CXCR4在Murine B-1a细胞上的逆转录病毒过度表达和靶向B-1a细胞向骨髓和IgM生产转移的采用转移

摘要

在这里，我们描述了一种抗逆转录病毒过度表达和采用迁移的鼠B-1a细胞的方法，以检查体内B-1a细胞的迁移和定位。该协议可扩展到不同的下游功能检测，包括定量供体B-1a细胞定位或分析供体细胞衍生分泌因子的收养后转移。

摘要

由于细胞功能受细胞微环境中利基特定因素的影响，剖析细胞定位和迁移的方法可以进一步洞察细胞功能。B-1a细胞是小鼠中一个独特的B细胞子集，在健康和疾病期间产生保护性天然IgM抗体，防止氧化特异性表皮。B-1a细胞IgM的产生因B-1a细胞位置而异，因此从治疗的角度来看，将B-1a定位目标定位到支持高抗体生产的利基领域变得有用。在这里，我们描述了一种方法，通过逆转录病毒介导的C-X-C图案化学酶受体4（CXCR4）的过度表达，将B-1a细胞迁移到骨髓。原鼠B细胞的基因诱导可能具有挑战性，通常根据技术产生10-20%的低转染效率。在这里，我们证明原鼠B-1a细胞的逆转录病毒转导可产生30-40%的转染效率。该方法利用转导B-1a细胞的采用细胞转移到B细胞缺陷受体小鼠中，使供体B-1a细胞迁移和定位得到可视化。该协议可用于其他逆转录病毒结构，可用于收养后转移后的各种功能检测，包括对供体细胞或宿主细胞表型和功能的分析，或B-1a细胞转移后分泌的可溶性因子的分析。使用以CD45.1和CD45.2等位类型区分的不同供体和受体小鼠，并在逆转录病毒质粒体内存在GFP报告器，还可以检测含有内源性B细胞群的其他免疫充足的小鼠模型中的供体细胞。

引言

最近的研究表明，相当多的免疫细胞，特别是B细胞，皮质和功能异质性取决于细胞定位^{11，2，3，4，5。2,3,4,5}B-1a细胞是具有异质性产生保护性IgM抗体的杂质能力的一个群体;骨髓B-1a细胞分泌IgM，对血浆IgM成形¹⁰剂⁶有显著贡献，而心内性B-1a细胞在平衡性时具有低水平IgM分泌，而是可以通过先天多收费的受体（TLR）或细胞因子介导的信号激活，以迅速增殖、迁移和分泌IgM7、8、9。^7,8,9,B-1a细胞IgM抗体可识别病原体、凋亡细胞和氧化LDL上存在的氧化特异性表皮（OSE），与OSE结合的IgM可以预防动脉粥样硬化¹¹等疾病的炎症性下游信号。因此，通过增加对骨髓等部位的细胞迁移来增加IgM产量的策略可能具有治疗性。然而，这种策略必须针对和细胞类型特定，因为非目标效应可能对免疫功能或健康产生负面影响。

在这里，我们描述了一种在原鼠B-1a细胞中针对和长期过度表达CXCR4的方法，以及随后的采用转移，以可视化细胞迁移和功能IgM抗体的产生（图1）。与转化细胞系的转染相比，原发B细胞的基因操作受到转染效率低的限制。然而，由于转化的细胞系可以显著偏离原细胞^{1212，13，13}使用原细胞可能会提供的结果，更紧密地配合正常生理。在原鼠B细胞的基因转移中，已经描述了几种技术，包括逆转录病毒转导、脱病毒转导、脂肪化或电穿孔型转染，其效率、转化性和对细胞健康的影响^{13、14、15。,1513,}以下方法采用逆转录病毒转导，因为它产生了足够的基因转移效率>30%，同时对细胞生存能力的影响最小。CXCR4表达逆转录病毒是使用前面描述的逆转录病毒构造鼠干细胞-内部核糖体进入部位-绿色荧光蛋白（MSCV-IRES-GFP） 产生的;MigR1）^16，其中小鼠CXCR4基因被子克隆^4。MigR1（控制（Ctl）-GFP和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒是使用磷酸盐钙转染产生的，如先前公布的协议^44、1414所述。

成功转导的B-1a细胞随后被静脉注射转移到淋巴细胞缺乏的^{Rag1-/----小鼠}中。供体小鼠和受体小鼠还含有对脂蛋白E（ApoE）基因的敲除，导致OSE积累和动脉粥样硬化增加，从而为体内B-1细胞活化和IgM生产提供了一个模型。此外，供体小鼠和受体小鼠在CD45等位型上有所不同;供体B-1细胞来自CD45.1+ApoE-/-----^小鼠，并转移到^Rag1-/- CD45.2+ApoE-/------^受体。这允许在移植后将供体CD45.1与受体CD45.2 B细胞区分，而无需在流细胞测量分析期间为B细胞标记额外染色。这里提供的结果表明，B-1a细胞上的目标CXCR4过度表达与B-1a细胞迁移到骨髓的能力增强有关，骨髓与血浆抗OSE IgM增加有关。我们还提供了一种通过负选择来丰富圆锥体B-1细胞的方法，并演示了B-1细胞激活对有效转导的要求。该方法可应用于其他逆转录病毒构造，以研究蛋白质过度表达对B-1a细胞迁移、表型或功能的影响。此外，使用CD45.1与CD45.2等位基因区分理论上可以允许转移到含有内源性B细胞的其他免疫足够的鼠型。

研究方案

所有动物协议都得到弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。

1. 圆锥形B-1细胞的磁分离和浓缩

1. 使用 CO₂对 12-14 周大、男性、CD45.1⁺ApoE^-/-鼠标进行安乐死。
2. 使用笔直的手术剪刀在腹部进行表面切割，并用弯曲的剪刀剥去皮肤，露出腹壁。使用 10 mL 注射器和 25 G 针，以 10 mL 37 °C RPMI-1640 介质的 10 mL 冲洗穿孔腔。摇动鼠标以分离细胞，抓住尾部，将鼠标侧完全移到一侧，进行 15~20 s。
   注:按摩灭黄的围膜也可以最大化细胞恢复。
3. 使用10 mL注射器和25 G针收集围锥液，在肠子正上方，靠近肠道的臀部水平上方抽取液体。避免破坏表皮脂肪库和基础器官。避免从鼠标左侧抽取液体，因为脂肪很容易被吸入注射器中。
4. 收集约6~7mL的液体后，分配成放置在冰上的50mL锥形管。接下来，使用钳子将锥形上方的圆锥壁垂直抬起鼠标，使任何剩余的液体都留在圆锥腔的底部。使用肝脏上方的手术剪刀（确保不要割伤肝脏），并使用玻璃移液器和灯泡收集剩余的盘面液体，在围锥壁上做一个小切口。
5. 池围锥洗涤细胞从所有CD45.1⁺ApoE^{-/- 小鼠}（n = 15+20）到50mL锥形管，并储存在冰上。
   注:用于计算所需的小鼠数量:B-1a细胞占总圆锥体总种群的5-10%，每只小鼠在作者手中的细胞中大约产生2.5×5⁵ B-1a细胞。转导效率为±30~40%，如下所示。
6. 使用活性染料（如锥菊蓝色和血细胞计）计算活细胞（在锥体蓝色中稀释样品 1:5，并将 10 μL 加载到血细胞计室）。每个管最多 1 x 10⁸个单元的池细胞。离心细胞在400 x g下5分钟，在4°C下，然后吸气上清剂。
7. 在1 mL的抗CD16/CD32抗体（材料表）中重新悬浮高达1 x 10⁸细胞，稀释1:50在测定缓冲液（1x磷酸盐缓冲盐水[PBS]，0.5%牛血清白蛋白[BSA]，2 mM EDTA），以阻断Fc受体。根据需要缩放，具体取决于单元格计数。在4°C下在冰上孵育10分钟。
8. 在测定缓冲液中制备生物微化抗体的2倍主混合物（表1）以进行耗竭。2x 主混合物占细胞在孵育抗 CD16/CD32 时已经处于的液体体积。例如，如果细胞在稀释的抗CD16/CD32500μL中孵育，则加入含有10μL生物微化Ter119、Gr-1、CD23和NK1.1抗体的200μL和25μL的生物微化F4/80抗体，以达到表1中给出的最终浓度。在4°C下，将2倍主混合物添加到细胞中，并在20分钟内染色。
9. 用5 mL的测定缓冲液和离心机在4°C下用g5 mL的测定缓冲液和离心机清洗5分钟，并在4°C下吸气上清。
10. 根据制造商建议的浓度和协议，在测定缓冲液中稀释了抗生物青珠（材料表）的悬浮和孵育细胞。
11. 用5 mL的测定缓冲液和离心机在4°C下在400 x g下清洗5分钟。在500μL的测定缓冲液中吸气上清液并重新悬浮至1 x 10⁸细胞。
12. 带3 mL检测缓冲液的优质磁选柱（材料表）。将细胞转移到引物磁选择柱上，并在冰上15mL锥形管中收集含有富集B-1细胞的洗脱剂。使用额外的检测缓冲液清洗磁选柱，直到收集的总体积为 10 mL。
    注:预纯化和纯化后细胞分数的分配额应通过流细胞测定单独分析，通过染色CD19+B细胞、F480+巨噬细胞和CD5+T细胞，实现纯化效率，如图2所示。
13. 计算后纯化细胞分数（含有富集B-1细胞的洗脱剂），计算像步骤1.6那样的活细胞， 在B细胞培养基中重新悬浮在1 x 10⁶细胞/mL（RPMI-1640，10%热灭活胎儿牛血清[FBS]，10 mM HEPES，1倍非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠，50微克/mL根氨基素，55 μMβ-甲醇）。

2. 围肠B-1细胞刺激

1. 为两个传感器条件（Ctl-GFP 和 CXCR4-GFP）分离池细胞，同时为非转导控制留出并电镀至少 10 x 10⁶个单元。
2. 每口板高达 150 μL（150，000 个细胞），放入 96 孔圆底板中。
3. 在所有孔中加入 100 nM TLR9 激动剂 ODN1668，以刺激细胞增殖。
4. 在37°C下孵育16~18小时_，CO25% 。

3. 腹围B细胞的逆转录病毒转导

1. 使用磷酸盐转染钙产生Ctl-GFP（MigR1）和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒，如先前公布的协议¹⁴所述。
   注:这将需要几天，所以准备和脚点逆转录病毒储存和存储等号在-80°C之前，开始此协议。
2. 解冻冰上的逆转录病毒种群。立即使用，并且不重新冻结，因为病毒点位在冻结-解冻周期期间显著减少。在55μM最终浓度下，在8μg/mL聚苯乙烯和新鲜β-甲醇的情况下，在20:1多种感染（MOI）的细胞中加入Ctl-GFP或CXCR4-GFP逆转录病毒超级发电机。不要向为非转导控制而预留的细胞添加病毒储存。
3. 在室温下，在 800 x g下通过离心板进行 90 分钟的分蒸。
4. 在37°C下孵育带逆转录病毒的板，再孵育3小时，再孵育5%的_CO2。
5. 在新鲜的B细胞介质中收获和重新镀细胞，并在37°C下孵育，5%CO₂过夜。

4. 转导性圆锥体B-1a细胞的细胞分拣

1. 收获培养细胞和池成三个单独的50mL锥形管为每个条件:非转导，Ctl-GFP转送，和CXCR4-GFP转送。
2. 将活细胞数为步骤 1.6 中，然后在 400 x g 下以 400 x g的离心机在 4 °C 下 5 分钟，然后吸气上清。
3. 在含有1:50抗CD16/CD32抗体（材料表）的100，000个细胞/μL的排序缓冲液（PBS = 1% BSA）上重新悬浮细胞，以阻止Fc受体。在4°C下在冰上孵育10分钟。
4. 用于补偿控制的无分量细胞（每次补偿控制约30，000细胞）:用于非转导样品的未染色和单染色控制等值，以及来自转导样品的 GFP 单染色控制等值。
   注:如果非转导细胞数较低，商业上可用的补偿珠也可以用于单染色控制。
5. 准备含有类缓冲液的氟磷联体抗体的2倍抗体母体混合物（表1）。将 2 倍主混合添加到非转导、CTL-GFP 转导和 CXCR4-GFP 转导样品中。将单个抗体添加到单个污渍对照组。在黑暗中4°C孵育20分钟。
   注:2x 主混合物占细胞在用抗 CD16/CD32 孵育时已经处于的液体量，如步骤 1.8 中。CXCR4 可以单独染色每个条件的细胞等号，以确认 CXCR4 过度表达。
6. 用 1 mL 的排序缓冲液清洗样品，并通过 70 μm 过滤器将菌株放入聚丙烯管中。
7. 在 4°C 下在 400 x g下离心 5 分钟，吸气上清。在排序缓冲器中以 50，000 个单元/μL 重新挂起样本。
8. 在细胞分拣之前，制备标有荧光活性细胞分拣（FACS）的收集管，含有1 mL的收集介质（RPMI-1640，20%热灭活FBS，10 mM HEPES，1倍非必需氨基酸，1 mM丙酸钠，50微克/mL根氨基胺，55 μM β-汞酮乙醇），每个种群要分类。
9. 在细胞分拣机上运行样本之前，添加 2x DAPI（准备为 1:5000 分液缓冲液稀释），用于死细胞歧视。
10. 将 GFP® B-1a 细胞分类到包含 DAPI 采集介质的 FACS 管中^， CD19⁺ GFP⁺ B220^中洛CD23^- IgM⁺ CD5⁼ CTL-GFP 和 CXCR4-GFP 样品中的细胞。使用非转导样品设置 GFP® 栅极，并排序 DAPI^- CD19⁺ GFP^- B220^中洛CD23^- IgM⁺ CD5⁺非转导 B-1a 电池。
    注:或者，通过单独在GFP-分数内对B-1a细胞进行浇注，也可以从CTL-GFP和CXCR4-GFP样品中对非转导细胞进行排序。转导或非转导B-1b细胞也可以使用这种策略作为DAPI^- CD19⁺ GFP^+/- B220^中洛CD23^- IgM⁺ CD5^-细胞排序。

5. 收养转移

1. 细胞分拣后，在4°C下以400 x g的离心细胞5分钟，并小心吸气上清剂。
2. 在1，000个细胞/μL下重新悬浮冷无菌1xPBS中的细胞。
3. 使用同氟拉涅麻醉雄性Rag1^{-/-----------/----------小鼠}，并使用超细胰岛素注射器通过静脉追溯轨道或尾静脉注射每只小鼠注射100μL（100，000个细胞）。^-/-注射几只小鼠，用1xPBS作为对照。

6. 供体细胞和血浆IgM的定量化

1. 在收养后转移后的预期时间，通过骨髓和脾组织收获⁴和流动细胞测定分析受体小鼠的转移细胞。通过染色 CD45.1、CD45.2 和 CXCR4 来量化供体细胞定位和 CXCR4 过度表达，并使用 Flowjo 等软件分析流细胞测定结果。
   注: 有关此步骤中使用的抗体，请参阅表 1。确保不使用抗体结合，氟在FITC通道中，因为GFP将存在于转导的供体细胞。
2. 通过在动物牺牲时通过心脏穿刺采集的全血中加入10μL0.5M EDTA来分离血浆。将全血在 7，000 x g下，将血浆离心到单独的 1.5 mL 离心机管中。储存在-80°C，直到通过ELISA⁴对分泌因子（如IgM）进行分析。

结果

图 1给出了协议的概述。图 2显示了其他锥形细胞类型的磁耗竭后，圆锥形 B-1a 细胞的富集。与F4/80+ 巨噬细胞相比，后耗尽分数中的活单细胞的CD19+B细胞比例⁺更高，缺乏CD5^HI CD19^- T细胞，并且与预耗尽分数相比，CD19⁺ CD5^中B-1a细胞的频率增加。图 3显示了 B 细胞激活对成功逆转录病毒 B 细胞?...

讨论

此处提供的方法可实现稳定且相对高效的原发B-1a细胞基因传递、体内采用转移以及注射细胞的识别和定位。细胞在细胞转移后17周被检测到，并保留增加的CXCR4表达。逆转录病毒介导的传递使原鼠B-1a细胞的转导效率为30-40%，对我们手中的细胞生存能力的影响最小（图4e）。这与Moghimi及其同事先前的一项研究的结果一致，该研究将基因转移技术与原发性鼠B细胞（包括逆转录病...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 micron filter caps	Falcon	352235
anti-biotin microbeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block	Life Technologies	MFCR00
B220 APC	eBioscience	17-0452-83	Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
CD19 APCef780	eBioscience	47-0193-82	Clone: eBio1D3
CD23 biotin	eBioscience	13-0232-81	Clone: B3B4
CD23 PECy7	eBioscience	25-0232-82	Clone: B3B4
CD3e biotin	eBioscience	13-0033-85	Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560580	Clone: A20
CD45.2 BV421	BD Biosciences	562895	Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD5 PE	eBioscience	12-0051-83	Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC	eBioscience	17-9991-82	Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin	Life Technologies	MF48015	Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6	Treestar Inc.	License required
Gentamicin	Gibco	15710-064
Gr-1 biotin	eBioscience	13-5931-82	Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum	Gibco	16000-044
HEPES	Gibco	15630-080
IgM PECF594	BD Biosciences	562565	Clone: R6-60.2
Insulin syringes	BD Biosciences	329461
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405
Live/Dead Yellow	Life Technologies	L34968
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
NK1.1 biotin	BD Biosciences	553163	Clone: PK136
Non-essential amino acids	Gibco	11140-050
ODN 1668	InvivoGen	tlrl-1668
PBS	Gibco	14190-144
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Ter119 biotin	eBioscience	13-5921-82	Clone: Ter119