Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Zusammenfassung

Mikromustertechniken wurden in der Zellbiologie weit verbreitet, um die Auswirkungen der Kontrolle der Zellform und -größe auf die Bestimmung des Zellschicksals bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Aktuelle, hochmoderne Einzelzell-Mikromustertechniken beinhalten weiche Lithographie und Mikrokontaktdruck, eine leistungsfähige Technologie, erfordert jedoch geschulte Ingenieurskunst und eine gewisse Unterstützung in der Mikrofertigung. Diese Einschränkungen erfordern eine leichter zugängliche Technik. Hier beschreiben wir eine einfache alternative lithographiefreie Methode: schablonenbasierte Einzelzellmusterung. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Verfahren wie Schablonendesign, Polyacrylamid-Hydrogel-Fertigung, Schablonen-basierte Protein-Inkorporation, zell-plating und Kultur. Diese einfache Methode kann verwendet werden, um ein Array von bis zu 2.000 Zellen zu modellieren. Wir zeigen die Musterung von Kardiomyozyten, die aus einzelnen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit unterschiedlichen Zellformen abgeleitet werden, von einem 1:1-Quadrat bis zu einem 7:1-Erwachsenen-Kardiomyozyten-ähnlichen Rechteck. Diese schablonenbasierte Einzelzellmusterung ist lithographiefrei, technisch robust, bequem, kostengünstig und vor allem für Personen mit eingeschränktem Bioengineering-Hintergrund zugänglich.

Einleitung

Das Aufkommen von hiPSCs und die anschließende Entwicklung von Protokollen für ihre gezielte Differenzierung in verschiedene Zelltypen haben es ermöglicht, Entwicklung und Krankheit auf molekularer und patientenspezifischer Ebene zu untersuchen, insbesondere mit patientenabgeleiteten iPSC-Kardiomyozyten (iPSC-CMs) zur Modellierung von Kardiomyopathien^1,2. Eine wesentliche Einschränkung für das Studium der Entwicklung und Physiologie mit dem iPSC-System und anderen In-vitro-Modellen ist jedoch das Fehlen einer strukturierten Mikroumgebung. In situ werden Zellen den Einschränkungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie benachbarten Zellen unterworfen. Die besondere biochemische Zusammensetzung und Steifigkeit dieser Mikroumgebungen bestimmen die räumliche Verteilung der Zellen sowie die verfügbaren Faktoren für die Zellhaftung. Dies wiederum beeinflusst intrazelluläre Signalwege, Genexpression und Zellschicksalsbestimmung. Zum Beispiel hat mikrogemusterte iPSC-CM in einer erwachsenen-ähnlichen Stabform eine deutlich bessere Kontraktilität, Kalziumfluss, mitochondriale Organisation, Elektrophysiologie und Quer-Tubule-Bildung³. Somit sind die Eigenschaften der Mikroumgebung integraler Bestandteil der Regulierung zellulärer Funktionen.

Frühere Mikromustertechniken stützten sich stark auf die Photolithographie (Abbildung 1A). Bei dieser Technik wird eine Schicht aus lichtempfindlichem Polymer oder Photoresist auf einem flachen Substrat aus der Lösung gesponnen, um einen dünnen Film zu bilden, der etwa 1 m dick ist. Als nächstes wird ultraviolettes (UV) Licht durch eine Maske, die das gewünschte Muster enthält, auf den Photoresist aufgetragen. Die Exposition gegenüber ultraviolettem (UV) Licht verändert den Photowiderstand chemisch, indem er seine Löslichkeit in der jeweiligen Entwicklerlösung ändert und das gewünschte Muster von der Maske auf das Substrat überträgt. Viele Mikromustermethoden beinhalten photolithographie, da sie Nanometer-Mikrometer-Ebene Kontrolle über die Gestaltung der Zellmuster verleiht. Das Spinnen des Photoresists ist jedoch sehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen, da die kleinsten Staubpartikel die Ausbreitung der Lösung in einen dünnen Film stören. Die Photolithographie muss daher in nicht kontaminierten Anlagen durchgeführt werden, die kostspielig zu warten sind und besondere Fachkenntnisse erfordern. Darüber hinaus sind die in der Photolithographie verwendeten Chemikalien oft toxisch für Zellen und können wichtige Biomoleküle denaturieren. Die Photolithographie stellt somit erhebliche Hindernisse für die Herstellung von Mikromustern für bequeme biologische Anwendungen dar.

1994 meisterte Whitesides und Kollegen⁴ einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Photolithographie, indem sie eine Sammlung von Techniken namens Soft Lithographie voranbringen. In der weichen Lithographie wird eine mikrostrukturierte Oberfläche aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem transparenten, gummiähnlichen Material, verwendet, um ein Muster von ECM-Proteinen⁴zu erzeugen. Häufige Soft-Lithographie-Techniken umfassen Mikrokontaktdruck und mikrofluidische Musterung. Im Mikrokontaktdruck, der derzeit beliebtesten Softlithographie-Methode, überträgt ein mit ECM-Proteinen beschichteter PDMS-Stempel das Material auf eine Oberfläche an den durch den Stempel kontaktierten Bereichen (Abbildung 1B). In der mikrofluidischen Musterung werden Mikrostrukturen auf einer PDMS-Oberfläche so konstruiert, dass beim Drücken des Stempels auf ein Substrat ein Netzwerk von Mikrokanälen entsteht, durch das Flüssigkeiten in gewünschte Bereiche geliefert werden können (Abbildung 1C)⁵. Weiche Lithographie bietet mehrere Vorteile gegenüber der Photolithographie. Sobald ein Master-Wafer mikrofabriziert ist, können die PDMS-Stempel ohne weiteren Einsatz von Reinraumanlagen einfach repliziert werden. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen organischer Lösungsmittel im Prozess der weichen Lithographie die Verwendung von polymeren Materialien wie Polystyrol, das typischerweise in der Zellkultur verwendet wird. Schließlich ist die Mikromusterung mit weichen lithographischen Methoden nicht auf flache Oberflächen beschränkt. So erhöht die weiche Lithographie die Zugänglichkeit und Funktionalität der Mikromusterfertigung gegenüber der Photolithographie⁶. Die weiche Lithographie hat jedoch erhebliche Nachteile. Zum Beispiel ist ein erster Ätzschritt mit Hilfe der Photolithographie immer noch erforderlich, um den Stempel mikrofabrizieren zu können. Darüber hinaus unterliegt die Mikromusterung mit einem PDMS-Stempel Schwankungen in der Qualität des Proteintransfers auf das Substrat⁶. Um diese Diskrepanzen zu vermeiden, ist eine Optimierung und Konsistenz des Drucks erforderlich, der während des Proteintransfers auf den PDMS-Stempel ausgeübt wird, da sonst Verformungen und Verzerrungen der Merkmalsgrößen der PDMS-Formen auftreten können⁶. Es gibt auch ein großes Problem der wiederholten Verwendung des PDMS aufgrund der kleinen Molekülabsorption⁷.

Um die Verwendung weicher Photolithographie und PDMS-Stempel zu vermeiden, beschreiben wir eine schablonenbasierte, lithographiefreie Einzelzell-Mikromustermethode, die viele der Hindernisse im Zusammenhang mit Photolithographie und weicher Lithographie überwindet. Bei diesem Verfahren wird ein Polyacrylamidhydrogel als Substrat für die Verwendung von ECM-Protein auf Schablonenbasis verwendet, was eine selektive Beschichtung einzelner hiPSC-CMs ermöglicht. Diese Technik ist hochkompatibel mit polymeren Materialien, die in klassischen Zellkulturbedingungen verwendet werden. Darüber hinaus sind die Schablonen bei ordnungsgemäßer Reinigung und Wartung wiederverwendbar und resistent gegen Abbau und Proteinabsorption während des Mikroherstellungsprozesses. Schließlich ist der Musterprozess technisch robust, kostengünstig, anpassbar und zugänglich für diejenigen ohne spezialisierte Bioengineering-Fähigkeiten. Diese schablonenbasierte Mikromustertechnik wurde in unseren jüngsten Veröffentlichungen zur Modellierung verschiedener Kardiomyopathien^8,9,10breite Nutzungen erzielt.

Protokoll

1. Herstellung von Polyimid-basierten Schablonen auf Negativmuster

1. Generieren Sie ein Muster(Abbildung 2A) im .dxf-Format mit computergestützter Designsoftware (z. B. AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
   1. Generieren Sie einen Kreis (Durchmesser = 22 mm), um den Rahmen der Schablone abzugrenzen.
   2. Zeichnen Sie eine volumengefüllte Form oder das gewünschte Muster.
   3. Fügen Sie einen chiralen Buchstaben (z. B. R) ein, um die Vorderseite der Schablonen zu markieren.
      HINWEIS: Als Beispiel wird ein Array von Quadraten und Rechtecken generiert, um iPSC-CMs auf Einzelzellen- und Zellpaarebene zu mustern. Die Entwurfsdateien sind verfügbar (siehe Ergänzungsdateien). Die Auflösungsgrenze für die Mikrofertigung liegt bei 10 m.
2. Reichen Sie das Design an ein Mikrofabrikationsunternehmen an lasergeschnittene Polyimidfolie und herstellung Schablonen(Abbildung 2B,C).

2. Herstellung von Sulfo-SANPAH-Aliquots

HINWEIS: Das Protokoll wird von Fischer et al.¹¹geändert.

1. Verwenden Sie eine feuchtigkeitsbeständige Karton-Probenaufbewahrung (z.B. 100 Brunnen, 10 x 10 Plätze für Zentrifugenrohre, Maße: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Beschriften Sie es mit "Name/Datum/Sulfo-SANPAH 40 l/rekonstituiert mit 1.200 l PBS".
2. Etikettieren Sie 50 Mikrozentrifugenrohre (Polypropylen, 1,5 ml) mit einem "S" auf dem Deckel.
3. Nehmen Sie 4 ml wasserfreies, extra trockenes Dimethylsulfoxid (DMSO) und steriles Filtern der Lösung mit einer Membranfiltereinheit (Porengröße = 0,22 m) in ein steriles 15 ml konisches Rohr.
4. Bereiten Sie ein flüssiges Stickstoffbad vor und decken Sie es mit dem Deckel ab, um die Verdunstung des flüssigen Stickstoffs zu minimieren.
5. 50 mg Sulfo-SANPAH in 2 ml des gefilterten DMSO auflösen.
6. Vortex gut, um die Sulfo-SANPAH im DMSO vollständig aufzulösen.
7. Verteilen Sie 40 L Aliquots der Sulfo-SANPAH-Lösung in sterile 1,5 ml-Rohre.
8. Übertragen Sie die Rohre in die Box.
9. Flash-Freeze die Rohre in flüssigem Stickstoff für 5 min.
10. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 °C auf.
    HINWEIS: Die Aliquots können bis zu 6 Monate ohne Verminderung der Effizienz verwendet werden. Die Sulfat-SANPAH-Konzentration beträgt 25 mg/ml oder 50,77 mM.

3. Sterilisation von Werkzeugen

1. Autoklav zwei Zangen, 24 Glasabdeckungen (22 x 22 mm, Nr. 1 oder Nr. 1.5), eine Rasierklinge und drei fusselfreie Saugtücher.
   HINWEIS: Für die Herstellung von 12 Hydrogel-Konstrukten werden 24 Glasabdeckungen benötigt. Pro Konstrukt sollte es zwei Deckellipsen geben. Es ist ratsam, einige Ersatz-Coverlips vorzubereiten.
2. Legen Sie zwei Teile Paraffinfolie (4 x 4 Zoll) in eine ethanolresistente Kunststoffbox (z. B. eine 1.000 l Pipettenspitzenbox) und sterilisieren Sie sie in frischem 70% Ethanol für mindestens 15 min.

4. Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogel-Vorläuferlösung

HINWEIS: Das Protokoll wird von Lee et al.¹²geändert.

1. 125 mg Aminoethylmethacrylat (AEM) in 36,25 ml entionisiertem Wasser in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenrohr durch Wirbeln auflösen.
2. Zur Zubereitung von 50 ml 10 kPa Polyacrylamid-Vorläuferlösung (8–0,15–15 mM) 10 ml 40% Acrylamidlösung, 3,75 ml 2% Bis-Acrylamid-Lösung und 36,25 ml der in Schritt 4.1 hergestellten AEM-Lösung in einem neuen 50 ml Polypropylenzentrifugerohr zu mischen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration der Vorläuferlösung beträgt 8% Acrylamid, 0,15% Bis-Acrylamid und 15 mM AEM, die durch Atomkraftmikroskopie mit einer Steifigkeit von 10 kPa gemessen wurde. Je nach Gewebeanwendungen kann die Steifigkeit des Hydrogels durch Änderung des Verhältnisses von 40% Acrylamid zur 2% Bis-Acrylamid-Lösung verändert werden. Beispielsweise ergibt 8% Acrylamid–0,08% Bis-Acrylamid-Lösung 3 kPa Hydrogele; 8% Acrylamid–0,48% Bis-Acrylamid-Lösung ergibt 38 kPa Hydrogele; 8% Acrylamid–0,48% Bis-Acrylamid-Lösung ergibt 60 kPa Hydrogele. Es ist ratsam, die Steifigkeit von Hydrogelen aus den Vorläuferlösungen mit veränderten Verhältnissen zu bestätigen.

5. Vorbereitung der Photoinitiatorlösung

1. Bei 1 ml 5% Photoinitiatorlösung zunächst 50 mg 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenonpulver in 700 l 100% Ethanol in einem 1,5 ml Polypropylen-Zentrifugenrohr mit Deckel auflösen.
   HINWEIS: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon ist in Wasser nicht löslich. Achten Sie darauf, das Pulver in Ethanol durch Wirbel vollständig aufzulösen.
2. Nach vollständiger Auflösung des 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon in Ethanol durch Wirbeln 300 l Phosphatgepufferte Saline (PBS) für ein Endvolumen von 1 ml hinzufügen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration von 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon-Lösung beträgt 5%. Die vereitelte 5% Photoinitiatorlösung ist 4 Wochen bei 4 °C gut.

6. Herstellung der Kellermembran-Matrix-Proteinlösung

HINWEIS: Die Kellermembranmatrix (Tabelle der Materialien) ist ein temperaturempfindliches Material. Achten Sie darauf, auf Eis mit gekühlten Pipettenspitzen und Rohren sowie eiskalten Lösungen zu arbeiten. Ein neuer Bestand an Kellermembranmatrix sollte über Nacht bei 4 °C langsam auf eiskalt aufgetaut werden.

1. Bereiten Sie 200 L Kellermembran-Matrix-Proteinlösung pro Hydrogel-Konstrukt vor. Für 12 Konstrukte werden 2,4 ml Kellermembran-Matrix-Proteinlösung benötigt. Bereiten Sie 10% zusätzliche Lösung (z. B. 2,6 ml).
2. Optimieren Sie für jede neue Charge/Charge von Kellermembran-Matrix-Protein-Lösung das Verdünnungsverhältnis. Testen Sie zum ersten Mal Verdünnungsverhältnisse von 1:10, 1:20, 1:40, um das Verdünnungsverhältnis zu finden, das die besten Qualitäten für die Zellmusterung liefert.
   HINWEIS: Wenn die Kellermembran-Matrix-Proteinlösung zu zähflüssig ist, bildet sie ein Gel auf der Oberseite der Schablone, und es ist wahrscheinlicher, dass sie sich beim Entfernen der Schablone abzieht. Wenn die Proteinlösung zu flüssig ist, dringt sie durch die Musterlöcher der Schablonen ein, was zu schlechter Qualität führt.
3. Verdünnung der Kellermembran-Matrix-Protein-Stammlösung auf Eis mit eiskaltem Dulbecco es Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Medium oder 1x PBS bis zum oben optimierten Verdünnungsverhältnis. Verdünnen Sie z. B. 120 l der Stammlösung in 2,4 ml DMEM/F12-Medien (1:20) und halten Sie für die spätere Verwendung auf Eis.

7. Hydrogel-Fertigung

1. Legen Sie eine UV-Tischleuchte (365²nm, 4 mW/cm2 ) in eine biologische Sicherheitshaube.
2. Die sterilisierten Paraffinfolien ab Schritt 3.2 aufstellen und unter sterilen Bedingungen vollständig trocknen. Wenn die Paraffinfolien nicht vollständig trocken sind, verwenden Sie ein Vakuum-Aspirationssystem, um Restflüssigkeit zu entfernen. Platzieren Sie sechs autoklavierte Abdeckungen aus Schritt 3.1 auf jeder Paraffinfolie mit den autoklavierten Zangen.
3. Bereiten Sie UV-verklinkbare Polyacrylamid-Vorläuferlösung durch Verdünnung von 5% Photoinitiatorlösung (Schritt 5.2) mit Polyacrylamid-Vorläuferlösung (Schritt 4.2) in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenrohr vor. Für 5 ml UV-verklinkbare Polyacrylamid-Vorläuferlösung 50 l 5% Photoinitiatorlösung zu 5 ml Polyacrylamid-Vorläuferlösung hinzufügen.
4. Filtern Sie die Vorläuferlösung aus Schritt 7.3 mit einer 50 ml Filtereinheit mit einer Porengröße von 0,22 m für die Sterilisation.
   HINWEIS: Bereiten Sie immer frische Vorläuferlösung vor.
5. 200 l Polyacrylamid-Vorläuferlösung ab Schritt 7,4 auf jeden 22 x 22 mm Glasdeckel in die paraffingefilmte Petrischale geben und vorsichtig mit einem weiteren 22 x 22 mm Glasdeckel auf der Oberseite abdecken, um die Lösung dazwischen zu sandwichen (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Paraffinfolie wird verwendet, um Verschüttungen zu vermeiden und die Vorläuferlösung zwischen den Abdeckungen zu beschränken.
6. Legen Sie die abdeckungsbefestige Petrischale ab Schritt 7.5 unter die UV-Tischleuchte und photopolymerisieren Sie die Polyacrylamid-Hydrogele für 5 min(Abbildung 3B).
   HINWEIS: Wenn die Oberfläche nicht weiß ist, reduziert die UV-Absorption der Oberfläche die Photocrosslinking-Effizienz. Die Abdeckung von weißem Papier auf der nicht-weißen Oberfläche ist wichtig, um den UV-Intensitätsverlust zu minimieren. Um vor UV-Strahlung zu schützen, bedecken Sie die Lampe mit Aluminiumfolie und tragen Sie eine UV-Schutzbrille.
7. Trennen Sie vorsichtig eine Abdeckung rutschen von der anderen mit einer Rasierklinge durch Hebelwirkung (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Das Hydrogel klebt in der Regel am oberen Deckelschlupf. Achten Sie beim Lösen des Deckels vom weichen Hydrogel besonders auf, da er wahrscheinlich bricht.
8. Füllen Sie ein Einweg-Polypropylen-Reservoir mit PBS. Übertragen Sie die Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe in einem PBS-haltigen Reservoir, um die Hydrogele in PBS für 5 min zu spülen. Nach dem Spülen das Hydrogelkonstrukt wieder auf den Paraffinfilm in die Petrischale legen.

8. Proteinkonjugation

1. Bereiten Sie einen Eiskübel und vorcoolen PBS vor.
   HINWEIS: Für sechs Hydrogele werden 1.200 l kalte PBS benötigt.
2. Nehmen Sie den Sulfo-SANPAH aliquot (1 Durchstechflasche = 6 Gele) heraus.
   HINWEIS: Bei Bedarf kann die Menge an sulfo-SANPAH nach der Optimierung reduziert werden.
3. Fügen Sie 1.200 l kalte SPBS in eine Durchstechflasche mit Sulfo-SANPAH-Aliquot und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten.
4. 200 l Sulfo-SANPAH auf die Paraffinfolie in der Petrischale geben und mit dem Hydrogel-Deckel-Verbundwerkstoff mit Hydrogel-Kontakt sulfo-SANPAH abdecken (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Sulfo-SANPAH ist aufgrund der Hydrolyse sehr anfällig für Wasser. Frisch auftauen von -80 °C direkt vor Gebrauch. Verwenden oder fixieren Sie keine Reste.
5. Setzen Sie das Hydrogel der UV-Lampe bei 365 nm, 4 mW/cm² für 5 min aus, um Sulfo-SANPAH zu aktivieren.
   ANMERKUNG: Nach der Exposition wechselt das Sulfo-SANPAH von orange auf braun (Abbildung 3E). Wenn das Hydrogel braun wird, weist es auf eine erfolgreiche Aktivierung der Phenylazidgruppe von Sulfo-SANPAH und die Aufnahme von Sulfo-SANPAH in das Hydrogel hin. Fahren Sie direkt mit den Schritten 8.6-8.9 innerhalb von maximal 10 min fort, da die Aktivität von Sulfo-SANPAH abnehmen wird.
6. Füllen Sie ein Einweg-Polypropylen-Reservoir mit frischem PBS auf. Übertragen Sie nach der Sulfo-SANPAH-Aktivierung die aktivierten Hydrogele und spülen Sie die Hydrogele schnell in ein PBS-Reservoir, um ungebundenes Sulfo-SANPAH zu entfernen.
   HINWEIS: Eine lange Wäsche kann zu einer geringen Proteinkonjugationseffizienz führen.
7. Nach einer schnellen Spülung die hydrogelbefestigten Deckel auf den Paraffinfilm in die Petrischalen legen und die Hydrogele vorsichtig mit sterilen fusselfreien Tüchern abstreifen.
   HINWEIS: Die verbleibende PBS auf der Oberseite des Hydrogels führt zu Leckagen der Kellermembran-Matrix-Proteinlösung durch die Schablone, und eine zu umfangreiche Trocknung führt zu einem Bruch des Hydrogels bei Entfernung der Schablone aufgrund zu hoher Haftung an der Schablone.
8. Legen Sie die Schablone auf die Hydrogele und tumeln Sie mit autoklavierten fusselfreien Tüchern, um eine enge Abdichtung zwischen Derschablone und Hydrogel zu gewährleisten (Abbildung 3F).
9. Geben Sie die aus Schritt 6.3 (Abbildung 3G) hergestellte verdünnte Kellermembran-Matrix-Proteinlösung sorgfältig 200 l der verdünnten Kellermembran-Matrix-Proteinlösung oben auf. Über Nacht im Inkubator (37 °C) lassen.
   HINWEIS: Wenn der Schablonen-Hydrogel-Kontakt fest ist und die Konzentration der Kellermembran-Matrix-Proteinlösung optimal ist, wird die Proteinlösung der Kellermembran-Matrix-Proteinlösung sequestriert und bleibt auf der Schablone (Abbildung 3H). Die Inkubationszeit kann bei der Optimierung reduziert werden. Theoretisch kann er auf 30 min–2 h reduziert werden.
10. Am nächsten Tag die Hydrogele auf eine 6 Brunnenplatte übertragen und vollständig in PBS eintauchen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Schablone mit PBS-Eintauchen über den Deckelzuschlag abzuziehen, um das Reißen und Kleben des Hydrogels an der Schablone zu verhindern.
11. Entfernen Sie die Schablone vorsichtig mit einer autoklavierten Pinzette, ohne das Hydrogel zu zerreißen. Setzen Sie die gemusterten Hydrogele mit DMEM gut aus, bringen Sie sie zurück und lassen Sie sie über Nacht auf Verunreinigungen testen.
12. Bleibt das Medium frei, sind die Hydrogele für die Zellbeschichtung bereit. Optimieren Sie die Zellbeschichtungsdichte und Inkubationszeit, um die Haftung der Zellen für die jeweilige Anwendung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Für die Einzelzellmusterung von hiPSC-CMs, Samen und Inkubation über Nacht. Die folgenden Zellnummern werden für die Aussaat empfohlen: 30.000, 60.000 und 90.000 Zellen/Well. Das Aussäen zu vieler Zellen führt zu mehr als einer Zelle pro Muster. Ein Zellsieb wird empfohlen, nicht einzelne Zellen vor dem Aussäen der Zelle auszudehnen.
13. Beobachten Sie am nächsten Tag die Zellanhaftung und -verteilung, und ändern Sie die Medien, um losgelöste Zellen loszuwerden.

9. Reinigung der verwendeten Schablonen

1. Um Restmatrixproteine auf den verwendeten Schablonen zu entfernen, tauchen Sie die Schablonen 10 min bei 37 °C in Enzymlösung (Materialtabelle) unter.
   HINWEIS: Das Enzym sollte in Abhängigkeit von den verwendeten Matrixproteinen ausgewählt werden. Für kollagenreiche Matrixproteinlösung verwenden Sie Kollagennase. Eine 10-15 min Ultraschallin in Enzymlösung wird ebenfalls empfohlen.
2. Die Lösung ansaugen und mit 10% Bleichmittel auffüllen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. 3x mit PBS abspülen.
4. 70% Ethanol bei 4 °C bis zum Gebrauch aufbewahren.

Ergebnisse

Die Herstellung von Schablonen, die ein Array von Quadraten oder Rechtecken enthalten, wurde demonstriert (Abbildung 4A). Nach diesem Protokoll erhielten wir gemusterte Matrixproteininseln (Abbildung 4B und Abbildung 5A) und Zellen (Abbildung 4C). Die suboptimale Matrixproteinlösungskonzentration führte zu suboptimalen Mustern (Abbildung 5B). Es ist wichtig, die Vordersei...

Diskussion

Wir beschreiben eine lithographiefreie, schablonenbasierte Mikromustermethode, die eine effektive Musterung von anhaftenden Zellen ermöglicht. In diesem Protokoll zeigen wir die Musterung von hiPSC-CMs in unterschiedlichen Längen-Breiten-Verhältnissen durch Mikromusterung von Kellermembran-Matrix-Proteininseln auf Polyacrylamid-Hydrogelen mit physiologisch- oder pathologisch relevanten Gewebesteifigkeiten oder siliziumbasierten Elastomersubstraten. Diese Methode ist relativ einfach und für alle Forscher sehr zugängl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning