Transplantation de microbiote fécal et détection de la prévalence des bactéries enrobées d’IgA dans l’intestin

Résumé

Nous avons établi un moyen efficace d’épuiser les bactéries intestinales en trois jours, puis de transplanter le microbiote fécal par gavage de liquide fécal préparé à partir de contenu intestinal frais ou congelé chez la souris. Nous présentons également une méthode optimisée pour détecter la fréquence des bactéries enrobées d’IgA dans l’intestin.

Résumé

Le microbiote intestinal joue un rôle pléiotropique dans la santé humaine et la maladie. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une méthode efficace pour étudier la fonction biologique des bactéries intestinales dans leur ensemble ou au niveau de l’espèce. Plusieurs méthodes FMT différentes ont été publiées. Ici, nous présentons un protocole FMT qui réussit à épuiser le microbiote intestinal en quelques jours, suivi d’une transplantation de microbiote fécal à partir du contenu intestinal frais ou congelé d’un donneur à des souris conventionnelles. La PCR en temps réel est appliquée pour tester l’efficacité de l’épuisement bactérien. Le séquençage de l’ARN ribosomique 16S (ARNr) est ensuite appliqué pour tester l’abondance relative et l’identité du microbiote intestinal chez les souris receveuses. Nous présentons également une méthode de détection basée sur la cytométrie en flux des bactéries enrobées d’immunoglobulines A (IgA) dans l’intestin.

Introduction

Un microbiote intestinal diversifié joue un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie de l’hôte. Ce microbiome aide à divers processus physiologiques allant de la digestion et de l’absorption des nutriments des aliments, à la défense contre l’infection des agents pathogènes, à la régulation du développement du système immunitaire et à l’homéostasie^{immunitaire 1}. La perturbation de la composition microbienne intestinale a été liée à de nombreuses maladies, notamment le cancer², les maladies auto-immunes³, les maladies inflammatoires de l’intestin⁴, les maladies neurologiques⁵ et les maladies métaboliques ^6,7. Les souris sans germes (GF) sont des outils puissants dans les modèles de transplantation de microbiote fécal pour étudier les effets biologiques du microbiote⁸. Cependant, l’environnement d’hébergement du GF est très strict et la transplantation de microbiote fécal (FMT) chez ces souris est coûteuse. De plus, les souris GF ont des propriétés de barrière et de muqueuse différentes, qui régulent la pénétration bactérienne, par rapport aux souris conventionnelles⁹. Ces facteurs limitent l’application à grande échelle des souris GF dans les études. Une alternative à l’utilisation de souris GF consiste à appauvrir le microbiote chez les souris conventionnelles à l’aide d’un cocktail d’antibiotiques suivi d’une FMT. Les méthodes de TMF mentionnées précédemment ne sont pas bien décrites et ne sont pas uniformes. par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole réalisable, efficace et reproductible pour effectuer la FMT à l’aide de souris conventionnelles.

Plusieurs étapes sont cruciales pour la réussite d’un FMT. L’efficacité de l’appauvrissement du microbiote est la première étape importante. Pour l’appauvrissement des bactéries, l’utilisation d’un seul antibiotique à large spectre (p. ex., streptomycine¹⁰) ou d’un cocktail d’antibiotiques (traitement antibiotique triple ou quadruple) a été signalée ^11,12. Le traitement antibiotique quadruple, comprenant l’ampicilline, le métronidazole, la néomycine et la vancomycine, s’est avéré être le régime le plus efficace et a été utilisé dans plusieurs études 13,14,15. En plus du type d’antibiotique utilisé, la voie d’administration, la posologie et la durée du traitement antibiotique affectent l’efficacité de l’épuisement bactérien. Certains chercheurs appliquent des antibiotiques dans l’eau potable pour éliminer les bactéries dans le tractus gastro-intestinal¹⁵. Cependant, il est difficile de contrôler la dose d’antibiotiques que chaque souris reçoit de cette façon. Par conséquent, dans des études ultérieures, les chercheurs ont traité des souris avec des antibiotiques par gavage oral pendant 1 à 2 semaines¹² pour obtenir une déplétion satisfaisante. Cependant, l’utilisation à long terme d’antibiotiques peut être problématique, car les antibiotiques eux-mêmes peuvent affecter certaines maladies chez les modèles de rongeurs¹⁶. Par conséquent, des méthodes plus rapides et plus efficaces pour l’appauvrissement du microbiote sont justifiées.

La préparation des fluides fécaux est une autre étape clé pour assurer le succès de la FMT. Dans le tractus gastro-intestinal, le pH varie de 1 dans l’estomac à 7 dans l’intestin proximal et distal⁹. Le microbiote de l’estomac est limité en raison de la forte acidité et comprend Helicobacter pylori¹⁷. L’intestin proximal produit des acides biliaires pour la circulation foie-intestin et contient du microbiote associé à la digestion des graisses, des protéines et du glucose. Le tractus intestinal distal contient une abondance de bactéries anaérobies et présente une grande diversité microbienne¹⁸. Compte tenu de l’hétérogénéité spatiale du microbiote intestinal, il est impératif d’isoler le contenu intestinal de différentes régions du tractus intestinal pour la préparation des fluides fécaux. De plus, d’autres facteurs, notamment la nature de l’échantillon du donneur (par exemple, un échantillon frais ou congelé), la fréquence et la durée de la transplantation, sont cruciaux lors de la réalisation de la FMT. Les selles congelées sont le plus souvent utilisées pour coloniser les souris conventionnelles avec le microbiote intestinal humain¹⁹. En revanche, la FMT utilisant des selles fraîches de donneurs animaux est plus appropriée et couramment utilisée dans les modèles animaux^20,21. La fréquence et la durée des TMF varient en fonction de la conception et des modèles expérimentaux. Dans des études précédentes, la FMT était soit quotidienne, soit tous les deux jours. La durée de la transplantation variait de 3 jours²² à 5 semaines²³. En plus des facteurs ci-dessus, le maintien d’un environnement chirurgical aseptique et l’utilisation d’instruments chirurgicaux stérilisés sont cruciaux pour éviter une contamination bactérienne environnementale inattendue.

Le microbiote intestinal a le potentiel de réguler l’accumulation de cellules qui expriment l’immunoglobuline A (IgA). L’IgA, un isotype d’anticorps prédominant, est essentielle pour protéger l’hôte contre l’infection par la neutralisation et l’exclusion. Les IgA de haute affinité sont transcytosées dans la lumière intestinale et peuvent lier et enrober les agents pathogènes incriminés. En revanche, l’enrobage d’IgA peut offrir un avantage de colonisation pour les bactéries²⁴. Contrairement aux IgA induites par des agents pathogènes, les IgA induites par les commensaux indigènes ont une affinité et une spécificité plus faibles²⁵. La proportion de bactéries intestinales enrobées d’IgA serait significativement augmentée dans certaines maladies^25,26. Les bactéries enrobées d’IgA peuvent initier une boucle de rétroaction positive de la production d’IgA²⁷. Par conséquent, le niveau relatif de bactéries enrobées d’IgA peut prédire l’ampleur de la réponse inflammatoire dans l’intestin. En fait, cette combinaison peut être détectée par cytométrie en flux²⁸. À l’aide d’un tri basé sur les IgA, Floris et ^al.27, Palm et ^al.25 et Andrew et ^al.29 ont acquis des bactéries fécales IgA⁺ et IgA^- de souris et ont caractérisé le microbiote intestinal enrobé spécifique aux taxons via le séquençage de l’ARNr 16S.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode optimisée pour épuiser efficacement les bactéries intestinales dominantes et coloniser des souris conventionnelles avec un microbiote fécal frais ou congelé isolé du contenu de l’iléon et du côlon. Nous démontrons également une méthode basée sur la cytométrie en flux pour détecter les bactéries se liant aux IgA dans l’intestin.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux réglementations éthiques en vigueur en matière de soins et d’utilisation des animaux en Chine.

REMARQUE : Les animaux ont été logés dans un environnement contrôlé exempt d’agents pathogènes spécifiques (FPS), sous des cycles de lumière et d’obscurité de 12 heures à 25 °C. La nourriture a été irradiée avant d’être donnée aux souris. L’eau potable et les cages ont été autoclavées avant d’être utilisées. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été utilisées dans l’étude après 1 semaine d’acclimatation. Ils ont été divisés en plusieurs groupes en fonction du plan d’expérience. Chaque groupe était composé d’au moins trois souris.

1. Épuisement du microbiote intestinal

1. Préparation de cocktails antibiotiques
   1. Préparez une solution antibiotique dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile avec 0,5 mg/mL de chlorhydrate de vancomycine, 1 mg/mL de métronidazole, 1 mg/mL de sel sodique d’ampicilline et 1 mg/mL de sulfate de néomycine.
      REMARQUE : Conservez les antibiotiques à une température de 2 à 8 °C et évitez la lumière directe. Préparez la solution de cocktail d’antibiotiques fraîche et utilisez-la immédiatement.
2. Schéma thérapeutique
   1. Pendant 3 jours, administrer par voie orale 200 μL de cocktail d’antibiotiques préparé avec une aiguille #10 à une souris. Tenez la souris verticalement dans une main tout en utilisant l’autre main pour ajuster l’angle de l’aiguille afin d’éviter d’atteindre l’estomac.
      REMARQUE : La souris doit être manipulée avec précaution pour éviter de se débattre, car des dommages à la surface de l’œsophage et de l’estomac peuvent entraîner une inflammation ou la mort.
   2. Ajouter des antibiotiques à l’eau potable aux mêmes concentrations que celles indiquées à l’étape 1.1.1.
   3. Trois jours plus tard, sacrifiez la souris par asphyxie au CO₂ .
   4. Disséquer l’abdomen de manière aseptique à l’aide d’instruments stériles. À une distance de 2 cm du cæcum, coupez un tronçon de 2 cm de l’iléon. À l’aide d’une pince à épiler stérile pour fixer une extrémité du tractus, pressez le contenu frais du tractus dans des tubes pré-pesés.
   5. Pour recueillir le contenu du caïcum, coupez-le en deux avec des ciseaux chirurgicaux. Pressez le contenu de chaque moitié du caecum dans des tubes pré-pesés.
3. Évaluer l’efficacité de l’appauvrissement du microbiote intestinal.
   1. Pesez le contenu intestinal isolé de l’iléon ou du caecum de souris naïves et de souris traitées à un cocktail d’antibiotiques, et extrayez l’ADN du microbiote des selles à l’aide d’un kit selon les instructions du fabricant. Déterminez la concentration d’ADN selon la formule :
      
      _{concentration de l’échantillon} (μg/mL) = DO₂₆₀ x 50
       
   2. Construisez une courbe standard.
      1. Amplifiez les gènes d’E. Coli à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l’aide d’amorces spécifiques V3-V4. Prénature à 95 °C pendant 1 min, amplifier pendant 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s.
      2. Construisez un plasmide en liant le produit amplifié à un vecteur TA. Clonez la culture avec un kit de vecteurs TA selon les instructions du fabricant.
      3. Mesurer la concentration plasmidique (ng/μL) sur la base de la valeur de DO₂₆₀ comme décrit à l’étape 1.3.1.
         REMARQUE : L’unité de concentration plasmidique est différente de l’unité de concentration d’ADN.
      4. Calculez le nombre de copies à l’aide de la formule suivante, où MW représente le poids moléculaire :
         
         copies dans 1 μL = concentration (ng/μL) x ^10-9 x 6,02 x 10²³/(_{MW plasmide} x 660)
          
      5. Reconstituer le plasmide avec de l’eau distillée deux fois jusqu’à une concentration finale de 40 μg/μL. Préparez une série de dilution à gradient 10x avec huit étapes. Construisez une courbe standard en traçant la valeur C_T (axe Y) en fonction du log (_plasmide Copies) (axe X) après amplification par PCR, où_{C T} représente le cycle de seuil pour l’amplification de la cible. Extrayez l’équation du graphique (dans ce cas, elle était y = -3,07x + 45,07, R² = 0,994).
   3. Amplifiez 1 μL des échantillons d’ADN obtenus à l’étape 1.3.1 extraits de l’iléon ou du caecum d’un groupe témoin naïf et du groupe de traitement par cocktail d’antibiotiques par PCR en temps réel, comme décrit à l’étape 1.3.2.1. Calculer le nombre de copies dans 1 μL des échantillons d’ADN à l’aide de la courbe standard de l’étape 1.3.2.5, puis calculer le nombre total de copies à l’aide de la formule suivante :
      Nombre total de copies (par mg) dans les échantillons pondérés = nombre de copies × volume total d’ADN/poids initial de l’échantillon
4. Analysez l’ADN du microbiote en séquençant les régions V3 et V4 de l’ARNr 16S.

2. Transplantation de microbiote fécal

1. Préparation des selles fraîches et congelées
   REMARQUE : Tous les instruments sont trempés dans de l’alcool à 75 % avant d’être utilisés pour éviter toute contamination bactérienne préexistante. Il est crucial d’éviter la contamination lors de la collecte du contenu de l’iléon et du côlon.
   1. Sacrifiez 3 à 5 souris donneuses par asphyxie au CO₂ .
   2. Prélevez le contenu de l’iléon comme décrit à l’étape 1.2.4.
   3. Pour recueillir le contenu du côlon, faites la première incision près de l’anus et coupez le tronc supérieur de 2 cm. Extrayez le contenu comme expliqué à l’étape 1.2.4. Prélever les échantillons en 1 min pour réduire l’exposition à l’air.
   4. Pour les matières fécales congelées, prélever le contenu de l’iléon ou du côlon comme décrit aux étapes 2.1.2 et 2.1.3, et congeler le contenu dans de l’azote liquide.
   5. Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
2. Mettez en pool et pesez le contenu, ajoutez des tubes stériles frais avec des billes. Pour les échantillons congelés, décongelez les boulettes fécales sur de la glace avant de les peser.
3. Ajouter du PBS stérile dans le tube et remettre en suspension les boulettes fécales dans du PBS (1 mL de PBS/0,2 g de pastille fécale) à l’aide d’une aiguille de seringue de 5 mL. Homogénéiser complètement la boule fécale avec des billes et un vortex 3x pendant 1 min chacune.
4. Centrifuger à 800 x g pendant 3 min, puis filtrer les surnageants en passant à travers une crépine à cellules de 70 μm. Prélever le liquide fécal filtré dans un tube stérile et l’utiliser immédiatement pour la FMT.

3. Procédure de transplantation de microbiote fécal

1. Administrer 200 μL de liquide fécal préparé aux souris appauvries en microbiote par gavage oral tous les deux jours pendant 7 jours. Souris témoins par gavage avec 200 μL de PBS stérile.
2. Sacrifiez les souris par asphyxie au CO₂ et récoltez le contenu de l’iléon et du côlon selon les étapes 2.1.2 et 2.1.3. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.
3. Extrayez l’ADN du microbiote de l’iléon et du contenu du côlon comme décrit à l’étape 1.3.1. Vérifier la composition du microbiote dans l’intestin de souris transplantées par séquençage de l’ARNr 16S.

4. Mesure des bactéries enrobées d’IgA

1. Préparation des échantillons
   1. Prélever 50 mg de boulettes fécales de souris donneuses comme décrit aux étapes 2.1.2 et 2.1.3 et incuber dans 1 mL de PBS stérile à 4 °C pendant 1 h. Homogénéiser les granulés à l’aide d’un batteur à billes pendant 5 s.
   2. Centrifuger la solution à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Recueillir le surnageant après l’avoir filtré à travers une crépine de 70 μm.
      REMARQUE : Évitez la centrifugation à grande vitesse.
   3. Ajouter 5 μL de surnageant à 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du PBS (tampon FACS). Granuler à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   4. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon FACS, centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire d’optimiser le volume utilisé ici. Une trop grande quantité de surnageant à cette étape peut masquer le signal positif des bactéries enrobées d’IgA.
   5. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et incuber sur de la glace ou à 4 °C pendant 30 min. Ajouter 1 mL de tampon FACS dans le tube et centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C sur la pastille.
2. Cytométrie en flux
   1. Remettre en suspension la pastille obtenue à l’étape 4.1.5 avec 200 μL de tampon FACS contenant de la biotine, un anticorps IgA anti-souris (1:100) et un anticorps anti-biotine conjugué APC (1:100) et incuber pendant 30 min à 4 °C.
   2. Ajouter 1 mL de tampon FACS dans le tube et centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
   3. Teindre la pastille à partir de l’étape 4.2.2 en ajoutant 200 μL de tampon FACS contenant une coloration d’acide nucléique fluorescente verte (1:200) et incuber à 4 °C pendant 5 min.
   4. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C sur la pastille.
   5. Remettre la pastille en suspension dans 250 μL de tampon FACS avant la mesure.
   6. Acquérez les données à l’aide d’un cytomètre en flux et analysez-les à l’aide du logiciel FlowJo.

Résultats

Le calendrier des TMF utilisé dans cette étude est décrit à la figure 1. Après traitement avec le cocktail d’antibiotiques, l’efficacité de l’appauvrissement du microbiote intestinal a été analysée par séquençage de la région de l’ARNr 16S. Nous avons détecté 196 espèces dans l’iléon de souris naïves, alors qu’un traitement antibiotique de 3 jours a rapidement réduit le nombre d’espèces bactériennes à 35 (

Discussion

Les antibiotiques utilisés dans la procédure d’épuisement ont des propriétés antibactériennes différentes. La vancomycine est spécifique des bactéries à Gram positif³⁰. La doxycycline orale peut induire des changements significatifs de la composition du microbiote intestinal chez les souris femelles C57BL/6NCrl³¹. La néomycine est un antibiotique à large spectre qui cible la plupart des bactéries résidentes de l’intestin

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe needle	Sheng guang biotech	5mL
70 µm cell strainer	BD biosciences	352350
Ampicillin sodium salt	AMERESCO	0339
APC Streptavidin	BD biosciences	554067
Biotin anti-mouse IgA antibody	Biolegend	407003
Bovine serum albiumin (BSA)	Sigma	B2064-50G
C57BL/6J mice	Chengdu Dashuo
CO2	Xiyuan biotech
E.Coil genome DNA	TsingKe
Eppendorf tubes	Axygen	MCT150-C
Fast DNA stool mini Handbook	QIAGEN	51604
Metronidazole	Shyuanye	S17079-5g
Neomycin sulfate	SIGMA	N-1876
Oral gavage needle	Yuke biotech	10#
pClone007 Versatile simple TA vector kit	TsingKe	007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Hyclone	SH30256
Precellys lysing kit	Precellys	KT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIX	Vazyme	Q411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Thermo fisher scientific	S34855
V338 F primer	TsingKe		ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primer	TsingKe		GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochloride	Sigma	V2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometer	BD biosciences
Bead beater vortx	Scilogex
BIORAD CFX Connect	BIORAD
Centrifuge machine	Eppendorf
Illumina MiSeq	Illumina
Nanodrop nucleic acid measurements machine	Thermo fisher scientific
Surgical instruments	Yuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015	Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database