使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式

摘要

该协议引入了一种无光刻图的微模式方法，该方法对于生物工程背景有限的人来说简单且易于使用。该方法利用定制的激光切割模具，以感兴趣的形状进行微模式细胞外基质蛋白，以调节细胞形态。微模式程序使用诱导多能干细胞衍生心肌细胞进行演示。

摘要

微模式技术在细胞生物学中得到了广泛的应用，用于研究控制细胞形状和大小对单细胞分辨率细胞命运测定的影响。目前最先进的单细胞微图案技术涉及软光刻和微接触印刷，这是一项强大的技术，但需要经过培训的工程技能和微制造的某些设施支持。这些限制需要一种更易于访问的技术。在这里，我们描述了一个简单的替代光刻无图法:基于模具的单细胞模式。我们提供分步程序，包括模具设计、聚丙烯酰胺水凝胶制造、基于模具的蛋白质的整合以及细胞电镀和培养。这个简单的方法可用于对多达 2，000 个单元格的数组进行模式化。我们演示了从具有不同细胞形状的单人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞的图案，从1:1平方到7:1的成人心肌细胞状矩形。这种基于模具的单细胞图案是无光刻，技术稳健，方便，价格便宜，最重要的是，对于那些有限的生物工程背景。

引言

hiPSCs的出现和随后针对不同细胞类型的定向分化的协议的开发使得研究在分子和患者特定水平上的发展和疾病成为可能，特别是使用患者衍生的iPSC心肌细胞（iPSC-CMs）来模拟心肌病^11、2。2然而，使用iPSC系统和其他体外模型研究发育和生理学的一个主要限制是缺乏结构化的微观环境。就位，细胞受到细胞外基质（ECM）和相邻细胞的约束。这些微环境的特殊生化成分和刚度决定了细胞的空间分布以及可用于参与细胞粘附的因素。这反过来又影响细胞内信号通路、基因表达和细胞命运测定。例如，成人型杆形状的微型iPSC-CM具有明显较好的收缩能力、钙流、线粒体组织、电生理学和横纹状^3。因此，微环境在细胞功能调节中具有不可分割的特性。

以前的微模式技术严重依赖光刻（图1A）。在这种技术中，一层感光聚合物或光刻剂从溶液在平坦的基板上旋转，形成约1μm厚的薄膜。接下来，紫外线 （UV） 光通过包含所需图案的蒙版应用于光刻。暴露于紫外线 （UV） 光会通过改变其各自显影溶液中的溶解度来化学地改变光阻，将所需的模式从面罩转移到基板上。许多微模式方法都采用了光刻，因为它赋予纳米对细胞图案设计的微米级控制。然而，光刻机的旋转对杂质非常敏感，因为最小的尘埃颗粒会破坏溶液扩散到薄膜中。因此，光刻必须在未受污染的设施中进行，这些设施维护成本高昂，需要特殊的专门知识才能加以利用。此外，光刻术中使用的化学物质通常对细胞有毒，并可能使重要的生物分子变性。因此，光刻术对制造微模式构成重大障碍，方便生物应用。

1994 年，Whitesides 及其⁴同事通过开创了一系列称为软光刻技术，克服了与光刻学相关的一些挑战。在软光刻中，用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微结构表面（PDMS）是一种透明、橡胶状的材料，用于生成ECM蛋白⁴的图案。常见的软光刻技术包括微接触印刷和微流体图案。在微接触印刷中，目前最流行的软平版图方法，涂有ECM蛋白的PDMS邮票将材料转移到图所接触的区域的表面（图1B）。在微流体图案中，微结构被设计成PDMS表面，这样当图章被压到基板上时，就会形成一个微通道网络，通过该网络将流体输送到所需区域（图1C）5。⁵与光刻摄影，柔和的光刻具有多种优点。一旦主晶圆是微结构的，PDMS 邮票就可以轻松复制，而无需进一步使用洁净室设施。此外，软光刻过程中缺乏有机溶剂，因此可以使用聚合物材料，如聚苯乙烯，通常用于细胞培养。最后，使用软光刻方法的微模式并不限于平面。因此，软光刻增加了微图案制造与光刻⁶的可访问性和功能性。然而，软光刻有显著的缺点。例如，使用光刻术的初始蚀刻步骤仍然需要对邮票进行微压。此外，使用PDMS图章的微图案取决于蛋白质转移到基材^{上的质量变化6。}避免这些差异需要优化和一致性的压力施加到PDMS印章在蛋白质转移期间，否则变形和变形的PDMS模具的特征大小可能发生⁶。由于小分子吸收^7，反复使用PDMS也是一个主要问题。

为了避免使用软光刻和PDMS图章，我们描述了一种基于模具、无光刻的单细胞微图案方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的许多障碍。在这种方法中，聚丙烯酰胺水凝胶用作基于模具的ECM蛋白结合的基质，允许选择性地电镀单个hiPSC-CM。该技术与经典细胞培养条件下的聚合物材料高度兼容。此外，通过适当的清洁和维护，模具可重复使用，在微制造过程中可耐降解和蛋白质吸收。最后，模式化过程在技术上坚固、价格低廉、可定制，并且可供没有专业生物工程技能的人使用。这种基于模具的微模式技术在近期的出版物中得到了广泛的应用，模拟了不同的心肌病^{88、9、10。9,10}

研究方案

1. 制造基于多酰胺的负型型模具

1. 使用计算机辅助设计软件（例如 AutoCAD、SolidWorks、Onshape、Adobe Illustrator）以 .dxf 格式生成模式 （图 2A）。
   1. 生成一个圆（直径 = 22 mm）来划定模具的边界。
   2. 绘制实心填充形状或所需的图案。
   3. 包括一个手部字母（例如 R）来标记模具的正面。
      注: 例如，在单单元和单元格对级别生成一个正方形和矩形数组以模式 iPSC-CM。设计文件可用（请参阅补充文件）。微制造分辨率限值为±10 μm。
2. 将设计提交给一家微制造公司，用于激光切割聚酰胺薄膜和制造模具（图2B，C）。C

2. 编制磺胺-SANPAH等号

注:协议由费舍尔等人修改^。

1. 使用防潮纸板样品储存盒（例如，100井，10 x 10 空间用于离心机管，尺寸:13.4 厘米 x 13.4 厘米 x 5.1 厘米）。标上"名称/日期/硫化物-SANPAH 40 μL/用 1，200 μL 的 PBS 重新组成"。
2. 在盖子上贴上50个微离心管（聚丙烯，1.5 mL）。
3. 使用膜过滤器单元（孔径= 0.22 μm）将4 mL无水、超干二甲二甲二氧化硫（DMSO）和无菌过滤器过滤溶液，放入无菌15 mL锥形管中。
4. 准备液氮浴，用盖子盖住，以尽量减少液氮的蒸发。
5. 在过滤的DMSO的2 mL中溶解50毫克的磺胺-SANPAH。
6. 涡旋井完全溶解在DMSO中的磺胺-SANPAH。
7. 将硫氟-SANPAH 溶液的40μL等位值分配到无菌的1.5 mL管中。
8. 将管子转移到箱子里。
9. 将管用液氮中闪闪冻结5分钟。
10. 将等分存储在 -80 °C。
    注: 等分可用于长达 6 个月，而不会降低效率。硫氟-SANPAH浓度为25毫克/mL或50.77mM。

3. 工具灭菌

1. 高压灭菌器、24 个玻璃盖玻片（22 x 22 mm、1 号或 1.5 号）、一个剃刀刀片和三个无绒吸水湿巾。
   注:要进行12个水凝胶结构，需要24个玻璃盖玻片。每个构造应该有两个盖玻片。建议准备一些备用的盖玻片。
2. 将两片石蜡薄膜（4 x 4 英寸）放入一个耐乙醇塑料盒（例如，1，000 μL 移液器尖端盒），并在新鲜 70% 乙醇中消毒至少 15 分钟。

4. 制备聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液

注:协议是从李等人^{修改的12。}

1. 通过涡旋，在50mL聚丙烯离心管中溶解125毫克氨基甲酰甲酰乙酰乙酰酯（AEM）。
2. 制备 50 mL 的 10 kPa 聚丙烯酰胺前体溶液 （8⁄0.15–15 mM），混合 10 mL 40% 丙烯酰胺溶液、3.75 mL 2% 二乙二甲酰胺溶液，以及步骤 4.1 中制备的 36.25 mL AEM 溶液，用于新的 50 mL 聚丙烯离心机管中制备。
   注:前体溶液的最终浓度为8%丙烯酰胺、0.15%二乙酰二分酰和15 mM AEM，经原子力显微镜测定为±10 kPa刚度。根据感兴趣的组织应用，通过将40%丙烯酰胺与2%二丙烯酰胺溶液的比例改变水凝胶的刚度。例如，8% 丙烯酰胺=0.08% 二乙丙烯酰胺溶液产生 3 kPa 水凝胶;8% 丙烯酰胺=0.48%二乙丙烯酰胺溶液可产生38千帕水凝胶;8% 丙烯酰胺+0.48% 二乙酰丙烯酰胺溶液可产生 60 kPa 水凝胶。建议确认由具有改变比的前体溶液制成的水凝胶的刚度。

5. 光子解的制备

1. 对于1 mL的5%光子反应器溶液，首先溶解50毫克的2-羟基-4'-（2-羟基）-2甲基丙丙酮粉在700μL的100%乙醇在1.5mL聚丙烯离心管与盖子。
   注:2-羟基-4'-（2-羟基氧）-2-甲基丙丙酮不溶于水。确保通过涡旋将粉末完全溶解在乙醇中。
2. 在通过涡旋完全溶解乙醇中的2-羟基-4'-（2-羟基苯）-2-甲基丙丙酮后，加入300μL磷酸缓冲盐水（PBS），最终体积为1 mL。
   注:2-羟基-4'-（2-羟基氧）-2-甲基丙酮溶液的最终浓度为5%。在4°C下，挫败的5%光起光解溶液适用于4周。

6. 制备基底膜基质蛋白溶液

注: 基底膜基质 （材料表） 是一种对温度敏感的材料.确保使用冷冻移液器吸头和管以及冰冷溶液在冰上工作。一批新的基底膜基质应在4°C的冰层下缓慢解冻。

1. 每水凝胶构造制备200μL的基底膜基质蛋白溶液。对于12个构造，需要2.4mL的基底膜基质蛋白溶液。准备 10% 的额外解决方案（例如，2.6 mL）。
2. 对于每批新批次/批次的基底膜基质蛋白溶液，优化稀释比。首次测试稀释比为1:10、1:20、1:40，以找到产生细胞图案最佳品质的稀释比。
   注:如果基底膜基质蛋白溶液太粘稠，它会在模具顶部形成凝胶，在去除模具时更容易脱落。如果蛋白质溶液流动性过高，它会穿透模具的图案孔，从而导致质量差的图案。
3. 用冰冷Dulbecco的改良鹰中/营养混合物F-12（DMEM/F12）介质或1x PBS到上述优化稀释比的冰上稀释基膜基质蛋白储存溶液。例如，在 2.4 mL DMEM/F12 介质 （1:20） 中稀释 120 μL 的库存溶液，并保留冰块供以后使用。

7. 水凝胶制造

1. 将紫外线工作台灯（365 nm、4 mW/cm^2）放入生物安全罩中。
2. 将消毒石蜡薄膜从步骤 3.2 放置，在无菌条件下完全干燥。如果石蜡薄膜未完全干燥，请使用真空吸入系统去除任何残留液体。使用自风化钳将步骤 3.1 中的六个自封片片放在每个石蜡薄膜上。
3. 通过在50 mL聚丙烯离心管中稀释5%光子反应器溶液（步骤5.2），制备UV-可交联聚丙烯前体溶液（步骤5.2）。对于5 mL的UV可交聚丙烯酰胺前体溶液，在5 mL聚丙烯酰胺前体溶液中加入50μL的5%光分光剂溶液。
4. 使用 50 mL 过滤单元（孔径为 0.22 μm 孔）从步骤 7.3 过滤前体溶液，用于灭菌。
   注:始终准备新鲜的前体溶液。
5. 从石蜡拍摄的培养皿中每个 22 x 22 mm 玻璃盖板上从步骤 7.4 中分配 200 μL 的聚丙烯酰胺前体溶液，并在顶部小心地盖上另一个 22 x 22 mm 玻璃盖玻片，将溶液夹在中间（图 3A）。
   注:石蜡薄膜用于避免溢出和将前体溶液限制在盖玻片之间。
6. 将含盖玻片的培养皿从步骤 7.5 放在 UV 工作台灯下，将聚丙烯酰胺水凝胶进行光聚合 5 分钟（图 3B）。
   注:如果表面为非白色，则表面的紫外线吸收性会降低光交联效率。白纸在非白色表面上的覆盖对于将紫外线强度损失降至最低非常重要。为防止紫外线辐射，请用铝箔盖住灯并佩戴防紫外线护目镜。
7. 小心地通过杠杆操作将一个盖从另一个盖上滑走（图3C）。
   注:水凝胶通常粘在顶盖玻片上。从软水凝胶上分离盖玻片时，应格外注意，因为它可能会断裂。
8. 用PBS填充一次性聚丙烯储液罐。将含PBS储液罐中的水凝胶 覆盖层复合材料转移到PBS中冲洗5分钟。洗完后，将水凝胶结构放回 Petri 盘中的石蜡薄膜上。

8. 蛋白质结合

1. 准备一个冰桶和预冷的PBS。
   注:对于六个水凝胶，需要 1，200 μL 的冷 PBS。
2. 拿出磺胺-SANPAH等位（1小瓶= 6个凝胶）。
   注:如有必要，优化后可以减少使用的硫磺-SANPAH量。
3. 将 1，200 μL 的冷 PBS 加入一小瓶磺胺-SANPAH 等位，并通过上下移液混合。
4. 在Petri盘的石蜡薄膜上分配200μL的磺胺-SANPAH，用水凝胶覆盖物覆盖复合材料，用水凝胶接触磺胺-SANPAH（图3D）。
   注:由于水解，Sulfo-SANPAH非常容易受到水的影响。使用前从-80°C新鲜解冻。请勿重复使用或重新冻结任何剩剩。
5. 将水凝胶暴露在 365 nm、4 mW/cm²的紫外线灯上 5 分钟，以激活磺胺-SANPAH。
   注:曝光后，硫化物-SANPAH将从橙色变为棕色（图3E）。如果水凝胶变为棕色，则表明硫酸盐-SANPAH苯基子德组成功激活，并将磺胺-SANPAH加入水凝胶。在最多 10 分钟内直接执行步骤 8.6_8.9，因为磺胺-SANPAH 的活动将下降。
6. 用新鲜的PBS补充一次性聚丙烯储液罐。硫化物-SANPAH激活后，转移活性水凝胶，并迅速冲洗PBS储液罐中的水凝胶，以去除未结合的硫磺-SANPAH。
   注:长时间洗涤会导致蛋白质结合效率低。
7. 快速冲洗后，将水凝胶连接的盖玻片放在培养皿中，并用无菌无绒湿巾小心地涂抹水凝胶。
   注:水凝胶顶部的剩余PBS会导致基底膜基质蛋白溶液通过模具泄漏，如果干燥过于广泛，会导致由于对模具的依从性过高而去除模具后水凝胶破裂。
8. 将模具放在水凝胶的顶部，并用无抗绒湿巾涂抹，以确保模具和水凝胶之间的密封紧密（图3F）。
9. 小心地在顶部分配从步骤 6.3（图 3G）制备的稀释基底膜基质蛋白溶液的 200 μL。在培养箱（37°C）中过夜。
   注:当模具-水凝胶接触紧密，基底膜基质蛋白溶液浓度最佳时，基底膜基质蛋白溶液将被隔离并留在模具顶部（图3H）。优化后可缩短孵化时间。从理论上讲，它可以减少到30分钟~2小时。
10. 第二天，将水凝胶转移到6个井板，并完全浸入PBS中。
    注:建议在盖玻片上剥离带有PBS浸入的模具，以防止水凝胶撕裂和粘附在模具上。
11. 小心地使用自切化的钳子去除模具，而不会撕裂水凝胶。使用 DMEM 重新挂起，将图案水凝胶返回到培养箱，并过夜以测试任何污染。
12. 如果介质保持清晰，水凝胶已准备好用于细胞电镀。优化细胞电镀密度和孵育时间，允许细胞粘附用于各自的应用。
    注:对于hiPSC-CM的单细胞模式，种子和孵育过夜。以下细胞数推荐用于播种:30，000、60，000 和 90，000 个细胞/井。种子太多单元格会导致每个模式多个单元格。建议在细胞播种前进行细胞滤网，以应变出非单细胞。
13. 第二天，观察细胞的依恋和扩散，并改变介质，摆脱分离的细胞。

9. 清洁用过的模具

1. 要去除所用模具上的残余基质蛋白，在37°C下将模具浸入酶溶液（材料表）中10分钟。
   注:应根据所使用的基质蛋白选择酶。对于富含胶原蛋白的基质蛋白溶液，请使用胶原蛋白酶。还建议在酶溶液中进行10~15分钟的超声波分析。
2. 吸气溶液，并补充10%的漂白剂。在室温下孵育10分钟。
3. 用 PBS 冲洗 3 倍。
4. 在4°C下储存70%乙醇，直到使用。

结果

已演示了包含正方形或矩形数组的模具的制造（图 4A）。按照该协议，我们获得了图案矩阵蛋白岛（图4B和图5A）和细胞（图4C）。次优基质蛋白溶液浓度导致模式不理想（图5B）。使用模具的前侧至关重要。如果使用模具的背面，则基质蛋白岛的大小会随着激光切割的方向而增加（

讨论

我们描述了一种基于光刻模具的微模式方法，该方法能够有效地对粘附细胞进行模式化。在该协议中，我们演示了不同长度-宽度比的hiPSC-CM模式，通过在聚丙烯酰胺水凝胶上微模式基底膜基质蛋白岛进行生理或病理相关组织刚度或硅基弹性体基质。这种方法相对简单，对于任何研究人员，包括那些在光刻和微制造技术方面几乎没有背景的研究人员来说，都很容易获得。所述方法规避了使用软光刻?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning