Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

Resumo

Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Resumo

As técnicas de micropadronização têm sido amplamente utilizadas na biologia celular para estudar efeitos do controle da forma e do tamanho das células na determinação do destino celular na resolução de uma única célula. As técnicas atuais de micropadronização de células únicas de última geração envolvem litografia suave e impressão de micro-contato, que é uma tecnologia poderosa, mas requer habilidades de engenharia treinadas e certo suporte de instalações na microfabricação. Essas limitações requerem uma técnica mais acessível. Aqui, descrevemos um método alternativo sem litografia: padronização de células simples baseadas em estêncil. Fornecemos procedimentos passo a passo, incluindo design de estêncil, fabricação de hidrogel de poliacrilamida, incorporação de proteína à base de estêncil e revestimento celular e cultura. Este método simples pode ser usado para padronizar uma matriz de até 2.000 células. Demonstramos a padronização de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos únicos (hiPSC) com formas celulares distintas, de um quadrado de 1:1 a um retângulo adulto semelhante a cardiomiócitos de 7:1. Esta padronização de células únicas baseada em estêncil é livre de litografia, tecnicamente robusta, conveniente, barata e, mais importante, acessível àqueles com um fundo de bioengenharia limitado.

Introdução

O advento dos hiPSCs e o subsequente desenvolvimento de protocolos para sua diferenciação direcionada em diferentes tipos celulares permitiram estudar o desenvolvimento e a doença em nível molecular e específico do paciente, especificamente utilizando cardiomiócitos iPSC derivados do paciente (iPSC-CMs) para modelar cardiomiopatias^1,2. No entanto, uma grande limitação ao estudo do desenvolvimento e fisiologia utilizando o sistema iPSC e outros modelos in vitro é a ausência de um microambiente estruturado. In situ, as células são submetidas às restrições da matriz extracelular (ECM), bem como das células vizinhas. A composição bioquímica particular e a rigidez desses microambientes ditam a distribuição espacial das células, bem como os fatores disponíveis para o engajamento na adesão celular. Isso, por sua vez, influencia caminhos de sinalização intracelular, expressão genética e determinação do destino celular. Por exemplo, o iPSC-CM micropadronizado em forma de haste adulta tem uma capacidade de contração significativamente melhor, fluxo de cálcio, organização mitocondrial, eletrofisiologia e formação transversal-túbula³. Assim, as propriedades do microambiente são integrais na regulação das funções celulares.

As técnicas anteriores de micropadronização se baseavam fortemente na fotolitografia (Figura 1A). Nesta técnica, uma camada de polímero fotossensível, ou fotoresist, é girada sobre um substrato plano da solução para formar uma película fina de cerca de 1 μm de espessura. Em seguida, a luz ultravioleta (UV) é aplicada na fotoresiste através de uma máscara contendo o padrão desejado. A exposição à luz ultravioleta (UV) altera quimicamente a fotoresiste modificando sua solubilidade em sua respectiva solução de desenvolvedor, transferindo o padrão desejado da máscara para o substrato. Muitos métodos de micropadronização incorporam a fotolitografia, pois confere nanômetro ao controle de nível de micrômetro sobre o design dos padrões celulares. No entanto, o giro da fotoresistência é altamente sensível às impurezas, porque as menores partículas de poeira interromperão a propagação da solução em um filme fino. A fotolitografia deve, portanto, ser realizada em instalações não contaminadas, que são caras para manter e requerem especial perícia para utilizar. Além disso, os produtos químicos usados na fotolitografia são muitas vezes tóxicos para as células e podem desnaturar biomoléculas importantes. Assim, a fotolitografia coloca obstáculos significativos à fabricação de micropadrões para aplicações biológicas convenientes.

Em 1994, Whitesides e colegas⁴ superaram alguns dos desafios associados à fotolitografia ao pioneirismo de uma coleção de técnicas chamada litografia suave. Na litografia macia, uma superfície microestruturada feita com polidimetilsiloxano (PDMS), um material transparente, semelhante à borracha, é usada para gerar um padrão de proteínas ECM⁴. Técnicas litográficas macias comuns incluem impressão de microcontato e padronização microfluida. Na impressão por microcontato, atualmente o método litográfico macio mais popular, um selo PDMS revestido com proteínas ECM transfere o material para uma superfície nas áreas contatadas pelo selo(Figura 1B). Na padronização microfluida, as microestruturas são projetadas em uma superfície PDMS de tal forma que quando o selo é pressionado para um substrato, uma rede de microcanais, através da qual os fluidos podem ser entregues às áreas desejadas, é criada (Figura 1C)⁵. A litografia suave oferece vários benefícios sobre a fotolitografia. Uma vez que um wafer mestre é microfabricado, os selos PDMS podem ser facilmente replicados sem maior emprego de instalações de quarto limpo. Além disso, a ausência de solventes orgânicos no processo de litografia macia permite a utilização de materiais poliméricos como o poliestireno, normalmente utilizado na cultura celular. Finalmente, a micropadronização usando métodos litográficos macios não se restringe a superfícies planas. Assim, a litografia suave aumenta a acessibilidade e funcionalidade da fabricação de micropadrões sobre a fotolitografia⁶. No entanto, a litografia suave tem desvantagens significativas. Por exemplo, um passo inicial de gravação, usando fotolitografia, ainda é necessário para microfabricar o selo. Além disso, a micropadronização utilizando um selo PDMS está sujeita a variações na qualidade da transferência de proteínas para o substrato⁶. Evitar essas discrepâncias requer otimização e consistência na pressão aplicada ao selo PDMS durante a transferência de proteínas, caso contrário, a deformação e distorção dos tamanhos de recurso dos moldes PDMS podem ocorrer⁶. Há também uma grande preocupação em usar repetidamente o PDMS devido à absorção de pequenas moléculas⁷.

Para evitar o uso de selos de fotolitografia macia e PDMS, descrevemos um método de micropadronização de células únicas sem litografia, baseado em estêncil, livre de litografia, que supera muitos dos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia suave. Neste método, um hidrogel de poliacrilamida é usado como substrato para incorporação de proteína stencil à base de ECM, permitindo o revestimento seletivo de hº-CMs únicos. Esta técnica é altamente compatível com materiais poliméricos usados em condições clássicas de cultura celular. Além disso, com a limpeza e manutenção adequadas, os estêncil são reutilizáveis e resistentes à degradação e absorção de proteínas durante o processo de microfabricação. Finalmente, o processo de padronização é tecnicamente robusto, barato, personalizável e acessível àqueles sem habilidades especializadas em bioengenharia. Esta técnica de micropadronização baseada em estêncil tem sido amplamente utilizada em nossas publicações recentes modelando cardiomiopatias variadas^8,9,10.

Protocolo

1. Fabricação de estêncil à base de poliimida padrão negativo

1. Gerar um padrão(Figura 2A)no formato .dxf usando software de design auxiliado por computador (por exemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
   1. Gerar um círculo (diâmetro = 22 mm) para delinear a borda do estêncil.
   2. Desenhe uma forma sólida ou o padrão desejado.
   3. Inclua uma letra quiral (por exemplo, R) para marcar o lado frontal dos estêncil.
      NOTA: Como exemplo, uma matriz de quadrados e retângulos é gerada para padronizar iPSC-CMs em níveis de uma única célula e par de células. Os arquivos de design estão disponíveis (consulte Arquivos Suplementares). O limite de resolução de microfabricação é de ~10 μm.
2. Submeta o design a uma empresa de microfabricação para filme de poliimida a laser e fabricar estêncil(Figura 2B,C).

2. Preparação das alíquotas sulfo-SANPAH

NOTA: O protocolo é modificado a partir de Fischer et al.¹¹.

1. Use uma caixa de armazenamento de amostra de papelão resistente à umidade (por exemplo, 100 bem, 10 x 10 espaços para tubos de centrífuga, dimensões: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Rotule-o como "nome/data/sulfo-SANPAH 40 μL/reconstituído com 1.200 μL de PBS".
2. Etiqueta50 tubos de microcentrifugação (polipropileno, 1,5 mL) com um 'S' na tampa.
3. Pegue 4 mL de sulfóxido de dimetila anidro,extra seco (DMSO) e filtro estéril a solução usando uma unidade de filtro de membrana (tamanho dos poros = 0,22 μm) em um tubo cônico estéril de 15 mL.
4. Prepare um banho de nitrogênio líquido e cubra com a tampa para minimizar a evaporação do nitrogênio líquido.
5. Dissolver 50 mg de sulfo-SANPAH em 2 mL do DMSO filtrado.
6. O vórtice bem para dissolver totalmente o sulfo-SANPAH no DMSO.
7. Distribua as alíquotas de 40 μL da solução sulfo-SANPAH em tubos estéreis de 1,5 mL.
8. Transfira os tubos para a caixa.
9. Congele os tubos em nitrogênio líquido por 5 min.
10. Armazene as alíquotas a -80 °C.
    NOTA: As alíquotas podem ser usadas por até 6 meses sem eficiência reduzida. A concentração de sulfo-SANPAH é de 25 mg/mL ou 50,77 mM.

3. Esterilização de ferramentas

1. Autoclave dois fórceps, 24 tampas de vidro (22 x 22 mm, nº 1 ou nº 1.5), uma lâmina de barbear e três lenços absorventes sem fiapos.
   NOTA: Para fazer 12 construções de hidrogel, são necessárias 24 tampas de vidro. Deve haver dois coverslips por construção. É aconselhável preparar alguns deslizamentos de cobertura sobressalentes.
2. Coloque duas peças de filme de parafina (4 x 4 polegadas) em uma caixa de plástico resistente ao etanol (por exemplo, uma caixa de ponta de pipeta de 1.000 μL) e esterilize-as em etanol fresco por pelo menos 15 min.

4. Preparação da solução precursora do hidrogel de poliacrilamida

NOTA: O protocolo é modificado a partir de Lee et al.¹².

1. Dissolver 125 mg de metacrilato de aminoetila (AEM) em 36,25 mL de água deionizada em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL por vórtice.
2. Para preparar 50 mL de solução precursora de poliacrilamida de 10 kPa (8-0,15-15 mM), misture 10 mL de solução de 40% de acrilamida, 3,75 mL de solução de 2% de bis-acrilamida e 36,25 mL da solução AEM preparada na etapa 4.1 em um novo tubo de polipropileno centrípileo de 50 mL.
   NOTA: A concentração final da solução precursora é 8% de acrilamida, 0,15% de bis-acrilamida e 15 mM AEM, que foi medida para ter ~10 kPa de rigidez por microscopia de força atômica. De acordo com as aplicações teciduais de interesse, a rigidez do hidrogel pode ser alterada alterando a razão da acrilamida de 40% para a solução de 2% de bis-acrilamida. Por exemplo, 8% de solução de acrilamida -0,08% de bis-acrilamida produz hidrogéis de 3 kPa; 8% de solução de acrilamida -0,48% bis-acrilamida produz 38 hidrogéis kPa; 8% de solução de acrilamida -0,48% de bis-acrilamida produz hidrogéis de 60 kPa. É aconselhável confirmar a rigidez dos hidrogéis feitos a partir das soluções precursoras com proporções alteradas.

5. Preparação da solução fotoinitada

1. Para 1 mL de solução fotoiniciada de 5%, primeiro dissolva 50 mgs de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxyethoxy)-2-metilpropiophenone em pó de 700 μL de 100% de etanol em um tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 mL com tampa.
   NOTA: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenonenoa não é solúvel em água. Certifique-se de dissolver totalmente o pó no etanol, vórticendo.
2. Depois de dissolver completamente o 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone no etanol por vórtice, adicione 300 μL de solução salina tamponada por fosfato (PBS) para um volume final de 1 mL.
   NOTA: A concentração final da solução 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone é de 5%. A solução fotoinciador de 5% frustrada é boa para 4 semanas a 4 °C.

6. Preparação da solução proteica da matriz da membrana do porão

NOTA: A matriz da membrana do porão(Table of Materials)é um material sensível à temperatura. Certifique-se de trabalhar no gelo com pontas e tubos de pipeta refrigeradas, bem como soluções geladas. Um novo estoque de matriz de membrana de porão deve ser descongelado lentamente no gelo a 4 °C durante a noite.

1. Prepare 200 μL de solução de proteína de membrana de porão por construção de hidrogel. Para 12 construções, são necessários 2,4 mL de solução proteica de membrana de porão. Prepare 10% de solução extra (por exemplo, 2,6 mL).
2. Para cada novo lote/lote de solução de proteína de membrana de membrana de porão, otimize a razão de diluição. Pela primeira vez, teste as razões de diluição de 1:10, 1:20, 1:40 para encontrar a razão de diluição que produz as melhores qualidades para a padronização celular.
   NOTA: Se a solução de proteína da matriz da membrana do porão for muito viscosa, ela formará um gel em cima do estêncil, e é mais provável que se descasque ao remover o estêncil. Se a solução proteica for muito fluida, ela penetrará através dos orifícios padrão dos estêncil, o que resultará em uma padronização de má qualidade.
3. Diluir a solução de proteína da matriz da membrana do porão no gelo com a mistura de proteína salina/nutriente salina de Dulbecco Modificada F-12 (DMEM/F12) ou 1x PBS para a razão de diluição otimizada acima. Por exemplo, diluir 120 μL da solução de estoque em 2,4 mL de mídia DMEM/F12 (1:20) e manter no gelo para uso posterior.

7. Fabricação de hidrogel

1. Coloque uma lâmpada de banco UV (365 nm, 4 mW/cm²) em uma capa de segurança biológica.
2. Coloque as pelídeas de parafina esterilizadas a partir do passo 3.2 e seque completamente em condições estéreis. Se as películas de parafina não estiverem completamente secas, use um sistema de aspiração a vácuo para remover qualquer líquido residual. Coloque seis tampas autoclaved do passo 3.1 em cada filme de parafina usando os fórceps autoclaved.
3. Prepare a solução precursora de poliacrilamida uv-crosslinkable diluindo a solução fotoinitatória de 5% (etapa 5.2) com solução precursora de poliacrilamida (etapa 4.2) em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Para 5 mL de solução precursora de poliacrilamida uv-crosslinkable, adicione 50 μL de solução fotoinitada de 5% a 5 mL de solução precursora de poliacrilamida.
4. Filtrar a solução precursora da etapa 7.3 usando uma unidade de filtro de 50 mL com um tamanho de poros de 0,22 μm para esterilização.
   NOTA: Prepare sempre uma nova solução precursora.
5. Dispense 200 μL de solução precursora de poliacrilamida do passo 7.4 em cada deslizamento de tampa de vidro de 22 x 22 mm na placa de Petri filmada parafina e cubra cuidadosamente com outro deslizamento de cobertura de vidro de 22 x 22 mm na parte superior para sanduíche a solução no meio(Figura 3A).
   NOTA: A filme de parafina é usada para evitar derramamentos e para limitar a solução precursora entre as tampas.
6. Coloque a placa de Petri contendo deslizamento de cobertura do passo 7.5 sob a lâmpada de banco UV e fotopolimerize os hidrogéis de poliacrilamida por 5 min(Figura 3B).
   NOTA: Se a superfície não for branca, a absorção UV da superfície reduz a eficiência de photocrosslinking. A cobertura do papel branco na superfície não branca é importante para minimizar a perda de intensidade UV. Para proteger contra radiação UV, cubra a lâmpada com papel alumínio e use óculos de proteção UV.
7. Desgrudar cuidadosamente uma tampa da outra usando uma lâmina de barbear por ação de alavancagem(Figura 3C).
   NOTA: O hidrogel geralmente gruda na tampa superior. Preste atenção extra ao separar o deslizamento de cobertura do hidrogel macio, pois é provável que quebre.
8. Encha um reservatório descartável de polipropileno com PBS. Transfira os compostos de deslizamento de hidrogel em um reservatório contendo PBS para enxaguar os hidrogéis em PBS por 5 min. Depois de enxaguar, coloque a construção de hidrogel de volta no filme de parafina na placa de Petri.

8. Conjugação de proteínas

1. Prepare um balde de gelo e pbs pré-cool.
   NOTA: Para seis hidrogéis, são necessários 1.200 μL de PBS frio.
2. Tire a alíquota sulfo-SANPAH (1 frasco = 6 géis).
   NOTA: Se necessário, a quantidade de sulfo-SANPAH utilizada pode ser reduzida após a otimização.
3. Adicione 1.200 μL de PBS frio em um frasco de alíquota sulfo-SANPAH e misture encanando para cima e para baixo.
4. Dispense 200 μL de sulfo-SANPAH na película de parafina na placa de Petri e cubra com o composto de hidrogel com hidrogel entrando em contato com sulfo-SANPAH (Figura 3D).
   NOTA: Sulfo-SANPAH é muito suscetível à água devido à hidrólise. Descongele recentemente a partir de -80 °C logo antes do uso. Não reutilize ou congele novamente as sobras.
5. Exponha o hidrogel à lâmpada UV a 365 nm, 4 mW/cm² por 5 min para ativar sulfo-SANPAH.
   NOTA: Após a exposição, o sulfo-SANPAH mudará de laranja para marrom (Figura 3E). Se o hidrogel ficar marrom, indica ativação bem sucedida do grupo de azida fenil de sulfo-SANPAH e incorporação de sulfo-SANPAH no hidrogel. Proceder diretamente com as etapas 8.6-8.9 dentro de um máximo de 10 minutos, pois a atividade do sulfo-SANPAH diminuirá.
6. Reponha um reservatório descartável de polipropileno com PBS fresco. Após a ativação sulfo-SANPAH, transfira os hidrogéis ativados e enxágue rapidamente os hidrogéis em um reservatório PBS para remover sulfo-SANPAH não atado.
   NOTA: Uma lavagem longa pode resultar em baixa eficiência de conjugação de proteínas.
7. Depois de uma lavagem rápida, coloque as tampas de hidrogel no filme de parafina nas placas de Petri e cuidadosamente dab os hidrogéis com lenços sem fiapos estéreis.
   NOTA: O restante da PBS no topo do hidrogel resultará em vazamento da solução de proteína da matriz da membrana do porão através do estêncil, e a secagem muito extensiva levará à ruptura do hidrogel após a remoção do estêncil devido à alta adesão ao estêncil.
8. Coloque o estêncil sobre os hidrogéis e a dab com lenços livres de fiapos autoclavos para garantir uma vedação apertada entre o estêncil e o hidrogel(Figura 3F).
9. Dispense cuidadosamente 200 μL da solução de proteína da matriz de membrana do porão diluída preparada a partir da etapa 6.3 (Figura 3G) em cima. Deixe durante a noite na incubadora (37 °C).
   NOTA: Quando o contato estêncil-hidrogel é apertado e a concentração da solução de proteína da membrana do porão é ótima, a solução de proteína da membrana do porão será seqüepara e permanecerá em cima do estêncil(Figura 3H). O tempo de incubação pode ser reduzido após a otimização. Teoricamente, pode ser reduzido para 30 min-2 h.
10. No dia seguinte, transfira os hidrogéis para uma placa de 6 poços e mergulhe-os totalmente em PBS.
    NOTA: Recomenda-se retirar o estêncil com imersão PBS sobre o deslizamento de cobertura para evitar rasgar e grudar o hidrogel no estêncil.
11. Remova cuidadosamente o estêncil usando pinças autoclaved sem rasgar o hidrogel. Ressuspensa bem com o DMEM, devolva os hidrogéis padronizados para a incubadora e deixe-os durante a noite para testar qualquer contaminação.
12. Se a mídia permanecer clara, os hidrogéis estão prontos para serem usados para chapeamento celular. Otimizar a densidade de chapeamento celular e o tempo de incubação para permitir a adesão das células para as respectivas aplicações.
    NOTA: Para padronização de células únicas de hiPSC-CMs, sementes e incubar durante a noite. Os seguintes números de células são recomendados para semeação: 30.000, 60.000 e 90.000 células/bem. Semeader muitas células leva a mais de uma célula por padrão. Recomenda-se um coador celular para escoar células não únicas antes da semeada celular.
13. No dia seguinte, observe o apego celular e a propagação, e mude a mídia para se livrar das células separadas.

9. Limpeza dos estêncil usados

1. Para remover proteínas de matriz residual nos estêncil usados, mergulhe os estêncil na solução enzimática(Tabela de Materiais)por 10 minutos a 37 °C.
   NOTA: A enzima deve ser selecionada dependendo das proteínas matriciais utilizadas. Para solução de proteína matricial rica em colágeno, use colagemnase. Recomenda-se também uma ultrassonação de 10 a 15 min em solução enzimática.
2. Apiratee a solução e reponha com 10% de alvejante. Incubar por 10 min em temperatura ambiente.
3. Enxágüe 3x com PBS.
4. Guarde em 70% de etanol a 4 °C até o uso.

Resultados

Foi demonstrada a fabricação de estêncil contendo uma matriz de quadrados ou retângulos (Figura 4A). Seguindo este protocolo, obtivemos ilhas de proteína matricial padronizadas (Figura 4B e Figura 5A) e células(Figura 4C). A concentração de solução de proteína matricial subótima levou a uma padronização subótima(Figura 5B). É fundamental usar a parte frontal...

Discussão

Descrevemos um método de micropadronização baseado em estêncil livre de litografia que permite padronização eficaz de células aderentes. Neste protocolo, demonstramos a padronização de hiPSC-CMs em diferentes relações comprimento-largura por micropadronização de ilhas de proteína de membrana de porão em hidrogéis de poliacrilamida com rigidez tecidual fisiologicamente ou patologicamente relevante ou substratos de elastômeros à base de silício. Este método é relativamente simples e altamente acessíve...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning