Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

Resumen

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Resumen

Las técnicas de micropatrón se han utilizado ampliamente en la biología celular para estudiar los efectos del control de la forma y el tamaño de las células en la determinación del destino celular a una sola resolución de celda. Las técnicas actuales de micropatrón de una sola célula de última generación implican litografía suave e impresión de microcontacto, que es una tecnología poderosa, pero requiere habilidades de ingeniería entrenadas y cierto soporte de instalaciones en microfabricación. Estas limitaciones requieren una técnica más accesible. Aquí, describimos un método simple y libre de litografía alternativo: patrón de células únicas basado en plantillas. Proporcionamos procedimientos paso a paso que incluyen diseño de plantillas, fabricación de hidrogel de poliacrilamida, incorporación de proteínas a base de plantillas y chapado y cultivo celular. Este método simple se puede utilizar para patrones de una matriz de hasta 2.000 celdas. Demostramos el patrón de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos únicos (hiPSC) con formas celulares distintas, de un cuadrado 1:1 a un rectángulo adulto similar a 7:1. Este patrón de una sola célula basado en plantillas es libre de litografía, técnicamente robusto, conveniente, barato y, lo que es más importante, accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado.

Introducción

La llegada de los hiPSC y el posterior desarrollo de protocolos para su diferenciación dirigida en diferentes tipos de células han hecho posible el estudio del desarrollo y la enfermedad a nivel molecular y específico del paciente, utilizando específicamente cardiomiocitos iPSC derivados del paciente (iPSC-CM) para modelar cardiomiopatías^1,,2. Sin embargo, una limitación importante para estudiar el desarrollo y la fisiología utilizando el sistema iPSC y otros modelos in vitro es la ausencia de un microambiente estructurado. In situ, las celdas se someten a las restricciones de la matriz extracelular (ECM), así como de las celdas vecinas. La composición bioquímica particular y la rigidez de estos microambientes dictan la distribución espacial de las células, así como los factores disponibles para participar en la adhesión celular. Esto, a su vez, influye en las vías de señalización intracelular, la expresión génica y la determinación del destino celular. Por ejemplo, el iPSC-CM micropatrónizado en una forma de varilla similar a un adulto tiene una capacidad contráctile, flujo de calcio, organización mitocondrial, electrofisiología y formación de túbulos^{transversales 3.} Por lo tanto, las propiedades del microambiente son integrales en la regulación de las funciones celulares.

Las técnicas anteriores de micropatrones se basaban en gran medida en la fotolitografía(Figura 1A). En esta técnica, una capa de polímero fotosensible, o fotorresistente, se hila sobre un sustrato plano de la solución para formar una película delgada de aproximadamente 1 m de espesor. A continuación, la luz ultravioleta (UV) se aplica sobre el fotorresistente a través de una máscara que contiene el patrón deseado. La exposición a la luz ultravioleta (UV) altera químicamente el fotorresistente modificando su solubilidad en su respectiva solución de desarrollo, transfiriendo el patrón deseado de la máscara al sustrato. Muchos métodos de micropatrones incorporan fotolitografía, ya que confiere nanómetro al control a nivel de micrómetro sobre el diseño de los patrones celulares. Sin embargo, el giro del fotorresistente es muy sensible a las impurezas, ya que las partículas de polvo más pequeñas interrumpirán la propagación de la solución en una película delgada. Por lo tanto, la fotolitografía debe llevarse a cabo en instalaciones no contaminadas, que son costosas de mantener y requieren conocimientos especializados especiales para su uso. Además, los productos químicos utilizados en la fotolitografía son a menudo tóxicos para las células y pueden desnaturalizar biomoléculas importantes. Por lo tanto, la fotolitografía plantea obstáculos significativos a la fabricación de micropatrones para aplicaciones biológicas convenientes.

En 1994, Whitesides y sus colegas⁴ superaron algunos de los desafíos asociados con la fotolitografía al ser pioneros en una colección de técnicas llamadas litografía blanda. En la litografía blanda, se utiliza una superficie microestructurada hecha con polidimetilsiloxano (PDMS), un material transparente similar al caucho, para generar un patrón de proteínas ECM⁴. Las técnicas litográficas suaves comunes incluyen impresión de microcontacto sin patrones microfluídicos. En la impresión de microcontactos, actualmente el método litográfico suave más popular, un sello PDMS recubierto con proteínas ECM transfiere el material a una superficie en las áreas contactadas por el sello(Figura 1B). En el patrón microfluídico, las microestructuras se diseñan sobre una superficie PDMS de tal manera que cuando el sello se presiona a un sustrato, se crea una red de microcanales, a través de los cuales se pueden suministrar fluidos a las áreas deseadas (Figura 1C)⁵. La litografía suave ofrece varios beneficios sobre la fotolitografía. Una vez que una oblea maestra está microfabricada, los sellos PDMS se pueden replicar fácilmente sin más empleo de instalaciones de salas limpias. Además, la ausencia de disolventes orgánicos en el proceso de litografía blanda permite la utilización de materiales poliméricos como el poliestireno, normalmente utilizado en el cultivo celular. Por último, el micropatrón mediante métodos litográficos suaves no se limita a superficies planas. Por lo tanto, la litografía suave aumenta la accesibilidad y la funcionalidad de la fabricación de micropatrones sobre la fotolitografía⁶. Sin embargo, la litografía blanda tiene inconvenientes significativos. Por ejemplo, todavía se requiere un paso inicial de grabado, utilizando fotolitografía, para microfabricar el sello. Además, el micropatrón mediante un sello PDMS está sujeto a variaciones en la calidad de la transferencia de proteínas en el sustrato^6. Evitar estas discrepancias requiere optimización y coherencia en la presión aplicada al sello PDMS durante la transferencia de proteínas, de lo contrario la deformación y distorsión de los tamaños de entidad de los moldes PDMS pueden ocurrir⁶. También existe una gran preocupación de utilizar repetidamente PDMS debido a la absorción de moléculas pequeñas⁷.

Para evitar el uso de fotolitografías blandas y sellos PDMS, describimos un método de micropatrón de células únicas basado en plantillas y libre de litografía que supera muchos de los obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. En este método, un hidrogel de poliacrilamida se utiliza como sustrato para la incorporación de proteínas ECM a base de plantillas, lo que permite el chapado selectivo de hiPSC-CM únicos. Esta técnica es altamente compatible con materiales poliméricos utilizados en condiciones clásicas de cultivo celular. Además, con una limpieza y un mantenimiento adecuados, las plantillas son reutilizables y resistentes a la degradación y absorción de proteínas durante el proceso de microfabricación. Por último, el proceso de patrón es técnicamente robusto, económico, personalizable y accesible para aquellos que no tienen habilidades especializadas de bioingeniería. Esta técnica de micropatrón basada en plantillas ha sido ampliamente utilizada en nuestras publicaciones recientes modelando cardiomiopatías variadas^8,,9,10.

Protocolo

1. Fabricación de plantillas basadas en poliimida de patrón negativo

1. Genere un patrón(figura 2A) en formato .dxf utilizando software de diseño asistido por ordenador (por ejemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
   1. Genere un círculo (diámetro de 22 mm) para delinear el borde de la plantilla.
   2. Dibuje una forma llena de sólido o el patrón deseado.
   3. Incluya una letra quiral (por ejemplo, R) para marcar la parte frontal de las plantillas.
      NOTA: Por ejemplo, se genera una matriz de cuadrados y rectángulos para patrones iPSC-CM en niveles de una sola celda y de par de celdas. Los archivos de diseño están disponibles (consulte Archivos suplementarios). El límite de resolución de la microfabricación es de 10 m.
2. Envíe el diseño a una empresa de microfabricación para la película de poliimida cortada por láser y la fabricación de plantillas(Figura 2B,C).

2. Preparación de alícuotas sulfo-SANPAH

NOTA: El protocolo se modifica a partir de Fischer et al.¹¹.

1. Utilice una caja de almacenamiento de muestras de cartón resistente a la humedad (por ejemplo, 100 pozos, 10 x 10 espacios para tubos centrífugos, dimensiones: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Etiquetarlo como "nombre/fecha/sulfo-SANPAH 40 l/reconstituido con 1.200 ol de PBS".
2. Etiquetar 50 tubos de microcentrífuga (polipropileno, 1,5 ml) con una 'S' en la tapa.
3. Tomar 4 ml de sulfóxido de dimetil anhidro y extra seco (DMSO) y filtrar estérilmente la solución utilizando una unidad de filtro de membrana (tamaño de los poros a 0,22 m) en un tubo cónico estéril de 15 ml.
4. Preparar un baño de nitrógeno líquido y cubrir con la tapa para minimizar la evaporación del nitrógeno líquido.
5. Disolver 50 mg de sulfo-SANPAH en 2 ml del DMSO filtrado.
6. Vortex bien para disolver completamente el sulfo-SANPAH en el DMSO.
7. Distribuya alícuotas de 40 ml de la solución sulfo-SANPAH en tubos estériles de 1,5 ml.
8. Transfiera los tubos a la caja.
9. Congele los tubos en nitrógeno líquido durante 5 min.
10. Conservar las alícuotas a -80oC.
    NOTA: Las alícuotas se pueden utilizar durante un máximo de 6 meses sin una eficiencia disminuida. La concentración de sulfo-SANPAH de stock es de 25 mg/ml o 50,77 mM.

3. Esterilización de herramientas

1. Autoclave dos fórceps, 24 tapas de vidrio (22 x 22 mm, No. 1 o No. 1.5), una cuchilla de afeitar y tres toallitas absorbentes sin pelusas.
   NOTA: Para hacer 12 construcciones de hidrogel, se necesitan 24 tapas de vidrio. Debe haber dos tapas por construcción. Es aconsejable preparar algunos cubreobjetos de repuesto.
2. Coloque dos piezas de película de parafina (4 x 4 pulgadas) en una caja de plástico resistente al etanol (por ejemplo, una caja de punta de pipeta de 1.000 ml) y esterilizarlas en etanol fresco 70% durante al menos 15 minutos.

4. Preparación de la solución precursora de hidrogel de poliacrilamida

NOTA: El protocolo se modifica de Lee et al.¹².

1. Disolver 125 mg de metacrilato aminoetilo (AEM) en 36,25 ml de agua desionizada en un tubo centrífugo de polipropileno de 50 ml por vórtice.
2. Para preparar 50 ml de solución precursora de poliacrilamida de 10 kPa (8–0,15–15 mM), mezclar 10 ml de solución de acrilamida al 40%, 3,75 ml de solución de centrífuga de bis-acrilamida al 2% y 36,25 ml de la solución AEM preparada en el paso 4.1 en un nuevo tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
   NOTA: La concentración final de la solución precursora es del 8% de acrilamida, del 0,15% de bis-acrilamida y de 15 mM de AEM, que se midió para tener una rigidez de 10 kPa mediante microscopía de fuerza atómica. De acuerdo con las aplicaciones tisulares de interés, la rigidez del hidrogel se puede alterar cambiando la relación de la acrilamida del 40% a la solución de bis-acrilamida al 2%. Por ejemplo, la solución de acrilamida-0,08% bis-acrilamida del 8% produce hidrogeles de 3 kPa; 8% acrilamida–0.48% solución bis-acrilamida produce 38 kPa hidrogeles; 8% acrilamida–0.48% solución bis-acrilamida produce 60 kPa hidrogeles. Es aconsejable confirmar la rigidez de los hidrogeles hechos de las soluciones precursoras con relaciones alteradas.

5. Preparación de la solución fotoiniciador

1. Para 1 ml de solución fotoiniciador al 5%, disolver primero 50 mg de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa en 700 l de etanol 100% en un tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 ml con tapa.
   NOTA: 2-Hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa no es soluble en agua. Asegúrese de disolver completamente el polvo en etanol por vórtice.
2. Después de disolver completamente el 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa en etanol por vórtice, añadir 300 l de solución salina con fosfato (PBS) para un volumen final de 1 ml.
   NOTA: La concentración final de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa solución es 5%. La solución fotoiniciadora de 5% frustrada es buena durante 4 semanas a 4 oC.

6. Preparación de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano

NOTA: La matriz de membrana de sótano(Tabla de materiales)es un material sensible a la temperatura. Asegúrese de trabajar en hielo con puntas y tubos de pipeta refrigerados, así como soluciones heladas. Un nuevo stock de matriz de membrana del sótano debe descongelarse lentamente sobre hielo a 4 oC durante la noche.

1. Preparar 200 l de solución de proteína de matriz de membrana de sótano por construcción de hidrogel. Para 12 construcciones, se necesitan 2,4 ml de solución de proteína de matriz de membrana de sótano. Preparar una solución adicional al 10% (p. ej., 2,6 ml).
2. Para cada nuevo lote/lote de solución de proteína de matriz de membrana de sótano, optimice la relación de dilución. Por primera vez, pruebe las relaciones de dilución de 1:10, 1:20, 1:40 para encontrar la relación de dilución que produce las mejores cualidades para el patrón celular.
   NOTA: Si la solución de proteína de matriz de membrana del sótano es demasiado viscosa, formará un gel en la parte superior de la plantilla, y es más probable que se despegue al retirar la plantilla. Si la solución proteica es demasiado fluida, penetrará a través de los orificios de patrón de las plantillas, lo que resultará en patrones de mala calidad.
3. Diluir la solución de matriz de matriz de membrana del sótano en hielo con medios de mezcla de proteínas de águila modificada/nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco en hielo o 1x PBS a la relación de dilución optimizada arriba. Por ejemplo, diluir 120 l de la solución en stock en 2,4 ml de medios DMEM/F12 (1:20) y mantener en hielo para su uso posterior.

7. Fabricación de hidrogel

1. Coloque una lámpara de banco UV (365 nm, 4 mW/cm²) en una campana de seguridad biológica.
2. Coloque las películas de parafina esterilizadas del paso 3.2 y séquelas completamente en condiciones estériles. Si las películas de parafina no están completamente secas, utilice un sistema de aspiración al vacío para eliminar cualquier líquido residual. Coloque seis cubiertas autoclavedas de cada película de parafina usando los fórceps autoclavedos.
3. Preparar la solución precursora de poliacrilamida reticulable UV diluyendo la solución fotoiniciadora al 5% (paso 5.2) con solución precursora de poliacrilamida (paso 4.2) en un tubo centrífugo de polipropileno de 50 ml. Para 5 ml de solución precursora de poliacrilamida retilable por UV, añada 50 ml de solución fotoiniciador al 5% a 5 ml de solución precursora de poliacrilamida.
4. Filtre la solución precursora del paso 7.3 utilizando una unidad de filtro de 50 ml con un tamaño de poro de 0,22 m para la esterilización.
   NOTA: Prepare siempre una solución precursora fresca.
5. Dispensar 200 l de solución precursora de poliacrilamida del paso 7.4 en cada resbalón de cubierta de vidrio de 22 x 22 mm en la placa Petri filmada con parafina y cubrir cuidadosamente con otro cubredes de vidrio de 22 x 22 mm en la parte superior para emparedar la solución en el medio(Figura 3A).
   NOTA: La película de parafina se utiliza para evitar derrames y para limitar la solución precursora entre los cubreobjetos.
6. Coloque la placa Petri que contiene el revestimiento de cubierta del paso 7.5 debajo de la lámpara de banco UV y fotopolimerizar los hidrogeles de poliacrilamida durante 5 min(Figura 3B).
   NOTA: Si la superficie no es blanca, la absorbancia UV de la superficie reduce la eficiencia de fotocrosslinking. La cobertura del libro blanco en la superficie no blanca es importante para minimizar la pérdida de intensidad UV. Para protegerse de la radiación UV, cubra la lámpara con papel de aluminio y use gafas de protección UV.
7. Separe cuidadosamente una cubierta que se deslice de la otra usando una cuchilla de afeitar mediante la acción de apalancamiento(Figura 3C).
   NOTA: El hidrogel generalmente se pegará a la cubierta superior. Preste especial atención al separar el cubreobjetos del hidrogel blando, ya que es probable que se rompa.
8. Llene un depósito de polipropileno desechable con PBS. Transfiera los compuestos de hidrogel-coverslip en un depósito que contiene PBS para enjuagar los hidrogeles en PBS durante 5 min. Después de enrestar, coloque la construcción de hidrogel de nuevo en la película de parafina en el plato Petri.

8. Conjugación de proteínas

1. Prepare un cubo de hielo y preenfríe PBS.
   NOTA: Para seis hidrogeles, se necesitan 1.200 ml de PBS frío.
2. Saque la alícuota sulfo-SANPAH (1 vial a 6 geles).
   NOTA: Si es necesario, la cantidad de sulfo-SANPAH utilizada se puede reducir después de la optimización.
3. Agregue 1.200 ml de PBS frío en un vial de alícuota sulfo-SANPAH y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
4. Dispensar 200 l de sulfo-SANPAH en la película de parafina en la placa Petri y cubrir con el compuesto de hidrogel-coverslip con hidrogel en contacto sulfo-SANPAH(Figura 3D).
   NOTA: Sulfo-SANPAH es muy susceptible al agua debido a la hidrólisis. Recién descongelar se a partir de -80 oC justo antes de su uso. No reutilice ni vuelva a congelar las sobras.
5. Exponga el hidrogel a la lámpara UV a 365 nm, 4 mW/cm² durante 5 min para activar sulfo-SANPAH.
   NOTA: Después de la exposición, el sulfo-SANPAH cambiará de naranja a marrón(Figura 3E). Si el hidrogel se vuelve marrón, indica la activación exitosa del grupo de azidas de fenilo de sulfo-SANPAH y la incorporación de sulfo-SANPAH en el hidrogel. Proceda directamente con los pasos 8.6-8.9 dentro de un máximo de 10 min, porque la actividad de sulfo-SANPAH disminuirá.
6. Reponer un depósito de polipropileno desechable con PBS fresco. Después de la activación del sulfo-SANPAH, transfiera los hidrogeles activados y enjuague rápidamente los hidrogeles en un depósito de PBS para eliminar el sulfo-SANPAH no unido.
   NOTA: Un lavado largo puede resultar en una baja eficiencia de conjugación proteica.
7. Después de un enjuague rápido, coloque los cubredes unidos a hidrogel en la película de parafina en los platos de Petri y coloque cuidadosamente los hidrogeles con toallitas estériles sin pelusas.
   NOTA: El PBS restante en la parte superior del hidrogel dará lugar a la fuga de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano a través de la plantilla, y el secado demasiado extenso conducirá a la ruptura del hidrogel al retirar la plantilla debido a una adherencia demasiado alta a la plantilla.
8. Coloque la plantilla enlafadas y colóquela con toallitas autoclave sin pelusas para asegurar un sellado hermético entre la plantilla y el hidrogel(Figura 3F).
9. Dispensar cuidadosamente 200 l de la solución de proteína de matriz de membrana de sótano diluido preparada a partir del paso 6.3(Figura 3G)en la parte superior. Dejar pasar la noche en la incubadora (37oC).
   NOTA: Cuando el contacto entre la plantilla y el hidrogel es estrecho y la concentración de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano es óptima, la solución de proteína de matriz de membrana del sótano se secuestrará y permanecerá encima de la plantilla(Figura 3H). El tiempo de incubación se puede reducir tras la optimización. Teóricamente, se puede reducir a 30 min-2 h.
10. Al día siguiente, transfiera los hidrogeles a una placa de 6 pocillos y sumérgelos completamente en PBS.
    NOTA: Se recomienda despegar la plantilla con inmersión PBS sobre la cubierta para evitar el desgarro y pegado del hidrogel a la plantilla.
11. Retire cuidadosamente la plantilla con pinzas autoclavedas sin romper el hidrogel. Resuspenda bien con DMEM, devuelva los hidrogeles estampados a la incubadora y déjelos durante la noche para comprobar cualquier contaminación.
12. Si el medio permanece limpio, los hidrogeles están listos para ser utilizados para el revestimiento celular. Optimice la densidad de chapado celular y el tiempo de incubación para permitir la adhesión de las células para las aplicaciones respectivas.
    NOTA: Para patrones de una sola célula de hiPSC-CM, semilla e incubar durante la noche. Se recomiendan los siguientes números de celda para la sembración: 30,000, 60,000, y 90,000 celdas/pozo. La sembración de demasiadas células conduce a más de una celda por patrón. Se recomienda un colador celular para tensar las células no individuales antes de la sembración celular.
13. Al día siguiente, observe el apego celular y la propagación, y cambie los medios para deshacerse de las células separadas.

9. Limpieza de las plantillas usadas

1. Para eliminar las proteínas de matriz residual en las plantillas usadas, sumerja las plantillas en solución enzimática(Tabla de materiales)durante 10 min a 37 oC.
   NOTA: La enzima debe seleccionarse en función de las proteínas de matriz utilizadas. Para una solución de proteína de matriz rica en colágeno, utilice la colagenasa. También se recomienda una ultrasonicación de 10-15 minutos en solución enzimática.
2. Aspirar la solución y reponer con 10% de lejía. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Enjuague 3x con PBS.
4. Conservar en 70% de etanol a 4oC hasta su uso.

Resultados

Se ha demostrado la fabricación de plantillas que contienen una matriz de cuadrados o rectángulos (Figura 4A). Siguiendo este protocolo, obtuvimos islas proteicas de matriz de patrones(Figura 4B y Figura 5A)y células (Figura 4C). La concentración de la solución de proteína de matriz subóptima dio lugar a patrones subóptimos(Figura 5B). Es fundamental utilizar la par...

Discusión

Describimos un método de micropatrón basado en plantillas libre de litografía que permite un patrón eficaz de las células adherentes. En este protocolo, demostramos el patrón de hiPSC-CM en diferentes relaciones longitud-anchura mediante el micropatrón de islas de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogeles de poliacrilamida con rigidez tisular fisiológica o patológicamente relevante o sustratos de elastómero a base de silicio. Este método es relativamente simple y altamente accesible para cualqui...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning