Простой литографии-бесплатно одноклеточных микропаттернинга с помощью лазерной-Cut stencils

Резюме

Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.

Аннотация

Методы микрошаблонирования широко использовались в клеточной биологии для изучения влияния контроля формы и размера клеток на определение судьбы клеток при разрешении одной клетки. Современные современные методы микропаттернирования одноклеточных элементов включают мягкую литографию и микроконтактную печать, которая является мощной технологией, но требует подготовленных инженерных навыков и определенной поддержки объектов в микрофабрикации. Эти ограничения требуют более доступной техники. Здесь мы описываем простой альтернативный метод, свободный от литографии: шаблон на основе трафаретов на основе одной ячейки. Мы предоставляем пошаговые процедуры, включая конструкцию трафарета, изготовление гидрогеля полиакриламидов, внеся белковое включение на основе трафаретов, а также клеточное покрытие и культуру. Этот простой метод можно использовать для шаблона массива до 2000 ячеек. Мы демонстрируем узор кардиомиоцитов, полученных из одного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с различными формами клеток, от 1:1 квадрата до 7:1 взрослых кардиомиоцитов, как прямоугольник. Этот трафаретный одноклеточный узор без литографии, технически прочный, удобный, недорогой и, самое главное, доступный для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт.

Введение

Появление hiPSCs и последующее развитие протоколов для их направленной дифференциации на различные типы клеток позволили изучить развитие и болезни на молекулярном и пациент-специфическом уровне, в частности, с использованием кардиомиоцитов iPSC (iPSC-CMs) для моделирования кардиомиопатий^1,2. Однако основным ограничением для изучения развития и физиологии с использованием системы iPSC и других моделей in vitro является отсутствие структурированной микросреды. На месте клетки подвергаются ограничениям внеклеточной матрицы (ECM), а также соседних клеток. Особый биохимический состав и жесткость этих микросред диктуют пространственное распределение клеток, а также факторы, доступные для участия в стеге клеточной печении. Это, в свою очередь, влияет на внутриклеточные сигнальные пути, экспрессию генов и определение судьбы клеток. Например, микропаттернированный iPSC-CM в взрослой форме стержня имеет значительно лучшую сократительную способность, кальцийпоток, митохондриальную организацию, электрофизиологию и поперечное образование^3. Таким образом, свойства микросреды являются неотъемлемой частью регулирования клеточных функций.

Предыдущие методы микропаттернинга в значительной степени опирались на фотолитографию(рисунок 1A). В этом методе, слой фоточувствительного полимера, или photoresist, вращается на плоском субстрате из раствора, чтобы сформировать тонкую пленку толщиной около 1 мкм. Далее ультрафиолетовый (УФ) свет наносится на фотоустойчивость через маску, содержащую желаемый узор. Воздействие ультрафиолетового (УФ) света химически изменяет фотоустойчивость, изменяя его растворимость в соответствующем решении разработчика, перенося желаемый узор из маски на субстрат. Многие методы микропаттернов включают фотолитографию, поскольку она наделяет нанометр микрометровым контролем над конструкцией клеточных узоров. Тем не менее, спиннинг фоторезиста очень чувствителен к примесям, так как мельчайшие частицы пыли нарушит распространение раствора в тонкую пленку. Поэтому фотолитография должна осуществляться на незагрязненных объектах, которые являются дорогостоящими в обслуживании и требуют специальных знаний для использования. Кроме того, химические вещества, используемые в фотолитографии часто токсичны для клеток и могут денатурировать важные биомолекулы. Таким образом, фотолитография создает значительные препятствия для изготовления микрошаблонов для удобного биологического применения.

В 1994 году Whitesides и его коллеги⁴ преодолели некоторые проблемы, связанные с фотолитографией, впервые в ней собрал коллекцию методов, называемых мягкой литографией. В мягкой литографии, микроструктурированная поверхность сделанная с polydimethylsiloxane (PDMS), прозрачным, резиноподобным материалом, использована для того чтобы произвести картину протеинов ECM^4. Общие мягкие литографические методы включают микроконтактную печать и микрофлюидный узор. В микроконтактной печати, в настоящее время наиболее популярным мягким литографическим методом, штамп PDMS, покрытый белками ECM, передает материал на поверхность в районах, с которыми контактирует марка(рисунок 1B). При микрофлюидном узоре микроструктуры проектируются на поверхности PDMS таким образом, что при нажатии на подтекст штамп создается сеть микроканалов, через которые жидкости могут доставляться в нужные области (рисунок 1С)⁵. Мягкая литография предлагает несколько преимуществ по сравнению с фотолитографией. После того, как мастер пластины microfabricated, PDMS марки могут быть легко воспроизведены без дальнейшего трудоустройства чистых помещений. Кроме того, отсутствие органических растворителей в процессе мягкой литографии позволяет использовать полимерные материалы, такие как полистирол, обычно используемые в клеточной культуре. Наконец, микропаттернирование с использованием мягких литографических методов не ограничивается плоскими поверхностями. Таким образом, мягкая литография повышает доступность и функциональность изготовления микрошаблона по сравнению с фотолитографией⁶. Однако мягкая литография имеет существенные недостатки. Например, начальный шаг травления, с помощью фотолитографии, по-прежнему требуется для микрофабриката марки. Кроме того, микропаттернирование с использованием штампа PDMS подвержено изменениям в качестве переноса белка на субстрат^6. Избежание этих расхождений требует оптимизации и согласованности давления, применяемого к штампу PDMS во время переноса белка, в противном случае деформация и искажение размеров функций форм PDMS может произойти^6. Существует также серьезная озабоченность неоднократно госиспользованием PDMS из-за поглощения малых молекул⁷.

Чтобы избежать использования мягкой фотолитографии и штампов PDMS, мы описываем метод микропатии на основе трафаретных элементов, свободных от литографических одноклеточных элементов, который преодолевает многие препятствия, связанные с фотолитографией и мягкой литографией. В этом методе, гидрогель полиакриламид используется в качестве субстрата для ввода белка eCM на основе трафаретов, что позволяет селективное покрытие одного hiPSC-CMs. Этот метод очень совместим с полимерными материалами, используемыми в классических условиях клеточной культуры. Кроме того, при надлежащей очистке и обслуживании трафареты многоразовые и устойчивы к деградации и поглощению белка в процессе микрофабрикации. Наконец, процесс шаблонирования является технически надежным, недорогим, настраиваемым и доступным для тех, кто не имеет специализированных навыков биоинженерии. Этот трафарет на основе микропаттернинга техника была широко использована в наших последних публикациях моделирования разнообразных кардиомиопатий^8,9,10.

протокол

1. Изготовление отрицательного шаблона полиимидных трафаретов

1. Создайте шаблон(рисунок 2A) в формате .dxf с помощью программного обеспечения для проектирования с помощью компьютера (например, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
   1. Создайте круг (диаметр ю 22 мм) для разграничения границы трафарета.
   2. Нарисуйте твердую форму или желаемый узор.
   3. Включите хиральную букву (например, R), чтобы отметить переднюю сторону трафаретов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, массив квадратов и прямоугольников генерируется для шаблона iPSC-CMs на одноклеточных и клеточных парах. Файлы проектирования доступны (см. Дополнительные файлы). Предел разрешения микрофабрикации составляет 10 мкм.
2. Отправить дизайн в микрофабрикации компании лазерной огранки полиимидной пленки и изготовлению трафаретов(рисунок 2B,C).

2. Подготовка аликов сульфо-САНПАХ

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол изменен от Фишера и др.¹¹.

1. Используйте влагостойкий картонный образец ящика для хранения (например, 100 скважин, 10 х 10 мест для центрифуговых трубок, габариты: 13,4 см х 13,4 см х 5,1 см). Пометьте его "имя/дата/сульфо-САНПАХ 40 Л/восстановлено с 1200 Л Л ПБС".
2. Этикетка 50 микроцентрифуговых труб (полипропилен, 1,5 мл) с 'S' на крышке.
3. Возьмите 4 мл ангидроуса, дополнительный сухой диметилсульксид (DMSO) и стерильный фильтр растворса с помощью мембранного фильтра (размер пор - 0,22 мкм) в стерильную коническую трубку площадью 15 мл.
4. Приготовьте ванну с жидким азотом и накройте крышкой, чтобы свести к минимуму испарение жидкого азота.
5. Растворите 50 мг сульфо-САНПАХ а в 2 мл фильтрофильтрованного DMSO.
6. Вихрь хорошо полностью растворяется сульфо-САНПАХ в DMSO.
7. Распределите 40 аликотов сульфо-SANPAH в стерильные трубки 1,5 мл.
8. Перенесите трубки в коробку.
9. Флэш-заморозить трубки в жидком азоте в течение 5 мин.
10. Храните аликвоты при -80 градусах по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquots можно использовать на up to 6 месяцев без умаленной эффективности. Концентрация сульфо-САНПАХ составляет 25 мг/мл или 50,77 м/м/ м/

3. Стерилизация инструментов

1. Автоклав два щипца, 24 стеклянных крышки (22 х 22 мм, No 1 или No 1.5), одно лезвие бритвы, и три без ворса абсорбирующими салфетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать 12 конструкций гидрогеля, 24 стеклянные крышки необходимы. На конструкцию должно быть два крышки. Целесообразно подготовить некоторые запасные крышки.
2. Поместите две части парафина пленки (4 х 4 дюйма) в этанол устойчивых пластиковых поле (например, 1000 л пипетки наконечник поле) и стерилизовать их в свежем 70% этанола, по крайней мере 15 минут.

4. Приготовление раствора прекурсора полиакриламидного гидрогеля

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол изменен от Ли и др.¹².

1. Растворите 125 мг аминоэтилметакрилата (АЕМ) в 36,25 мл деионизированной воды в 50 мл полипропиленовой центрифугной трубки путем вихря.
2. Для подготовки 50 мл из 10 кПа полиакриламидового раствора прекурсора (8-0,15-15 мМ), смешайте 10 мл 40% раствора акриламида, 3,75 мл 2% раствора бис-акриламида и 36,25 мл раствора AEM, подготовленного в шаге 4,1 в новом 50 м полипропилуне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация раствора прекурсора составляет 8% акриламида, 0,15% бис-акриламид, и 15 мМ AEM, который был измерен, чтобы иметь жесткость 10 кПа атомной микроскопии силы. В соответствии с ткани приложений, представляющих интерес, жесткость гидрогеля может быть изменена путем изменения соотношения 40% акриламида на 2% бис-акриламид раствор. Например, 8% акриламида-0,08% бис-акриламид раствор дает 3 кПа гидрогелей; 8% акриламид-0,48% бис-акриламид раствор дает 38 кПа гидрогелей; 8% акриламид-0,48% бис-акриламид раствор дает 60 кПа гидрогелей. Рекомендуется подтвердить жесткость гидрогелей, изготовленных из растворов-прекурсоров с измененными соотношениями.

5. Подготовка решения для фотонинитиаторов

1. Для 1 мл 5% раствора фотонитиатора сначала растворите 50 мг 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпрофифенона порошок в 700 л 100% этанола в 1,5 мл полипропиленовой центрифуговой трубки с крышкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2-Гидрокси-4'-(2-гидроксиец)-2-метилпропиофенон не растворим в воде. Убедитесь в том, чтобы полностью растворить порошок в этаноле путем вихря.
2. После полного растворения 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпропиофенон в этанол путем вихря, добавить 300 л фосфат-буферного солей (PBS) для окончательного объема 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпропиофенон раствор составляет 5%. Неслопонный 5% раствор фотоинитиатора хорош в течение 4 недель при 4 градусах Цельсия.

6. Подготовка подвальной мембранной матрицы белкового раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица мембраны подвала (Таблица материалов) будет температур-чувствительным материалом. Убедитесь в том, чтобы работать на льду с охлажденной пипетки советы и трубки, а также ледяной растворов. Новый запас подвальной мембранной матрицы следует медленно размораживать на льду при 4 градусах Цельсия в одночасье.

1. Подготовьте 200 л подвальной мембранной матримовой белковой раствора на конструкцию гидрогеля. Для 12 конструкций необходимо 2,4 мл раствора белка мембранной матрицы. Подготовьте 10% дополнительного раствора (например, 2,6 мл).
2. Для каждой новой партии / много подвале мембраны матрицы белка раствор, оптимизировать коэффициент разбавления. Впервые, тест коэффициентов разбавления 1:10, 1:20, 1:40, чтобы найти коэффициент разбавления, который дает лучшие качества для клеточного шаблона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если подвальная мембранная матрица белковый раствор слишком вязкой, он будет образовывать гель на вершине трафарета, и это, скорее всего, отслаивается при удалении трафарета. Если белковый раствор слишком жидкий, он проникает через узорные отверстия трафаретов, что приведет к низкому качеству узорства.
3. Разбавлять подвальную мембранную матримальную белковую оболочку раствором на льду с измененным игловым исредним/питательным смешением F-12 (DMEM/F12) или 1x PBS к оптимизированному коэффициенту разбавления выше. Например, разбавить 120 л бульонного раствора в 2,4 мл средств DMEM/F12 (1:20) и держать на льду для последующего использования.

7. Изготовление гидрогеля

1. Поместите лампу для УФ-скамейки (365 нм, 4 мВт/см²⁾в капюшон биологической безопасности.
2. Поместите стерилизованные парафина пленки со ступени 3.2 и высушите полностью в стерильных условиях. Если парафиновые пленки не полностью сухие, используйте вакуумную систему аспирации, чтобы удалить любую остаточную жидкость. Поместите шесть автоматических крышки от шага 3.1 на каждом парафина пленки с помощью autoclaved щипц.
3. Приготовьте УФ-перекрестный раствор прекурсора полиакриламидов, разбавив 5% раствор фотоинитиатора (шаг 5.2) раствором прекурсора полиакриламида (шаг 4.2) в 50 мл полипропиленовой центрифугной трубки. Для 5 мл УФ-кросслинкия раствора прекурсора полиакриламида добавьте 50 зл 5% раствора фотоинитиатора к 5 мл раствора-прекурсора полиакриламида.
4. Фильтр решение прекурсора от шага 7.3 с помощью 50 мл фильтра единицы с 0,22 мкм размер пор для стерилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежее решение-прекурсор.
5. Распределить 200 зл полиакриламидов решение прекурсора от шага 7,4 на каждом 22 х 22 мм стеклянная крышка скольжения в парафин ежефабина Петри блюдо и тщательно накрыть еще 22 х 22 мм стеклянной крышкой сверху, чтобы бутерброд решение между (Рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параффин пленка используется, чтобы избежать разлива и ограничить решение прекурсора между крышками.
6. Поместите крышку содержащие Петри блюдо от шага 7.5 под ЛАМПой УФ скамейке и фотополимеризации полиакриламид гидрогели в течение 5 мин(рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхность небелая, уф-абсорбция поверхности снижает эффективность фотокроссуликов. Покрытие белой бумаги на небелой поверхности важно, чтобы свести к минимуму потери интенсивности УФ- Для защиты от УФ-излучения накройте лампу алюминиевой фольгой и надевайте очки для защиты от УЛЬТРАВ.
7. Тщательно отсоедините одну крышку от другого с помощью лезвия бритвы с помощью рычагов действий(рисунок 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель, как правило, придерживаться верхней крышкой. Обратите особое внимание при отходе крышки от мягкого гидрогеля, потому что он, скорее всего, сломается.
8. Заполните одноразовый полипропиленовый резервуар PBS. Перенесите гидрогель-покрывало композиты в содержащий PBS резервуар для промывки гидрогелей в PBS в течение 5 мин. После промывки поместите конструкцию гидрогеля обратно на парафина пленку в чашке Петри.

8. Спряжение белка

1. Подготовка ведро льда и precool PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для шести гидрогелей, 1200 Л холодного PBS необходимо.
2. Вынизить аликот сульфо-САНПАХ (1 флакон и 6 гелей).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, количество сульфо-SANPAH используется может быть уменьшена после оптимизации.
3. Добавьте 1200 л холодных PBS в флакон аликота сульфо-SANPAH и перемешайте, прокладывая вверх и вниз.
4. Распределить 200 л сульфо-САНПАХ на парафина в чашке Петри и накрыть гидрогелем-покрывальным композитом с гидрогелем, контактируя сульфо-САНПАХ (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сульфо-САНПАХх очень восприимчив к воде из-за гидролизов. Свежая оттепель от -80 градусов по Цельсию прямо перед использованием. Не используйте и не замораживайте остатки.
5. Вывешить гидрогель в ультрафиолетовую лампу на 365 нм, 4 мВт/см² в течение 5 мин для активации сульфо-САНПАХ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После воздействия, сульфо-SANPAH будет меняться с оранжевого на коричневый(рисунок 3E). Если гидрогель становится коричневым, это указывает на успешную активацию фенилазидной группы сульфо-САНПАХ и включение сульфо-САНПАХ на гидрогель. Непосредственно продолжайте шаги 8.6-8.9 в пределах максимум 10 мин, потому что активность сульфо-САНПАХ будет снижаться.
6. Пополнить одноразовый полипропиленовый резервуар свежим и пБС. После активации сульфо-САНПАХ перенесите активированные гидрогели и быстро промойте гидрогели в резервуаре PBS для удаления несвязанного сульфо-САНПАХа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительная стирка может привести к низкой эффективности спряжения белка.
7. После быстрого промыть, поместите гидрогель-прилагается крышки на парафина пленки в чашках Петри и тщательно мазок гидрогелей с стерильными салфетками без ворса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные PBS на вершине гидрогеля приведет к утечке подвала мембраны матрицы белка через трафарет, и сушка слишком широко приведет к разрыву гидрогеля при удалении трафарета из-за слишком высокой приверженности трафарет.
8. Поместите трафарет на верхней части гидрогеля и мазок с autoclaved ворса свободных салфетки для обеспечения плотного уплотнения между трафаретом и гидрогелем (Рисунок 3F).
9. Тщательно распределите 200 л разбавленного мембранного матемного белкового раствора, подготовленного с шага 6.3(Рисунок 3G)сверху. Оставьте на ночь в инкубаторе (37 градусов по Цельсию).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда трафарет-гидрогель контакт плотно и концентрация белка матрицы мембраны подвала эффективна, раствор протеина матрицы мембраны подвала будет sequestered и остает на верхней части трафарета(Рисунок 3H). При оптимизации время инкубации может быть сокращено. Теоретически, он может быть уменьшен до 30 мин-2 ч.
10. На следующий день, передать гидрогели на 6 хорошо пластины и полностью погрузить их в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется снять трафарет с погружением PBS над крышкой, чтобы предотвратить разрыв и прилипание гидрогеля к трафарету.
11. Тщательно удалите трафарет с помощью автоматически хотетов без разрыва гидрогеля. Отдохните хорошо с DMEM, вернуть узорчатые гидрогели в инкубатор, и оставить их на ночь, чтобы проверить на любое загрязнение.
12. Если средства массовой информации остаются ясными, гидрогели готовы к использованию для клеточного покрытия. Оптимизируйте плотность покрытия клеток и время инкубации, чтобы сделать сливку клеток для соответствующих атак.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для одноклеточного узора hiPSC-CMs, семян и инкубировать на ночь. Для посева рекомендуются следующие номера клеток: 30 000, 60 000 и 90 000 клеток/хорошо. Посев слишком много клеток приводит к более чем одной клетке на шаблон. Сотовый ситечко рекомендуется напрягать неодиночные клетки перед посевом клеток.
13. На следующий день, наблюдать привязанность клеток и распространение, и изменить средства массовой информации, чтобы избавиться от отдельных клеток.

9. Очистка использованных трафаретов

1. Чтобы удалить остаточные матричные белки на используемых трафаретах, погрузите трафареты в ферментный раствор(Таблица Материалов) в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент должен быть выбран в зависимости от используемых матричных белков. Для раствора матричного белка, богатого коллагеном, используйте коллагенеза. Также рекомендуется ультразвуковая ультразвуковая а10-15 мин в ферментном растворе.
2. Аспирируй раствор и пополняй 10% отбеливателя. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
3. Промыть 3x с PBS.
4. Хранить в 70% этанола при 4 градусах Цельсия до использования.

Результаты

Было продемонстрировано изготовление трафаретов, содержащих массив квадратов или прямоугольников(рисунок 4A). Следуя этому протоколу, мы получили узорчатые матричные протеиновые острова(рисунок 4B и рисунок 5A)и клетки(рисунок...

Обсуждение

Мы описываем метод микропаттернирования на основе литографии, который позволяет эффективно узорить клетки адептов. В этом протоколе мы демонстрируем узорство hiPSC-CMs в различных соотношений длины и ширины путем микропаттернинга подвальной мембранной матрицы белковых островов на гидр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)	Sigma-Aldrich	516155
Acrylamide solution 40% (solution)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics	Acros Organics	326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane	Millipore	SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	custom design
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzyme used for stencil cleaning