
  3. 마이크로파이펫을 채우려면 마이크로인젝터(재료표)를사용하십시오(그림2,#3). 200-500 hPa(hectopascal) 사이Pi(주입 압력)를 설정하여 마이크로파이펫에서 염료를 수집하고, Ti(주사 시간)를 0.1-0.5 s와 Pc(보상 압력)에서 5분 동안 0hPa로 설정하였다(도2,#4).
  4. 염료가 수집되면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 단계에 놓습니다. 다음으로, Pc를 20-60 hPa 범위로 늘린 후 시료로 마이크로파이펫을 낮추어 모세관 작용에 의한 PBS의 오염을 방지합니다.

6. 뉴런에 염료 주입

  1. 10x 대물렌즈(물자 표)로현미경을 사용하여 중앙에 배아를 찾아 배아와 미세피펫을 정렬합니다.
    참고: 염료 방울의 크기는 Pi 또는 마이크로파이펫 팁의 개구부를 변경하여 조정할 수 있습니다. 물방울은 10-20 μm이어야하며, 이는 대략 1 근육의 폭입니다.
  2. 대물 렌즈를 수중 침지 40x렌즈(재료 표)로변경하고 렌즈를 PBS에 담그어 배아를 확인합니다.
    1. 형광 현미경 검사법을 사용하여 항 HRP Cy3로 표시된 신경 형태를 확인하고 주사 부위를 결정합니다.
    2. 주사 중에 밝은 시야 현미경을 사용하여 염료 방울을 확인하십시오. 배아가 초점이 되면, 관심 있는 축의 끝(예를 들어, aCC, RP3)과 부드럽게 접촉하도록 마이크로파이펫의 위치를 변경한다.
    3. ACC 또는 RP3의 신경 근육 접합부에서 오른쪽 복부(A2−A6) 헤미세그먼트에 염료를 떨어뜨리고, 반대로 HRP Cy3로 표시된 뉴런을 사용하여 DiD 또는 DiO를 사용한다. 핸드 컨트롤(마우스; 도 2,5) 염료를 방출하고 마이크로조작기로 염료를 떨어뜨린 후 마이크로파이펫을 제거하고 다음 주사 부위로 이동한다.
      참고 : 틈부 접합을 통해 이웃 세포로 퍼지는 다른 염료 (예 : 루시퍼 옐로우, 칼세인)와 는 달리, 친유성 염료는 세포막과 연관되고 이웃으로 전달되지 않습니다. 그러나 염료 방울의 크기가 비교적 크기 때문에 이 기술은 또한 파트너 근육의 라벨링을 초래합니다(그림3A).
  3. 이미징 전에 염료 를 떨어 뜨린 후 1 시간 동안 RT에서 샘플을 배양하십시오.
    참고: 프로토콜을 장착하기 전에 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플을 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다. 친유성 염료는 또한 세포내 직접 결합(DC) 증폭기가 쉽게 이용 가능한 경우이온토포레시스(20)를사용하여 전달될 수 있다.

7. 공초점 현미경으로 화상 진찰

  1. 집게의 도움으로 유리 슬라이드에서 양면 테이프와 비닐 테이프를 제거합니다.
  2. 4개의 모서리에 소량의 진공그리스(재료 표)로커버 슬립(22 x 22mm2 No.1 커버 글래스)을 준비하고 기포를 피하면서 시료에 조심스럽게 놓습니다. 작업 와이퍼를 사용하여 과도한 PBS를 제거합니다.
  3. 커버 슬립을 아래로 밀어 대물 렌즈와 샘플 사이의 작업 거리를 조정합니다. 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 완전히 밀봉합니다.
  4. 공초점 현미경을 사용하여 10x 및 100x 배율로 이미지화.
  5. 현미경(재료 표)에서원시 이미지를 처리하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다.
    참고: 최상의 이미지를 위해 장착한 후 10분 이내에 관찰이 시작되어야 합니다. 그렇지 않으면 RT에서 염료는 주사 부위에 인접한 부위로 확산되어 이미징을 위한 원치 않는 배경을 만듭니다. 염료의 확산을 늦추기 위해, 샘플은 2 시간 동안 4 °C에서 저장될 수 있다.

결과

aCC 및 RP3 운동 뉴런의 대표적인 이미지는 15시간 AEL에서 운동 뉴런의 다색 라벨링을 입증하기 위해 도 3C에 도시되어 있다. 그들의 수지상 형태는 배아 사이에 크게 불변성입니다. 항-HRP 항체로 수득된 염색 패턴은 회색으로 나타내었다. DiO 또는 DiD의 작은 물방울은 각각 근육 1 또는 6/7의 NMJ에 증착되었다. 도 4는 관심 표현형을 정량적으로 ?...

토론

신경 형태학을 공부하기위한 염료 라벨링의 사용은 유전 세포 라벨링 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 라벨링 기술은 운동 뉴런의 형태에 라벨링 및 이미징에 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 염료 라벨링 과정은 2 시간 미만이 걸리고 뉴런 돌기의 윤곽을 정의 할 수 있기 때문에 매우 빠릅니다. 대안으로, aCC에서 효모 GAL4 전사 인자를 발현하는 GAL4 라인을 선택하고, 상류 활성화 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

원고에 대한 의견에 대해 가미야마 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 NS107558(M.I., K.B., D.K.)에 의해 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10x objective lensNikonPlan
40x water-immersion lensNikonNIR Apo
Capillary tubingFrederick Haer&Co27-31-1
Confocal microscopeAndorN/ADragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glassCorning22x22 mm Square #1
DiDThermoFisherV22886
DiIThermoFisherV22888
DiOThermoFisherV22887
Dissecting microscopeNikonN/ASMZ-U
Double Sided TapeScotch665
Dow Corning High-Vacuum GreaseFisher Sci.14-635-5D
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20
Egg collection cageFlyStuff59-100
FemtoJet 5247EppendorfdiscontinuedFemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJNIHImage processing software
MicromanipulatorSutterMP-225
Micropipette bevelerSutterBV-10-B
Needle pullerNarishigePC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix PacketsFlyStuff47-102
Nylon Net FilterMillipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM gradeElectron Microscopy Sciences15710Any EM grades
PBSRoche11666789001Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200Kodak146 4510Wetting agent
Upright fluorescence microscopeNikonN/AEclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical TapeScotch6143
VWR Cell StrainersVWR10199-659
YeastFlyStuff62-103Active dry yeast (RED STAR)

참고문헌

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