Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik zur retrograden Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Drosophila. Wir verwenden einen ölaufgelösten lipophilen Farbstoff und liefern ein kleines Tröpfchen an ein embryonales Filetpräparat durch einen Mikroinjektor. Jedes Motorneuron, dessen Membran vom Tröpfchen kontaktiert wird, kann dann schnell beschriftet werden. Einzelne Motorneuronen werden kontinuierlich beschriftet, so dass feine Strukturdetails klar visualisiert werden können. Da lipophile Farbstoffe in verschiedenen Farben erhältlich sind, bietet die Technik auch ein Mittel, um benachbarte Neuronen in mehrfarbig beschriftet zu bekommen. Diese Tracing-Technik ist daher nützlich für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und synaptischen Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila.

Einleitung

Das embryonale motorische Neuronensystem von Drosophila bietet ein leistungsfähiges experimentelles Modell zur Analyse der Mechanismen, die der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS)^1,2,3zugrunde liegen. Das motorische Neuronensystem ist für biochemische, genetische, bildgebende und elektrophysiologische Techniken zugänglich. Mit den Techniken können genetische Manipulationen und funktionelle Analysen auf der Ebene der einzelnen motorischen Neuronen^2,4,5,6durchgeführt werden.

Während der frühen Entwicklung des Nervensystems, Neuroblasten teilen und erzeugen eine große Anzahl von Glia und Neuronen. Die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Delamination und dem Genexpressionsprofil von Neuroblasten wurde zuvor im Detail untersucht^7,8,9. Im Falle des motorischen Neuronsystems wurde die Bildung embryonaler neuromuskulärer Knoten (NMJ) mit dem aCC (vordere Eckzelle), RP2 (Rohgarnelen 2) und RP5 Motorneuronen^2,10ausgiebig untersucht. Wenn das RP5-Motorneuron beispielsweise eine entstehende synaptische Verbindung bildet, werden die präsynaptischen und postsynaptischen Filopodia^11,12,13vermischt. Eine solche direkte zelluläre Kommunikation ist entscheidend, um die NMJ-Bildung zu initiieren. Im Gegensatz zu dem, was wir über die peripheren Nervenzweige wissen, ist unser Wissen darüber, wie motorische Dendriten eine synaptische Konnektivität innerhalb des ZNS initiieren, immer noch primitiv.

In diesem Bericht stellen wir eine Technik vor, die eine retrograde Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Embryonen mittels mikropipettevermittelter Abgabe lipophiler Farbstoffe ermöglicht. Diese Technik ermöglicht es uns, die 38 motorischen Neuronen zu verfolgen, die jede der 30 Körperwandmuskeln in einem Hemi-Segment bei 15 h nach Dereiablage (AEL)¹⁴innervieren. Mit dieser Technik hat unsere Gruppe zahlreiche Funktionsverstärkungs-/Funktionsverlust-Allele^15,16,17gründlich untersucht. Wir haben vor kurzem die molekularen Mechanismen entwirrt, die die Initiierung der motorischen Dendritenkonnektivität vorantreiben, und gezeigt, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Interaktion den Ort des Dendritenauswachsens im aCC-Motorneuron¹⁷definiert. Im Allgemeinen ist diese Technik anpassungsfähig für die phänotypische Analyse von embryonalen motorischen Neuronen in wilden Typ- oder mutierten Stämmen, was unsere Fähigkeit verbessert, neue Einblicke in das funktionelle Design des Drosophila-Nervensystems zu geben.

Protokoll

1. Ausrüstung und Zubehör

1. Materialien für das Sammeln von Embryonen und die Ausbildung von Erwachsenen zum Eierlegen
   1. Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50 ml-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen, um einen Netzfilter mit Poren von 100 m (Materialtabelle) zwischen Rohr und Kappe zu setzen.
      HINWEIS: Alternativ können Zellsiebe mit Poren von 100 m (Materialtabelle) für den Filtrationsschritt der Embryoentnahme verwendet werden.
   2. Agarplatten mit Traubenagar-Premix (Materialtabelle) nach den aufgeführten Anweisungen zu machen. Kurz dazu 1 Packung des Pulvers in 500 ml Raumtemperatur (RT, 23 °C) dH₂O rühren und Mikrowelle das gelöste Gemisch zum kräftigen Kochen rühren. Nach dem Abkühlen auf 70 bis 75 °C die Mischung in Petrischalen (60 mm) gießen. Nachdem der Agar erstarrt ist, platten bei 4 °C lagern.
   3. Hefepaste vorbereiten, indem Sie aktive Trockenhefe (Materialtabelle) und Wasser zu einer Pastenkonsistenz mischen und bei 4 °C halten.
   4. Verwenden Sie Eiersammelkäfige (für 60 mm Petrischale, Tisch aus Materialien),die einen ausreichenden Luftstrom bieten.
2. Herstellung von Seziernadeln und Farbstoffinjektionsmikropipetten
   1. Bereiten Sie Farbstoff Injektion Mikropipette und Seziernadel aus der gleichen Kapillarschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm und einem Außendurchmesser von 1,2 mm(Materialtabelle). Ziehen Sie die Kapillarschläuche mit einem Mikropipette-Zieher bei 7% von 170 V maximaler Leistung (Materialtabelle), um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von 0,4 cm Länge zu erstellen.
   2. Für die Farbinjektion stellen Sie die Mikropipette mit einer Mikropipette-Beveler (Tabelle der Materialien) durch eine Blasenabschrägungstechnik, die im Handbuch des Instruments beschrieben wird, ein.
      1. Kurz gesagt, tränken Sie den Schleifer mit einem Benetzungsmittel (Materialtabelle), um zu verhindern, dass das Wasser die Nadelspitze "zerreißt". Legen Sie die Nadel auf die Mikropipette-Klemme bei 25-30° und senken Sie die Spitze auf zwei Drittel des Radius aus der Mitte der Abschrägungsfläche heraus. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schläuchen Luft in die Nadel drückt, um sicherzustellen, dass die Mikropipette frei von Glasspänen ist.
      2. Markieren Sie die Mikropipette mit einem feinspitzen permanenten Marker, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig ist, die schmale Öffnung der Mikropipette zu lokalisieren, die in einem Winkel gebildet wird.

2. Vorbereitung auf die Embryonenentnahme

1. Stellen Sie sicher, dass die erwachsenen Fliegen (20-40 Wild-Typ Canton-S oder weiße Fliegen), Männchen und Weibchen, in jungen (<7 Tage) und gesunden Bedingungen für die ideale Eiersammlung gehalten werden.
   HINWEIS: Um das Eierlegen zu stimulieren, werden fliegende fliegenin ihrem Eiersammelkäfig ein paar Tage vor der Eiersammlung auf Agarplatten trainiert, die mindestens einmal täglich mit Hefepaste übersät sind.

3. Embryo-Inszenierung

1. Lassen Sie die Fliegen eier über Nacht legen (oder mindestens 15 h) bei RT, um die Embryonen bei 15 h AEL, d.h. Stadium 16^18,zu sammeln, um die Dendritogenese der motorischen Neuronen aCC und RP3 zu sehen. Am Morgen, sammeln Sie den Teller mit den Eiern.
   HINWEIS: Die Embryonen bei 15 h AEL haben einen ausgeprägten 4-Kammer-Darm¹⁸. Für die Bildgebung folgen verschiedene Stadien ihren spezifischen morphologischen Kriterien und Alterungsbedingungen.
2. Um die Embryonen zu sammeln, dechorionate die Eier auf dem Teller mit 50% Bleichmittel für 5 min gelegt.
3. Sobald die Chorionen geklärt sind, gießen Sie den Inhalt der Platte durch das Filtrationsgerät oder Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren. Mit einer Squeeze-Flasche Wasser, verdünnen Sie die Bleichmittel auf dem Teller und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich, indem Sie die Mischung in den Filter dekantieren.
4. Waschen Sie die Embryonen auf dem Filter 3x 4x mit mehr Wasser oder bis der Bleichgeruch ableitet. Entfernen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie die Embryonen auf eine andere saubere Platte mit Wasser. Dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden.
5. Bereiten Sie eine Glasrutsche vor, indem Sie sie mit zwei Schichten Vinylband in der Mitte bedecken und ein Rechteck bilden. Schneiden Sie einen rechteckigen Pool mit einer Rasierklinge aus dem Band. Legen Sie einen dünnen Streifen doppelseitigen Band in Richtung des oberen Endes des Pools, dies ist, wo die Embryonen platziert werden, wie in Abbildung 1gezeigt.
6. Mit feinen Zangen wählen Sie einzeln 5-10 Embryonen bei 15 h AEL aus und legen Sie sie auf das doppelseitige Band mit der dorsalen Seite nach oben. Fügen Sie die Seinder ringer saline¹⁹ in den Sezierpool, um die Embryonen vor der Austrocknung zu schützen (Abbildung 1).

4. Zerlegung und Färbung

1. Mit einer Glasnadel unter einem Sezieren mikroskop (Tabelle der Materialien), schneiden Sie durch die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren bis seinem vorderen Ende. Ziehen Sie dann den Embryo aus der Vitelline-Membran aus dem Band auf das Glas (in Abbildung 1verpackt). Achten Sie darauf, das innere Gewebe des Embryos nicht zu beschädigen.
2. Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte und befestigen Sie die epidermale Kante an der Oberfläche des Glasschlittens(Abbildung 1, Einschub).
3. Mit einer röhrengebundenen Nadel mit einer Spitzenöffnung von 300 m (vorbereitet durch Brechen der dünnen Spitze einer Seziernadel), saugen oder blasen Sie Luft, um die dorsalen Längstrachestämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu lösen und zu entfernen.
4. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Saline (PBS), um die Embryonen für 5 min bei RT zu fixieren. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBS.
5. Färben Sie die Embryonen mit 1 l Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper, konjugiert mit Cyanin-3-Farbstoff (Anti-HRP Cy3)(Materialtabelle)in 200 l PBS für 1 h. Waschen Sie die Embryonen nach der Färbung mit PBS 3x.
   HINWEIS: Der Farbstoff von Anti-HRP kann basierend auf den lipophilen Farbstoffen der Wahl für die Injektion geändert werden.

5. Füllung der Injektions-Mikropipette

1. Lipophile Farbstoffe (5 mg/ml DiO oder DiD, Materialtabelle)in einer 1:10-Mischung aus Ethanol:Pflanzenöl vor Gebrauch auf 60 °C erhitzen.
2. Bereiten Sie einen ölgelösten Farbstoffschlitten für die Injektionsmikropipette vor. Legen Sie die Mikropipette in den Kapillarhalter(Abbildung 2, #1). Passen Sie mit dem Mikromanipulator (Materialtabelle) die Mikropipette so an, dass sie sich über dem Farbschlitten befindet. Passen Sie dann die Bühne an, um die Mikropipette auf den Farbstoff zu legen (Abbildung 2, #2).
3. Um die Mikropipette zu füllen, verwenden Sie einen Mikroinjektor (Materialtabelle) (Abbildung 2, #3). Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den P_i (Injektionsdruck) zwischen 200-500 hPa (Hektopascal), den T_i (Injektionszeit) zwischen 0,1 ,0,5 s und P_c (Kompensationsdruck) auf 0 hPa für 5 min(Abbildung 2, #4) einstellen.
4. Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbstoffschlitten und legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Als nächstes erhöhen Sie die P_c auf einen Bereich von 20 bis 60 hPa, bevor Sie die Mikropipette in die Probe senken, um eine Kontamination von PBS durch Kapillarwirkung zu verhindern.

6. Farbinjektion in Neuronen

1. Suchen Sie den Embryo in der Mitte mit dem Mikroskop mit 10x Objektivlinse (Materialtabelle) und richten Sie die Mikropipette mit dem Embryo aus.
   HINWEIS: Die Größe des Farbstofftröpfchens kann durch Ändern des P_i oder der Größe der Öffnung der Mikropipettespitze angepasst werden. Das Tröpfchen sollte 10 bis 20 m betragen, was ungefähr der Breite von 1 Muskel entspricht.
2. Ändern Sie die Objektivlinse in eine 40-fache Linse (Materialtabelle) und tauchen Sie die Linse in PBS ein, um den Embryo zu sehen.
   1. Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die neuronale Morphologie zu überprüfen, die durch Anti-HRP Cy3 gekennzeichnet ist, und bestimmen Sie die Injektionsstelle.
   2. Verwenden Sie während der Injektion die Hellfeldmikroskopie, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Wenn der Embryo im Fokus ist, ändern Sie die Position der Mikropipette, um sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse (z. B. aCC, RP3) zu machen.
   3. Lassen Sie den Farbstoff in einem rechten Bauch (A2-A6) Hämi-Segment an der neuromuskulären Kreuzung von aCC oder RP3 (Abbildung 3) mit entweder DiD oder DiO, durch die Verwendung der Neuronen durch Anti-HRP Cy3 markiert. Mit der Handsteuerung (Maus; Abbildung 2, 5) den Farbstoff loslassen und die Mikropipette entfernen, nachdem sie den Farbstoff mit dem Mikromanipulator fallen gelassen hat, und bewegen Sie sich auf die nächste Injektionsstelle.
      HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Farbstoffen (z. B. Luzifergelb, Kalkein), die sich durch Spaltknoten in benachbarte Zellen ausbreiten, assoziieren lipophile Farbstoffe mit Zellmembranen und übertragen sich nicht auf Nachbarn. Aufgrund der relativ großen Größe des Farbstofftröpfchens führt diese Technik jedoch auch zur Kennzeichnung der Partnermuskeln (Abbildung 3A).
3. Inkubieren Sie die Probe bei RT für 1 h nach Farbstoff-Tropfen vor der Bildgebung.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier vor der Montage angehalten werden, und die Probe kann über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden. Lipophile Farbstoffe können auch mit Iontophorese geliefert werden, wenn ein intrazellulärer direkt gekoppelter (DC) Verstärker leicht verfügbar ist²⁰.

7. Bildgebung mit konfokaler Mikroskop

1. Entfernen Sie das doppelseitige Klebeband und das Vinylband mit Hilfe von Zangen von der Glasrutsche.
2. Bereiten Sie einen Abdeckschlupf (22 x 22 mm² Nr.1 Deckglas) mit einer kleinen Menge Vakuumfett (Materialtabelle) an den vier Ecken vor und legen Sie ihn sorgfältig auf die Probe, um Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige PBS mit Task-Wischern.
3. Drücken Sie den Deckelbeleg nach unten, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und der Probe anzupassen. Die Ränder des Deckelschlupfs vollständig mit Nagellack versiegeln.
4. Bild bei 10- und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop.
5. Verwenden Sie ImageJ-Software für die Verarbeitung von Rohbildern aus dem Mikroskop (Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Die Beobachtung muss innerhalb von 10 min nach der Montage für die besten Bilder beginnen. Andernfalls wird sich bei RT der Farbstoff auf Stellen neben der Injektionsstelle ausbreiten und unerwünschte Nimmer für die Bildgebung erzeugen. Um die Diffusion von Farbstoff zu verlangsamen, kann die Probe bei 4 °C für ein paar Stunden gelagert werden.

Ergebnisse

Ein repräsentatives Bild der motorischen Neuronen aCC und RP3 ist in Abbildung 3C dargestellt, um die mehrfarbige Kennzeichnung von motorischen Neuronen bei 15 h AEL zu demonstrieren. Ihre dendritischen Morphologien sind weitgehend invariant zwischen Embryonen. Das mit Anti-HRP-Antikörpern erhaltene Färbemuster ist grau dargestellt. Ein kleines Tröpfchen DiO oder DiD wurde auf dem NMJ von Muskel 1 bzw. 6/7 abgelagert. Abbildung 4 zeigt die F...

Diskussion

Die Verwendung von Farbstoffkennzeichnungen zur Untersuchung der neuronalen Morphologie hat mehrere Vorteile gegenüber genetischen Zelletikettierungstechniken. Die Färbeetikettierungstechnik kann den Zeitaufwand für die Etikettierung und Abbildung der Morphologien von motorischen Neuronen minimieren. Der Färbeetikettierungsprozess ist recht schnell, da er weniger als 2 h dauert und es uns ermöglicht, die Umrisse neuronaler Projektionen zu definieren. Alternativ kann man das aCC-Motorneuron visualisieren, indem man e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)