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要約

私たちは、3日間で腸内細菌を効率的に枯渇させる方法を確立し、その後、新鮮または凍結した腸内容物から調製した糞便液をマウスに強制経口投与することで糞便微生物叢を移植しました。また、腸内のIgAコーティング細菌の頻度を検出するための最適化された方法も紹介します。

要約

腸内細菌叢は、人間の健康と病気に多面的な役割を果たします。糞便微生物叢移植(FMT)は、腸内細菌の生物学的機能を全体として、または種レベルで調査するための効果的な方法です。いくつかの異なるFMT法が発表されています。ここでは、数日で腸内細菌叢をうまく枯渇させ、その後、新鮮または凍結したドナーの腸内容物から従来のマウスに糞便微生物叢を移植するFMTプロトコルを紹介します。リアルタイムPCRを適用して、細菌の枯渇の有効性をテストします。次に、16SリボソームRNA(rRNA)のシーケンシングを適用して、レシピエントマウスの腸内細菌叢の相対的な存在量と同一性をテストします。また、フローサイトメトリーを用いた免疫グロブリンA(IgA)コーティング細菌の腸内検出法についても紹介します。

概要

多様な腸内細菌叢は、宿主の恒常性を維持する上で主要な役割を果たします。このマイクロバイオームは、食物からの栄養素の消化吸収、病原体の感染に対する防御、免疫系の発達の調節、免疫恒常性など、さまざまな生理学的プロセスを助けます1。腸内微生物組成の摂動は、がん2、自己免疫疾患3、炎症性腸疾患4、神経疾患5、代謝性疾患6,7など、多くの疾患と関連づけられています。無菌(GF)マウスは、糞便微生物叢移植モデルにおいて、微生物叢の生物学的影響を研究するための強力なツールです8。しかし、GFの飼育環境は非常に厳しく、これらのマウスに糞便微生物叢移植(FMT)を行うには費用がかかります。さらに、GFマウスは、従来のマウスと比較して、細菌の侵入を調節するバリア特性と粘膜特性が異なります9。これらの要因により、研究におけるGFマウスの幅広い適用が制限されます。GFマウスを使用する代わりに、抗生物質カクテルとそれに続くFMTを使用して、従来のマウスで微生物叢を枯渇させることです。以前に報告されたFMT法は十分に説明されておらず、一貫性がありません。したがって、従来のマウスを使用してFMTを実施するための実行可能で効率的で再現性のあるプロトコルを確立する必要があります。

FMTを成功させるには、いくつかのステップが重要です。微生物叢の枯渇の効率は、最初の重要なステップです。細菌の枯渇には、単一の広域スペクトル抗生物質(例えば、ストレプトマイシン10)または抗生物質カクテル(3重または4重の抗生物質治療)の使用が報告されています11,12。アンピシリン、メトロニダゾール、ネオマイシン、バンコマイシンを含む4種類の抗生物質治療は、最も効果的なレジメンであることがわかっており、いくつかの研究で使用されています13,14,15。使用する抗生物質の種類に加えて、抗生物質治療の投与経路、投与量、および期間は、細菌の枯渇の有効性に影響を与えます。一部の研究者は、消化管の細菌を排除するために飲料水に抗生物質を適用します15。しかし、この方法で各マウスが投与する抗生物質の投与量を制御することは困難です。したがって、その後の研究では、研究者はマウスを抗生物質で1〜2週間経口強制経口投与し、満足のいく枯渇を達成しました12。ただし、抗生物質自体がげっ歯類モデルの一部の疾患に影響を与える可能性があるため、抗生物質の長期使用は問題になる可能性があります16。したがって、微生物叢の枯渇のためのより迅速で効率的な方法が必要です。

糞便液の調製は、FMTを成功させるためのもう一つの重要なステップです。胃腸管では、pHは胃の1から近位および遠位腸の79までの範囲です。胃の中の微生物叢は酸性度が高いため制限されており、ヘリコバクターピロリ17が含まれています。近位腸は、肝臓-腸循環のための胆汁酸を産生し、脂肪、タンパク質、およびグルコースの消化に関連する微生物叢を含んでいます。腸管遠位部には嫌気性細菌が豊富に含まれており、微生物の多様性が高い18。腸内細菌叢の空間的な不均一性を考えると、糞便液の準備のために腸管のさまざまな領域から腸の内容物を分離することが不可欠です。さらに、ドナーサンプルの性質(新鮮サンプルまたは凍結サンプルなど)、移植頻度、期間などの他の要因も、FMTを実施する際に重要です。凍結便は、ヒトの腸内細菌叢19を持つ従来のマウスにコロニーを形成するために最も一般的に使用されます。対照的に、動物ドナーからの新鮮な便を使用するFMTは、動物モデル20,21でより適切であり、一般的に使用されています。FMTの頻度と期間は、実験計画とモデルによって異なります。以前の研究では、FMTは毎日または隔日で行われていました。移植期間は3日22から5週間23の範囲であった。上記の要素に加えて、無菌手術環境を維持し、滅菌された手術器具を使用することは、予期しない環境細菌汚染を避けるために重要です。

腸内細菌叢は、免疫グロブリンA(IgA)を発現する細胞の蓄積を調節する可能性を秘めています。主要な抗体アイソタイプであるIgAは、中和と排除を通じて宿主を感染から保護するために重要です。高親和性IgAは腸管腔にトランスサイトージされ、問題となる病原体に結合してコーティングすることができます。対照的に、IgAによるコーティングは、細菌24にコロニー形成の利点を提供する可能性がある。病原体誘発性IgAとは対照的に、先住民族の共生誘導性IgAは親和性と特異性が低い25。IgAでコーティングされた腸内細菌の割合は、一部の疾患で有意に増加すると報告されています25,26。IgA被覆細菌は、IgA産生の正のフィードバックループを開始することができる27。したがって、IgA被覆細菌の相対的なレベルは、腸内の炎症反応の大きさを予測することができます。実際、この組み合わせはフローサイトメトリー28を介して検出することができる。IgAベースのソーティングを用いて、Florisら27、Palmら25、およびAndrewら29は、マウスからIgA+およびIgA-糞便細菌を取得し、16S rRNAシーケンシングを介して分類群特異的なコーティング腸内細菌叢を特徴付けました。

この研究では、腸内優勢菌を効率的に枯渇させ、回腸と結腸の内容物から分離された新鮮または凍結の糞便微生物叢で従来のマウスにコロニーを形成するための最適化された方法について説明します。また、フローサイトメトリーに基づく、腸内のIgA結合細菌を検出する方法も示しています。

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プロトコル

動物実験は、中国における動物の管理と使用に関する現行の倫理規定に従って実施されました。

注:動物は、25°Cで12時間の明暗サイクルの下で、特定の病原体を含まない(SPF)制御された環境に収容されました。 マウスに餌を与える前に、餌を照射しました。飲料水とケージは、使用前にオートクレーブ滅菌しました。8週齢の雄C57BL/6Jマウスを、1週間の順応後の研究で使用しました。彼らは実験デザインに基づいていくつかのグループに分けられました。各グループは少なくとも3匹のマウスで構成されていました。

1.腸内細菌叢の枯渇

  1. 抗生物質カクテルの準備
    1. 0.5 mg/mL のバンコマイシン塩酸塩、1 mg/mL メトロニダゾール、1 mg/mL アンピシリンナトリウム塩、および 1 mg/mL のネオマイシン硫酸塩を含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で抗生物質溶液を調製します。
      注:抗生物質は2〜8°Cで保管し、直射日光を避けてください。抗生物質カクテル溶液を新鮮に調製し、すぐに使用してください。
  2. 治療計画
    1. 3日間、調製した抗生物質カクテル200μLを#10針でマウスに経口投与します。片手でマウスを垂直に持ち、もう一方の手で針の角度を調整して、胃に届かないようにします。
      注:食道や胃の表面が損傷すると炎症や死に至る可能性があるため、マウスはもがかないように優しく取り扱う必要があります。
    2. ステップ1.1.1で示されたのと同じ濃度で飲料水に抗生物質を追加します。
    3. 3日後、CO2 窒息でマウスを犠牲にします。
    4. 滅菌器具を使用して腹部を無菌的に解剖します。盲腸から2 cmの距離で、回腸の2 cmの管を切り取ります。滅菌ピンセットを使用してトラクトの一方の端をクランプオフし、トラクトから新鮮な内容物を事前に計量されたチューブに絞り出します。
    5. 盲腸の内容物を集めるには、手術用ハサミで半分に切ります。盲腸の各半分の内容物を事前に秤量したチューブに絞ります。
  3. 腸内細菌叢の枯渇効果を評価します。
    1. ナイーブマウスおよび抗生物質カクテル処理マウスの回腸または盲腸から分離された腸内容物を秤量し、製造元の指示に従ってキットを使用して便微生物叢DNAを抽出します。次の式に従ってDNA濃度を決定します。

      濃度サンプル (μg/mL)=外径260 ×50
       
    2. 標準曲線を作成します。
      1. V3-V4特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により 大腸菌遺伝子を増幅します。95°Cで1分間退変性させ、95°Cで10秒間、60°Cで30秒間、72°Cで30秒間の40サイクルで増幅します。
      2. 増幅した生成物をTAベクターに結合させることにより、プラスミドを構築します。TAベクターキットで培養物をクローニングします。メーカーの指示に従ってください。
      3. ステップ1.3.1で説明したように、OD260 値に基づいてプラスミド濃度(ng/μL)を測定します。
        注:プラスミド濃度の単位は、DNA濃度の単位とは異なります。
      4. 次の式(MWは分子量を表します)を使用してコピー数を計算します。

        1 μL = 濃度 (ng/μL) x 10-9 x 6.02 x 1023/(MWプラスミド x 660)
         
      5. プラスミドを二重蒸留水で最終濃度40 μg/μLまで再構成します。8段階の10倍グラジエント希釈シリーズを調製します。PCR 増幅後の Log (コピープラスミド) (X 軸) に対して CT 値 (Y 軸) をプロットすることにより、標準曲線を作成します (CT はターゲット増幅の閾値サイクルを表します)。プロットから方程式を抽出します (この場合、y = -3.07x + 45.07、R2 = 0.994 でした)。
    3. ステップ1.3.1で得られたDNAサンプル1.3.1で得られたDNAサンプル1 μLを、ステップ1.3.2.1で説明したように、ナイーブコントロールグループおよび抗生物質カクテル治療グループから回腸または盲腸から抽出したものをリアルタイムPCRで増幅します。ステップ 1.3.2.5 の標準曲線に基づいて DNA サンプルの 1 μL のコピー数を計算し、次の式を使用して合計コピー数を計算します。
      重み付けサンプル中の総コピー数(mgあたり)=コピー数×サンプルの総DNA量/初期重量
  4. 16S rRNA V3およびV4領域のシーケンシングにより、微生物叢DNAを解析します。

2.糞便微生物叢移植

  1. 新鮮便と冷凍便の両方の糞便調製
    注意: すべての機器は、既存の細菌汚染を避けるために、使用前に75%アルコールに浸されています。回腸と結腸の内容物を収集するときは、汚染を避けることが重要です。
    1. CO2 窒息により3〜5匹のドナーマウスを犠牲にします。
    2. ステップ1.2.4で説明されているように、回腸の内容物を収集します。
    3. 結腸の内容物を集めるには、肛門の近くに最初の切開を行い、上部の2cmの管を切断します。手順 1.2.4 で説明したように内容を抽出します。空気への曝露を減らすために、サンプルを1分で収集します。
    4. 凍結した糞便の場合は、手順2.1.2および2.1.3で説明されているように回腸または結腸の内容物を収集し、内容物を液体窒素で急速凍結します。
    5. サンプルは、使用する準備ができるまで-80°Cの冷凍庫に保管してください。
  2. 内容物をプールして重量を量り、ビーズ付きの新鮮な滅菌チューブを追加します。凍結サンプルの場合は、糞便ペレットを氷上で解凍してから秤量します。
  3. 滅菌PBSをチューブに加え、5mLシリンジ針を使用して糞便ペレットをPBS(PBS1 mL / 糞便ペレット0.2 g)に再懸濁します。糞便ペレットをビーズで完全に均質化し、ボルテックスを3回ずつ1分間ずつ行います。
  4. 800 x g で3分間遠心分離し、70 μmの細胞ストレーナーを通過して上清をろ過します。ろ過した糞便を滅菌チューブに集め、すぐにFMTに使用してください。

3.糞便微生物叢移植の手順

  1. 調製した糞便液200μLを微生物叢が枯渇したマウスに、隔日で7日間経口強制経口投与します。200 μL の滅菌 PBS を含む強制経口投与コントロールマウス。
  2. CO2 窒息によってマウスを犠牲にし、ステップ2.1.2および2.1.3に従って回腸と結腸から内容物を収穫します。サンプルは、次の処理まで-80°Cで保存してください。
  3. ステップ1.3.1で説明したように、回腸および結腸内容物の微生物叢DNAを抽出します。移植マウスの腸内の微生物叢組成を16S rRNAシーケンシングにより確認します。

4. IgA被覆細菌の測定

  1. サンプル調製
    1. ステップ2.1.2および2.1.3で説明したように、ドナーマウスから50 mgの糞便ペレットを採取し、滅菌PBS1 mLで4°Cで1時間インキュベートします。ビーズビーターを使用してペレットを5秒間均質化します。
    2. 溶液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 70 μmのストレーナで濾過した後、上清を回収します。
      注:高速遠心分離は避けてください。
    3. PBS(FACSバッファー)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)1 mLに上清5 μLを加えます。8,000 x g でペレットを4°Cで5分間ペレット化し、上清を捨てます。
    4. ペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁し、8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
      注:ここで使用するボリュームを最適化する必要がある場合があります。このステップで上清が多すぎると、IgAコーティングされた細菌の陽性シグナルが隠される可能性があります。
    5. 10%ヤギ血清を含むPBS100 μLにペレットを再懸濁し、氷上または4°Cで30分間インキュベートします。チューブに1 mLのFACSバッファーを加え、8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、ペレット化します。
  2. フローサイトメトリー
    1. ステップ4.1.5で得られたペレットを、ビオチン抗マウスIgA抗体(1:100)およびAPC標識抗ビオチン抗体(1:100)を含む200μLのFACSバッファーに再懸濁し、4°Cで30分間インキュベートします。
    2. チューブに1 mLのFACSバッファーを加え、8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。
    3. ステップ4.2.2のペレットに、緑色蛍光核酸染色剤(1:200)を含むFACSバッファー200 μLを加えて染色し、4°Cで5分間インキュベートします。
    4. 1 mLのFACSバッファーを加え、8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、ペレット化します。
    5. 測定前に、ペレットを250μLのFACSバッファーに再懸濁してください。
    6. フローサイトメーターでデータを取得し、FlowJoソフトウェアで解析します。

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結果

この研究で使用したFMTスケジュールを図1に示します。抗生物質カクテルで処理した後、16S rRNA領域のシーケンシングにより、腸内細菌叢の枯渇効率を分析しました。ナイーブマウスの回腸で196種を検出しましたが、3日間の抗生物質治療により、細菌種は急速に35種に減少しました(図2A)。抗生物質カクテル治療を受けたマ?...

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ディスカッション

枯渇手順で使用される抗生物質は、異なる抗菌特性を持っています。バンコマイシンはグラム陽性菌に特異的である30。経口ドキシサイクリンは、雌のC57BL/6NCrlマウスにおいて腸内細菌叢の組成変化を有意に誘発することができる31。ネオマイシンは、ほとんどの腸内細菌を標的とする広域スペクトルの抗生物質です32<...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、四川大学西中国病院(助成金番号:ZYJC18024)および中国国家自然科学基金会(助成金:81770101および81973540)の優れた学際的プロジェクトのスポンサーの下で実施されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL syringe needleSheng guang biotech5mL
70 µm cell strainerBD biosciences352350
Ampicillin sodium saltAMERESCO0339
APC StreptavidinBD biosciences554067
Biotin anti-mouse IgA antibodyBiolegend407003
Bovine serum albiumin (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL/6J miceChengdu Dashuo
CO2Xiyuan biotech
E.Coil genome DNATsingKe
Eppendorf tubesAxygenMCT150-C
Fast DNA stool mini HandbookQIAGEN51604
MetronidazoleShyuanyeS17079-5g
Neomycin sulfateSIGMAN-1876
Oral gavage needleYuke biotech10#
pClone007 Versatile simple TA vector kitTsingKe007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)HycloneSH30256
Precellys lysing kitPrecellysKT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid StainThermo fisher scientificS34855
V338 F primerTsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primerTsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochlorideSigmaV2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometerBD biosciences
Bead beater vortxScilogex
BIORAD CFX ConnectBIORAD
Centrifuge machineEppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop nucleic acid measurements machineThermo fisher scientific
Surgical instrumentsYuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database

参考文献

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