レーザーカットステンシルを用いたシンプルリソグラフィフリーシングルセルマイクロパターニング

要約

このプロトコルは、限られたバイオエンジニアリングのバックグラウンドを持つ人が簡単でアクセスできるリソグラフィーフリーのマイクロパターン化方法を導入しています。この方法は、カスタマイズされたレーザーカットステンシルを利用して、細胞形態を調節するために目的の形をした細胞外マトリックスタンパク質をマイクロパターン化します。マイクロパターン化の手順は、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いて実証される。

要約

マイクロパターニング技術は、細胞の形状とサイズを制御する単一細胞の分解能における細胞の運命決定の影響を研究するために、細胞生物学で広く使用されてきました。現在の最先端の単一セル顕微鏡技術には、ソフトリソグラフィとマイクロコンタクト印刷が含まれますが、これは強力な技術ですが、訓練を受けたエンジニアリングスキルとマイクロファブリケーションにおける特定の施設サポートが必要です。これらの制限には、よりアクセスしやすい手法が必要です。ここでは、単純な代替リソグラフィフリー方式であるステンシルベースの単一セルパターンについて説明します。ステンシルデザイン、ポリアクリルアミドヒドロゲル製造、ステンシルベースのタンパク質取り込み、細胞めっき培養など、ステップバイステップの手順を提供しています。この単純な方法を使用して、2,000 個ものセルの配列をパターン化できます。我々は、1:1の正方形から7:1の成体心筋細胞様長方形に、明確な細胞形状を有する単一のヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)に由来する心筋細胞のパターン化を実証する。このステンシルベースの単一セルパターニングは、リソグラフィーフリー、技術的に堅牢で便利で、安価で、最も重要なのは限られたバイオエンジニアリングの背景を持つものにアクセス可能です。

概要

hiPSCの出現とその後の異なる細胞型への指向分化のためのプロトコルの開発により、特に患者由来のiPSC心筋細胞(iPSC-CM)を用いて心筋症^を,モデル化する分子および患者固有のレベルでの発達と疾患の研究が可能^になった。しかし、iPSCシステムや他のin vitroモデルを用いた開発・生理学の研究には、構造化された微小環境がないことが大きな制限です。細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の制約に加え、また隣接する細胞にも供される。これらの微小環境の特定の生化学的組成と剛性は、細胞の空間分布だけでなく、細胞接着に従事するために利用可能な要因を決定します。これは、今度は、細胞内シグナル伝達経路、遺伝子発現、および細胞運命決定に影響を及ぼす。例えば、成体状棒状のマイクロパターン化されたiPSC-CMは、著しく優れた収縮能力を有し、カルシウム流、ミトコンドリア組織、電気生理学、および横管状形成^3。したがって、微小環境の特性は、細胞機能の調節に不可欠である。

以前のマイクロパターニング技術はフォトリソグラフィに大きく依存していました(図1A)。この技術では、感光性ポリマー、またはフォトレジストの層を、溶液から平坦な基板上で紡がれ、厚さ約1μmの薄膜を形成する。次に、紫外(UV)光を、所望のパターンを含むマスクを通してフォトレジストに照射する。紫外線(UV)光への曝露は、それぞれの現像液におけるその溶解性を改変することによりフォトレジストを化学的に変え、マスクから基板上に所望のパターンを移す。多くのマイクロパターニング法は、ナノメートルからマイクロメートルレベルの細胞パターンの設計制御を与えるフォトリソグラフィを組み込んでいます。しかし、フォトレジストの紡糸は、最小の塵粒子が薄膜への溶液の拡散を妨げるため、不純物に対して非常に敏感である。したがって、フォトリソグラフィは、維持にコストがかかり、利用するために特別な専門知識を必要とする、汚染されていない施設で行う必要があります。また、フォトリソグラフィーに用いられる化学物質は、しばしば細胞に対して毒性があり、重要な生体分子を変性させる可能性があります。したがって、フォトリソグラフィは、便利な生物学的用途のためのマイクロパターンの作製に重大な障害をもたらす。

1994年、Whitesides^たちの4社は、ソフトリソグラフィと呼ばれる技術のコレクションを開拓することで、フォトリソグラフィに関連する課題のいくつかを克服しました。ソフトリソグラフィでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られた微小構造表面を、透明でゴム状の材料で、ECMタンパク質⁴のパターンを生成するために使用される。一般的なソフトリソグラフィ技術には、マイクロコンタクト印刷とマイクロ流体パターンが含まれます。マイクロコンタクト印刷では、現在最も一般的なソフトリソグラフィ法で、ECMタンパク質で被覆されたPDMSスタンプは、スタンプが接触する領域で表面に材料を移動する(図1B)。マイクロ流体パターン化では、マイクロストラクチャは、スタンプが基板に押し込まれると、流体を所望の領域に送達できるマイクロチャネルのネットワークが作成されるようにPDMS表面上に設計される(図1C)5。⁵柔らかいリソグラフィはフォトリソグラフィよりいくつかの利点を提供する。マスターウエハがマイクロハブ化されると、PDMSスタンプは、クリーンルーム設備のさらなる雇用なしに簡単に複製することができます。さらに、ソフトリソグラフィーの過程で有機溶媒が存在しない場合、ポリスチレンなどの高分子材料の利用が可能であり、細胞培養において典型的に使用される。最後に、ソフトリソグラフィ法によるマイクロパターニングは、平坦な面に限定されません。したがって、ソフトリソグラフィはフォトリソグラフィ6に対するマイクロパターン製作のアクセシビリティと機能性を高める^。しかし、ソフトリソグラフィには大きな欠点があります。例えば、初期エッチング工程は、フォトリソグラフィを用いて、スタンプを微細加工するために依然として必要とされる。また、PDMSスタンプを用いたマイクロパターニングは、基板⁶へのタンパク質転写の質のばらつきの影響を受ける。これらの不一致を回避するには、タンパク質の移動中にPDMSスタンプに加えられる圧力の最適化と一貫性が必要であり、そうでなければPDMS金型の特徴サイズの変形および歪みが⁶で起こり得る。また、小分子吸収によるPDMSの繰り返し使用の大きな懸念^も7.

柔らかいフォトリソグラフィやPDMSスタンプの使用を避けるために、フォトリソグラフィとソフトリソグラフィに関連する多くの障害を克服するステンシルベースのリソグラフィフリー単一細胞顕微鏡法について説明します。この方法では、ポリアクリルアミドヒドロゲルをステンシルベースECMタンパク質取り込みの基質として用い、単一hiPSC-CMの選択メッキを可能にする。この技術は、古典的な細胞培養条件で使用されるポリマー材料との互換性が高い。さらに、適切な洗浄とメンテナンスにより、ステンシルは再利用可能であり、微細加工プロセス中の分解およびタンパク質吸収に耐性があります。最後に、パターニングプロセスは技術的に堅牢で、安価でカスタマイズ可能で、専門的なバイオエンジニアリングスキルを持たない人がアクセスできます。このステンシルベースのマイクロパターニング技術は、最近の出版物で、多様な心筋症^{88、9、109,10}をモデル化する際に広く利用されています。

プロトコル

1. 負のパターンポリイミドベースのステンシルの製造

1. コンピュータ支援設計ソフトウェア(AutoCAD、SolidWorks、オンシェイプ、アドビイラストレーターなど)を使用して、.dxf形式でパターン(図2A)を生成します。
   1. 円(直径 = 22 mm)を生成して、ステンシルの境界線を描きます。
   2. 塗りつぶされた図形または目的のパターンを描画します。
   3. ステンシルの前面をマークするキラル文字(Rなど)を含めます。
      注: 例として、単一セルレベルとセルペアレベルで iPSC-CM をパターン化するために、正方形と長方形の配列が生成されます。設計ファイルが利用可能です (「補足ファイル」を参照)。微細加工分解能限界は約10μmです。
2. 設計をマイクロファブリケーション会社に提出し、ポリイミドフィルムをレーザーカットし、ステンシルを製造します(図2B、C)。C

2. スルフォ-サンパーアアリコートの調製

注: プロトコルは Fischer ら¹¹から変更されます。

1. 耐湿性の段ボールサンプル収納ボックス(例えば、100ウェル、遠心管用10 x 10スペース、寸法:13.4 cm x 13.4 cm x 5.1 cm)を使用してください。「名前/日付/スルフォ-SANPAH 40 μL/1,200 μLのPBSで再構成」とラベル付けしてください。
2. 蓋に「S」を付けて50マイクロ遠心分離管(ポリプロピレン、1.5 mL)にラベルを付けます。
3. 無水、余分な乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)および無菌フィルターの4 mLを取り、膜フィルターユニット(細孔サイズ = 0.22 μm)を使用して溶液を無菌15 mL円錐形チューブに取り込みます。
4. 液体窒素浴を準備し、液体窒素の蒸発を最小限に抑えるために蓋で覆います。
5. 50 mgのスルホ-サンパーを 2 mL のろ過 DMSO に溶解します。
6. ボルテックスは、DMSO中でスルフォ-サンパーを完全に溶解する。
7. スルフォ-SANPAH溶液の40 μLアリコートを滅菌1.5 mLチューブに分配します。
8. 箱にチューブを移します。
9. 液体窒素中のチューブを5分間フラッシュフリーズします。
10. アリコートは-80°Cで保管してください。
    注意:アリコートは効率を低下させることなく、最大6ヶ月間使用することができます。硫化塩分濃度は25mg/mLまたは50.77 mMです。

3. 工具の殺菌

1. 2つの鉗子、24つのガラスカバーリップ(22 x 22 mm、No.1またはNo.1.5)、1つのカミソリの刃、および3つの糸くずのない吸収性のワイプをオートクレーブ。
   注:12のヒドロゲル構造を作るためには、24個のガラスカバーリップが必要です。構造体ごとに 2 つのカバーリップが必要です。予備のカバーリップを用意することをお勧めします。
2. エタノール耐性プラスチックボックス(例えば、1,000 μLピペットチップボックス)に2枚のパラフィンフィルム(4 x 4インチ)を入れ、少なくとも15分間新鮮な70%エタノールで滅菌します。

4. ポリアクリルアミドヒドロゲル前駆体溶液の調製

注意: プロトコルは Lee ら¹²から変更されます。

1. 50 mL ポリプロピレン遠心分離チューブに36.25 mLのアミノエチルメタクリレート(AEM)をボルテックスで溶解します。
2. 10 kPaポリアクリルアミド前駆体溶液(8-0.15~15 mM)の50 mLを調製するには、10 mLの40%アクリルアミド溶液、3.75 mLの2%ビスアクリルアミド溶液、および36.25mLのAEM溶液を新しい50 mLポリプロプリレンフィレンフィブチューブでステップ4.1で調製した。
   注:前駆体溶液の最終濃度は、原子間力顕微鏡で約10kPaの剛性を有するように測定された8%アクリルアミド、0.15%ビスアクリルアミド、および15 mM AEMである。目的の組織用途によれば、ヒドロゲルの剛性は、2%のビスアクリルアミド溶液に対する40%アクリルアミドの比率を変化させることによって変化させることができる。例えば、8%アクリルアミド-0.08%ビスアクリルアミド溶液は3kPaヒドロゲルを生成します。8% アクリルアミド –0.48% ビスアクリルアミド溶液は、38 kPa ヒドロゲルを生成します。8% アクリルアミド–0.48% ビスアクリルアミド溶液は60 kPaヒドロゲルを生成します。前駆体溶液から作られたヒドロゲルの剛性を、変化した比率で確認することをお勧めします。

5. 光起分剤溶液の調製

1. 5%光導入剤溶液の1 mLの場合、蓋付き1.5 mLポリプロピレン遠心分離管に、まず2-ヒドロキシ4'-(2-ヒドロキシエトキシキシ)-2-メチルプロピオフェノン粉末を100%エタノールの700 μLで溶解します。
   注: 2-ヒドロキシ-4'(2-ヒドロキシアトキシ)-2-メチルプロピオフェノンは水に溶けません。粉末をボルテックスでエタノールに完全に溶かしてください。
2. 2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノンをボルテックスでエタノールに完全に溶解した後、300 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて最終体積1mLにします。
   注:2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシアトキシ)-2-メチルプロピオフェノン溶液の最終濃度は5%です。箔付き5%光刺激器溶液は4°Cで4週間良好である。

6. 基部膜マトリックスタンパク質溶液の調製

注:基体膜マトリックス(材料表)は、温度に敏感な材料です。冷たいピペットの先端とチューブだけでなく、氷冷ソリューションで氷の上で動作することを確認してください。基部膜マトリックスの新しいストックは、一晩で4°Cの氷の上でゆっくりと解凍する必要があります。

1. ヒドロゲル構築物ごとに200μLの基質膜マトリックスタンパク質溶液を調製します。12の構造のために、2.4 mLの基質膜マトリックスタンパク質溶液が必要である。10%の余分な溶液(例えば、2.6 mL)を準備します。
2. 基部膜マトリックスタンパク質溶液の新しいバッチ/ロットごとに、希釈比を最適化します。初めて、1:10、1:20、1:40の希釈比をテストして、細胞パターニングに最適な品質をもたらす希釈比を見つけます。
   注:基体膜マトリックスタンパク質溶液が粘性すぎると、ステンシルの上にゲルが形成され、ステンシルを取り除くと剥がれやすくなります。タンパク質溶液が流動性が高すぎると、ステンシルのパターンホールに浸透し、質の悪いパターニングが発生します。
3. 氷冷ダルベックコの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM / F12)培地または1x PBSを使用して氷上の基基膜マトリックスタンパク質ストック溶液を上記の最適化希釈比に合わせて希釈します。例えば、DMEM/F12媒体2.4mL(1:20)でストック液の120μLを希釈し、後で使用するために氷上に保管します。

7. ヒドロゲル製造

1. UVベンチランプ(365 nm、4 mW/cm²⁾を生物学的安全フードに入れる。
2. 滅菌パラフィンフィルムを工程3.2から完全に乾燥させて無菌状態で乾燥させます。パラフィンフィルムが完全に乾燥していない場合は、真空吸引システムを使用して残留液を除去します。オートクレーブ鉗子を用いて、パラフィンフィルムにステップ3.1から6つのオートクレーブカバーリップを配置します。
3. 50 mL ポリプロピレン遠心分離管にポリアクリルアミド前駆体溶液(ステップ 4.2)を用いて5%光刺激剤溶液(ステップ5.2)を希釈して、UV架橋可能なポリアクリルアミド前駆体溶液を調製します。5 mLのUV架橋性ポリアクリルアミド前駆体溶液の場合、5 mLのポリアクリルアミド前駆体溶液に5%光発合剤溶液を加えます。
4. 滅菌用に0.22 μmの細孔サイズの50 mLフィルターユニットを使用して、ステップ7.3の前駆体溶液をフィルター処理します。
   注:常に新鮮な前駆体ソリューションを準備してください。
5. パラフィンで撮影したペトリ皿のステップ7.4からポリアクリルアミド前駆体溶液200μLを分配し、上に22 x 22mmのガラスカバースリップを慎重に覆い、溶液を挟み込む(図3A)。
   注:パラフィンフィルムは、こぼれを避け、カバーリップの間に前駆体溶液を閉じ込めるために使用されます。
6. ステップ7.5のカバースリップ含有ペトリ皿をUVベンチランプの下に置き、ポリアクリルアミドヒドロゲルを5分間光重合する(図3B)。
   注: 表面が白以外の場合、サーフェスの UV 吸光度により、光架橋効率が低下します。非白色表面の白紙の被覆は、UV強度損失を最小限に抑えるために重要です。紫外線から保護するために、アルミニウムホイルでランプをカバーし、UV保護ゴーグルを着用してください。
7. 一方のカバーを、レバレッジアクションでカミソリの刃を使用して、もう一方のカバースリップを慎重に取り外します(図3C)。
   注:ハイドロゲルは通常、上部カバースリップに固執します。カバースリップを柔らかいヒドロゲルから取り外すときは、壊れる可能性があるので、特に注意してください。
8. 使い捨てのポリプロピレン製の貯蔵所をPBSで満たします。ヒドロゲルカバースリップ複合材料をPBS 含有貯留層に移し、5分間PBSでヒドロゲルをすすいだ。すすった後、ペトリ皿のパラフィンフィルムにハイドロゲルコンストラクトを戻します。

8. タンパク質の結合

1. アイスバケツとプレクールPBSを準備します。
   注意: 6個のヒドロゲルの場合、1,200 μLの冷たいPBSが必要です。
2. スルフォ-SANPAHアリコート(1バイアル=6ゲル)を取り出します。
   注: 必要に応じて、使用されるスルフォ-SANPAHの量を最適化後に減らすことができます。
3. 1,200 μLの冷たいPBSをスルフォ-SANPAHアリコートのバイアルに加え、上下にピペットして混ぜます。
4. ペトリ皿のパラフィンフィルムにスルフォ-SANPAHの200 μLを分配し、ハイドロゲル接触スルフォ-SANPAHとヒドロゲルカバースリップ複合材料で覆う(図3D)。
   注意:スルフォ-SANPAHは加水分解のために水に非常に影響を受けやすいです。使用直前に-80°Cから解凍してください。残り物を再利用したり、再凍結したりしないでください。
5. ハイドロゲルを365 nmのUVランプに、4 mW/cm²を5分間照射してスルフォ-SANPAHを活性化します。
   メモ: 露光後、スルフォ-SANPAHはオレンジ色から茶色に変わります(図3E)。ヒドロゲルが褐色に変わる場合、スルホ-SANPAHのフェニルアジ化基の活性化に成功し、スルホ-SANPAHをヒドロゲルに取り込むことに成功したことを示す。スルフォ-SANPAHの活動が低下するため、最大10分以内にステップ8.6-8.9を直接進めます。
6. 新鮮なPBSで使い捨てのポリプロピレンの貯蔵所を補充しなさい。スルフォ-SANPAH活性化後、活性化ヒドロゲルを移動し、すぐにPBSリザーバ内のヒドロゲルをリンスして、非結合スルフォ-SANPAHを除去します。
   注:長い洗浄は、低タンパク質の活用効率をもたらすことができます。
7. 素早くすすい、ペトリ皿のパラフィンフィルムにヒドロゲル付きのカバーリップを置き、滅菌糸状拭きでヒドロゲルを慎重に手を出します。
   注:ハイドロゲルの上に残っているPBSは、ステンシルを通して基質膜マトリックスタンパク質溶液の漏出をもたらし、あまりにも広範囲に乾燥すると、ステンシルへの付着が高すぎるためにステンシルの除去時にヒドロゲルの破裂につながります。
8. ステンシルをハイドロゲルの上に置き、オートクレーブの糸くずのないワイプを使用して、ステンシルとヒドロゲルの間に密着性を確保します(図3F)。
9. ステップ6.3(図3G)から調製した希釈基膜マトリックスタンパク質溶液の200μLを上に慎重に分配します。インキュベーター(37°C)で一晩放置します。
   注:ステンシル-ヒドロゲル接点がタイトで、基質膜マトリックスタンパク質溶液の濃度が最適な場合、基質膜マトリックスタンパク質溶液は隔離され、ステンシルの上に残ります(図3H)。最適化時にインキュベーション時間を短縮できます。理論的には、30分から2時間まで下げることができる。
10. 翌日、ヒドロゲルを6ウェルプレートに移し、PBSに完全に浸します。
    注: カバースリップの上にPBS浸漬でステンシルを剥がして、ハイドロゲルがステンシルに引き裂かれ、付着するのを防ぐことをお勧めします。
11. ハイドロゲルを引き裂くことなく、オートクレーブピンセットを使用して慎重にステンシルを取り外します。DMEMでよく再懸濁し、パターン化されたヒドロゲルをインキュベーターに戻し、汚染をテストするために一晩放置します。
12. 培地が透明なままであれば、ヒドロゲルは細胞めっきに使用する準備ができています。細胞のめっき密度とインキュベーション時間を最適化し、それぞれの用途に対して細胞の接着を可能にします。
    注:hiPSC-CMの単一細胞パターン化の場合、シードとインキュベートは一晩です。シード処理には、30,000、60,000、および 90,000 個のセル/ウェルのセル番号を使用することをお勧めします。シードするセルが多すぎると、パターンごとに複数のセルが作成されます。細胞のストレーナーは、細胞の播種前に非単細胞をひずみ出すことをお勧めします。
13. 翌日、細胞の取り付けと広がりを観察し、メディアを変更して、切り離されたセルを取り除きます。

9. 使用済みステンシルのクリーニング

1. 使用したステンシルの残留マトリックスタンパク質を除去するには、37°Cで10分間、酵素溶液(材料表)にステンシルを水没させます。
   注:酵素は、使用されるマトリックスタンパク質に応じて選択する必要があります。コラーゲンが豊富なマトリックスタンパク質溶液には、コラゲナーゼを使用してください。酵素溶液中の10〜15分の超音波も推奨されます。
2. 溶液を吸引し、10%の漂白剤で補充する。室温で10分間インキュベートします。
3. PBSで3倍をすすいすいます。
4. 使用するまで4°Cで70%エタノールで保管してください。

結果

正方形または長方形の配列を含むステンシルの製作が実証されている(図4A)。このプロトコルに従って、パターン化されたマトリックスタンパク質アイランド(図4Bおよび図5A)および細胞(図4C)を得た。最適でないマトリックスタンパク質の溶液濃度は、最適でないパターニングに至った(図5...

ディスカッション

接着細胞の効果的なパターニングを可能にするリソグラフィーフリーステンシルベースのマイクロパターニング法について述べた。このプロトコルでは、生理学的または病理学的に関連する組織の剛性またはシリコンベースのエラストマー基質を有するポリアクリルアミドヒドロゲル上の基質膜マトリックスタンパク質島をマイクロパターン化することにより、異なる長さと幅比でhiPSC-CMの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning