粪便微生物群移植和肠道中 IgA 包被细菌患病率的检测

摘要

我们建立了一种在三天内消耗肠道细菌的有效方法，随后通过灌胃小鼠新鲜或冷冻肠道内容物制备的粪便来移植粪便微生物群。我们还提出了一种优化的方法来检测肠道中 IgA 包被的细菌的频率。

摘要

肠道微生物群在人类健康和疾病中发挥多效性作用。粪便微生物群移植 （FMT） 是研究肠道细菌整体或物种水平生物学功能的有效方法。已经发布了几种不同的 FMT 方法。在这里，我们提出了一种 FMT 方案，该方案可在几天内成功耗尽肠道微生物群，然后将粪便微生物群从新鲜或冷冻供体肠道内容物移植到常规小鼠中。实时 PCR 用于测试细菌耗竭的功效。然后应用 16S 核糖体 RNA （rRNA） 测序以测试受体小鼠肠道微生物群的相对丰度和身份。我们还提出了一种基于流式细胞术的肠道免疫球蛋白 A （IgA） 包被细菌检测方法。

引言

多样化的肠道微生物群在维持宿主稳态方面起着重要作用。这种微生物组有助于各种生理过程，包括消化和吸收食物中的营养物质、防御病原体感染、调节免疫系统发育和免疫稳态¹。肠道微生物组成的扰动与许多疾病有关，包括癌症²、自身免疫性疾病³、炎症性肠病⁴、神经系统疾病⁵ 和代谢性疾病 ^6,7。无菌 （GF） 小鼠是粪便微生物群移植模型中研究微生物群生物学效应的强大工具⁸。然而，GF 的饲养环境非常严格，在这些小鼠中进行粪便微生物群移植 （FMT） 的成本很高。此外，与传统小鼠相比，GF 小鼠具有不同的屏障和粘膜特性，可调节细菌渗透⁹。这些因素限制了 GF 小鼠在研究中的广泛应用。使用 GF 小鼠的另一种方法是使用抗生素混合物然后进行 FMT 消耗传统小鼠的微生物群。以前报道的 FMT 方法没有得到很好的描述且不一致;因此，有必要建立一个可行、高效且可重复的方案来使用常规小鼠进行 FMT。

几个步骤对于成功的 FMT 至关重要。微生物群消耗的效率是第一个重要步骤。对于细菌耗竭，已报道使用单一广谱抗生素（例如链霉素¹⁰）或抗生素混合物（三联或四联抗生素治疗）^11,12。包括氨苄西林、甲硝唑、新霉素和万古霉素在内的四联抗生素治疗已被发现是最有效的方案，并已用于多项研究 13,14,15。除了使用的抗生素类型外，抗生素治疗的给药途径、剂量和持续时间也会影响细菌耗竭的疗效。一些研究人员在饮用水中使用抗生素来消除胃肠道中的细菌¹⁵。然而，以这种方式很难控制每只小鼠接受的抗生素剂量。因此，在随后的研究中，研究人员通过口服强饲法用抗生素治疗小鼠 1-2 周¹² 以达到令人满意的消耗。然而，长期使用抗生素可能会有问题，因为抗生素本身可能会影响啮齿动物模型中的某些疾病¹⁶。因此，需要更快、更有效的微生物群消耗方法。

粪便液制备是确保 FMT 成功的另一个关键步骤。在胃肠道中，pH 值范围从胃的 1 到近端和远端肠道的 7⁹。由于高酸度，胃中的微生物群受到限制，包括幽门螺杆菌 ¹⁷。近端肠道产生用于肝肠循环的胆汁酸，并包含与脂肪、蛋白质和葡萄糖消化相关的微生物群。远端肠道含有丰富的厌氧菌，并表现出高度的微生物多样性¹⁸。鉴于肠道微生物群的空间异质性，必须从肠道的不同区域分离肠道内容物以进行粪液制备。此外，在进行 FMT 时，其他因素，包括供体样本的性质（例如新鲜或冷冻样本）、移植频率和持续时间也至关重要。冰冻粪便最常用于定植具有人类肠道微生物群的常规小鼠¹⁹。相比之下，使用来自动物供体的新鲜粪便的 FMT 更合适，常用于动物模型^20,21。FMT 频率和持续时间因实验设计和模型而异。在以前的研究中，FMT 每天或每隔一天进行一次。移植持续时间从 3 天²² 到 5 周不等²³。除了上述因素外，保持无菌手术环境和使用无菌手术器械对于避免意外的环境细菌污染至关重要。

肠道微生物群具有调节表达免疫球蛋白 A （IgA） 的细胞积累的潜力。IgA 是一种主要的抗体同种型，对于通过中和和排除保护宿主免受感染至关重要。高亲和力 IgA 被转胞吞到肠腔中，可以结合和包被致病的病原体。相比之下，用 IgA 包被可能为细菌提供定植优势²⁴。与病原体诱导的 IgA 相比，天然共生诱导的 IgA 具有较低的亲和力和特异性²⁵。据报道，在某些疾病中，被 IgA 包被的肠道细菌的比例显着增加^25,26。IgA 包被的细菌可以启动 IgA 产生的正反馈回路²⁷。因此，IgA 包被细菌的相对水平可以预测肠道炎症反应的程度。事实上，这种组合可以通过流式细胞术²⁸ 进行检测。使用基于 IgA 的分选，Floris 等人²⁷、Palm 等人²⁵ 和 Andrew 等人²⁹ 从小鼠那里获得了 IgA ⁺ 和 IgA^- 粪便细菌，并通过 16S rRNA 测序表征了分类群特异性包被肠道微生物群。

在这项研究中，我们描述了一种优化的方法，可以有效消耗肠道优势细菌，并用从回肠和结肠内容物中分离的新鲜或冷冻粪便微生物群定植常规小鼠。我们还展示了一种基于流式细胞术检测肠道中 IgA 结合细菌的方法。

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研究方案

动物实验是根据中国现行的动物护理和使用道德规范进行的。

注：将动物饲养在无特定病原体 （SPF） 的受控环境中，在 25 °C 下进行 12 小时的光照和黑暗循环。 食物在喂给小鼠之前进行辐照。饮用水和笼子在使用前进行高压灭菌。在适应环境 1 周后，使用 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠进行研究。他们根据实验设计被分为几组。每组至少由三只小鼠组成。

1. 肠道微生物群耗竭

1. 抗生素鸡尾酒制备
   1. 在无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备抗生素溶液，其中含有 0.5 mg/mL 盐酸万古霉素、1 mg/mL 甲硝唑、1 mg/mL 氨苄青霉素钠盐和 1 mg/mL 硫酸新霉素。
      注意：将抗生素储存在 2–8 °C 下，避免阳光直射。准备新鲜的抗生素混合物溶液并立即使用。
2. 治疗方案
   1. 3 天，用 #10 针头向小鼠口服 200 μL 准备好的抗生素混合物。一只手垂直握住鼠标，另一只手调整针头的角度，以免碰到胃部。
      注意：必须轻拿轻放鼠标以避免挣扎，因为食道和胃的表面损伤可能会导致炎症或死亡。
   2. 向饮用水中添加与步骤 1.1.1 中指示的相同浓度的抗生素。
   3. 三天后，通过 CO₂ 窒息处死小鼠。
   4. 使用无菌器械无菌解剖腹部。在距离盲肠 2 cm 处，切掉 2 cm 的回肠束。使用无菌镊子夹住尿道的一端，将新鲜内容物从尿道中挤出到预先称重的试管中。
   5. 要收集盲肠的内容物，请用手术剪刀将其切成两半。将每半盲肠的内容物挤入预先称重的试管中。
3. 评估肠道微生物群耗竭功效。
   1. 称量从幼稚小鼠和抗生素鸡尾酒处理的小鼠的回肠或盲肠中分离的肠道内容物，并根据制造商的说明使用试剂盒提取粪便微生物群 DNA。根据公式测定 DNA 浓度：
      
      _样品浓度 （μg/mL） = OD₂₆₀ x 50
       
   2. 构造标准曲线。
      1. 使用 V3-V4 特异性引物通过聚合酶链反应 （PCR） 扩增 大肠杆菌基因。在 95 °C 下预变性 1 分钟，扩增 40 个循环，其中 95 °C 持续 10 秒，60 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 30 秒。
      2. 通过将扩增的产物连接到 TA 载体来构建质粒。根据制造商的说明，使用 TA 载体试剂盒克隆培养物。
      3. 根据步骤 1.3.1 中所述的 OD₂₆₀ 值测量质粒浓度 （ng/μL）。
         注：质粒浓度的单位与 DNA 浓度的单位不同。
      4. 使用以下公式计算拷贝数，其中 MW 代表分子量：
         
         1 μL 拷贝数 = 浓度 （ng/μL） x ^10-9 x 6.02 x 10²³/（MW_质粒 x 660）
          
      5. 用双蒸水重构质粒至终浓度为 40 μg/μL。准备一个 10 倍梯度稀释系列，分为八个阶段。通过在 PCR 扩增后将 C_T 值（Y 轴）与对数（拷贝_质粒）（X 轴）作图来构建标准曲线，其中 C_T 代表靶标扩增的阈值循环。从图中提取方程（在本例中为 y = -3.07x + 45.07，R² = 0.994）。
   3. 如步骤 1.3.2.1 所述，通过实时 PCR 扩增在步骤 1.3.1 中获得的 1 μL DNA 样品，这些样品来自幼稚对照组和抗生素鸡尾酒治疗组的回肠或盲肠。根据步骤 1.3.2.5 中的标准曲线计算 1 μL DNA 样品中的拷贝数，然后使用以下公式计算总拷贝数：
      加权样品中的总拷贝数（每 mg）= 拷贝数× DNA 总体积/样品初始重量
4. 通过对 16S rRNA V3 和 V4 区域进行测序来分析微生物群 DNA。

2. 粪便微生物群移植

1. 用于新鲜和冷冻粪便样本的粪便液制备
   注：所有仪器在使用前均需浸泡在 75% 酒精中，以避免先前存在的细菌污染。在收集回肠和结肠内容物时避免污染至关重要。
   1. 通过 CO₂ 窒息处死 3-5 只供体小鼠。
   2. 按照步骤 1.2.4 中的说明收集回肠的内容物。
   3. 为了收集结肠中的内容物，请在肛门附近做第一个切口并切开上部 2 厘米的通道。按照步骤 1.2.4 中的说明提取内容。在 1 分钟内收集样品以减少暴露在空气中。
   4. 对于冰冻的粪便，按照步骤 2.1.2 和 2.1.3 中的说明收集回肠或结肠内容物，并在液氮中快速冷冻内容物。
   5. 将样品储存在 -80 °C 冰箱中，直到准备好使用。
2. 汇集并称量内容物，加入带有珠子的新鲜无菌管中。对于冷冻样品，在称量前在冰上解冻粪便颗粒。
3. 将无菌 PBS 添加到试管中，并使用 5 mL 注射器针头将粪便沉淀重悬于 PBS（1 mL PBS/0.2 g 粪便沉淀）中。用珠子将粪便沉淀完全匀浆，并漩涡 3 次，每次 1 分钟。
4. 以 800 x g 离心 3 分钟，然后通过 70 μm 细胞过滤器过滤上清液。将过滤后的粪便收集在无菌管中，并立即用于 FMT。

3. 粪便微生物群移植程序

1. 每隔一天通过口服强饲法向微生物群耗尽的小鼠施用 200 μL 准备好的粪便液，持续 7 天。用 200 μL 无菌 PBS 管饲对照小鼠。
2. 通过CO₂ 窒息处死小鼠，并根据步骤2.1.2和2.1.3从回肠和结肠中收获内容物。将样品储存在 -80 °C 直至进一步处理。
3. 如步骤 1.3.1 中所述，提取回肠和结肠内容物的微生物群 DNA。通过 16S rRNA 测序验证移植小鼠肠道中的微生物群组成。

4. IgA 包被细菌测量

1. 样品制备
   1. 如步骤 2.1.2 和 2.1.3 所述，从供体小鼠收集 50 mg 粪便沉淀，并在 4 °C 下在 1 mL 无菌 PBS 中孵育 1 小时。使用珠子打浆器将沉淀均质化 5 秒。
   2. 将溶液在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。 通过 70 μm 过滤器过滤后收集上清液。
      注意：避免高速离心。
   3. 将 5 μL 上清液加入 PBS（FACS 缓冲液）中的 1 mL 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中。在 4 °C 下以 8,000 x g 沉淀 5 分钟，然后弃去上清液。
   4. 将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
      注意：此处使用的卷可能需要优化。此步骤中过多的上清液可能会掩盖 IgA 包被细菌的阳性信号。
   5. 将沉淀重悬于 100 μL 含有 10% 山羊血清的 PBS 中，并在冰上或 4 °C 下孵育 30 分钟。在试管中加入 1 mL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟以沉淀。
2. 流式细胞术
   1. 用 200 μL 含有生物素抗小鼠 IgA 抗体 （1：100） 和 APC 偶联的抗生物素抗体 （1：100） 的 FACS 缓冲液重悬步骤 4.1.5 中获得的沉淀，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 在试管中加入 1 mL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟。 丢弃上清液。
   3. 通过加入 200 μL 含有绿色荧光核酸染色剂 （1：200） 的 FACS 缓冲液对步骤 4.2.2 中的沉淀进行染色，并在 4 °C 下孵育 5 分钟。
   4. 加入 1 mL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟以沉淀。
   5. 测量前将沉淀重悬于 250 μL FACS 缓冲液中。
   6. 使用流式细胞仪采集数据，并使用 FlowJo 软件进行分析。

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结果

本研究中使用的 FMT 时间表如图 1 所示。用抗生素混合物处理后，通过对 16S rRNA 区域进行测序来分析肠道微生物群耗竭的效率。我们在幼稚小鼠的回肠中检测到 196 种，而 3 天的抗生素治疗迅速将细菌种类减少到 35 种（图 2A）。仅在接受抗生素鸡尾酒治疗的小鼠中检测到 8 个物种（图 2A）。属水平的 β ?...

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讨论

耗竭程序中使用的抗生素具有不同的抗菌特性。万古霉素对革兰氏阳性菌³⁰ 具有特异性。口服多西环素可诱导雌性 C57BL/6NCrl 小鼠肠道菌群组成发生显著变化³¹。新霉素是一种广谱抗生素，针对大多数肠道驻留细菌³²。然而，它并不能预防肠道炎症。广谱抗生素混合物比单一抗生素更有效 13,33,34。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe needle	Sheng guang biotech	5mL
70 µm cell strainer	BD biosciences	352350
Ampicillin sodium salt	AMERESCO	0339
APC Streptavidin	BD biosciences	554067
Biotin anti-mouse IgA antibody	Biolegend	407003
Bovine serum albiumin (BSA)	Sigma	B2064-50G
C57BL/6J mice	Chengdu Dashuo
CO2	Xiyuan biotech
E.Coil genome DNA	TsingKe
Eppendorf tubes	Axygen	MCT150-C
Fast DNA stool mini Handbook	QIAGEN	51604
Metronidazole	Shyuanye	S17079-5g
Neomycin sulfate	SIGMA	N-1876
Oral gavage needle	Yuke biotech	10#
pClone007 Versatile simple TA vector kit	TsingKe	007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Hyclone	SH30256
Precellys lysing kit	Precellys	KT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIX	Vazyme	Q411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Thermo fisher scientific	S34855
V338 F primer	TsingKe		ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primer	TsingKe		GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochloride	Sigma	V2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometer	BD biosciences
Bead beater vortx	Scilogex
BIORAD CFX Connect	BIORAD
Centrifuge machine	Eppendorf
Illumina MiSeq	Illumina
Nanodrop nucleic acid measurements machine	Thermo fisher scientific
Surgical instruments	Yuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015	Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database