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Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour la surexpression rétrovirale et le transfert adoptif des cellules murines B-1a pour examiner in vivo la migration et la localisation de cellules de B-1a. Ce protocole peut être étendu pour divers essais fonctionnels en aval, y compris la quantification de la localisation de cellules B-1a du donneur ou l’analyse des facteurs sécrétés dérivés de cellules de donneurs après le transfert d’adoption.

Résumé

Comme la fonction cellulaire est influencée par des facteurs spécifiques à la niche dans le microenvironnement cellulaire, les méthodes pour disséquer la localisation cellulaire et la migration peuvent fournir un aperçu plus approfondi de la fonction cellulaire. Les cellules B-1a sont un sous-ensemble unique de cellules B chez la souris qui produisent des anticorps IgM naturels protecteurs contre les épitopes spécifiques à l’oxydation qui surviennent pendant la santé et la maladie. La production d’IgM à cellules B-1a diffère selon l’emplacement de la cellule B-1a, et il devient donc utile d’un point de vue thérapeutique de cibler la localisation B-1a à des niches soutenant la production élevée d’anticorps. Ici, nous décrivons une méthode pour cibler la migration de cellules B-1a à la moelle osseuse par surexpression rétrovirale-négociée du récepteur de chimiokine de motif de C-X-C 4 (CXCR4). L’induction génétique dans les cellules B murines primaires peut être difficile et donne généralement de faibles efficacités transfection de 10-20% selon la technique. Ici, nous démontrons que la transduction rétrovirale des cellules B-1a murines primaires entraîne une efficacité de transduction de 30-40%. Cette méthode utilise le transfert cellulaire adoptif des cellules transitoires B-1a dans les souris bénéficiaires déficientes en cellules B afin que la migration et la localisation des cellules B-1a du donneur puissent être visualisées. Ce protocole peut être modifié pour d’autres constructions rétrovirales et peut être utilisé dans divers essais fonctionnels post-transfert adoptif, y compris l’analyse de la cellule du donneur ou du phénotype et de la fonction des cellules hôtes, ou l’analyse des facteurs solubles sécrétés après le transfert cellulaire B-1a. L’utilisation d’allotypes distincts de donneurs et de receveurs différenciés par l’allotype CD45.1 et CD45.2 et la présence d’un journaliste de GFP dans le plasmide rétroviral pourrait également permettre la détection des cellules de donneur dans d’autres modèles murins immunosuffants contenant des populations endogènes de cellules B.

Introduction

Des études récentes ont démontré des cellules immunitaires considérables, et plus particulièrement la cellule B, l’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle selon la localisation cellulaire1,2,3,4,5. Les cellules B-1a sont l’une de ces populations avec la capacité hétérogène de produire des anticorps protecteurs d’IgM ; Les cellules de moelle osseuse B-1a sécrètent IgM de façon constitutive et contribuent de manière significative aux tituses plasmatiques IgM6, tandis que les cellules peritonéal B-1a ont la sécrétion IgM de bas niveau à l’homéostasie et peuvent plutôt être activées par le récepteur inné de type péage (TLR) ou la signalisation cytokine-négociée pour proliférer rapidement, migrer, et sécrétion IgM7,8, 9,9109. Les anticorps IgM à cellules B-1a reconnaissent les épitopes spécifiques à l’oxydation (OSE) qui sont présents sur les agents pathogènes, les cellules apoptotiques et le LDL oxydé, et la liaison IgM à l’OSE peut prévenir la signalisation inflammatoire en aval dans des maladies comme l’athérosclérose11. Par conséquent, les stratégies visant à augmenter la production d’IgM par l’augmentation de la migration péritonéale de cellules B-1a vers des sites comme la moelle osseuse peuvent être thérapeutiquement utiles. Cependant, il est important que de telles stratégies soient ciblées et spécifiques de type cellulaire, car les effets hors cible peuvent avoir un impact négatif sur la fonction ou la santé immunitaires.

Ici, nous décrivons une méthode de surexpression ciblée et à long terme de CXCR4 dans les cellules B-1a murines primaires et le transfert adoptif subséquent pour visualiser la migration cellulaire et la production fonctionnelle d’anticorps IgM (figure 1). La manipulation génétique des cellules B primaires est limitée par une faible efficacité transfection par rapport à la transfection des lignées cellulaires transformées. Cependant, comme les lignées cellulaires transformées peuvent s’écarter considérablement des cellules primaires12,13, l’utilisation de cellules primaires est susceptible de fournir des résultats qui s’alignent plus étroitement à la physiologie normale. Plusieurs techniques ont été décrites pour le transfert de gènes dans les cellules B murines primaires, y compris la transduction rétrovirale, la transduction adénovirale, la lipofection, ou la transfection basée sur l’électroporation, qui ont des niveaux variables d’efficacité, d’éphémère, et d’impact sur la santé cellulaire13,14,15. La méthode suivante a utilisé la transduction rétrovirale car elle a donné une efficacité adéquate de transfert de gène de 'gt;30% tout en ayant un impact minimal sur la viabilité cellulaire. Le rétrovirus CXCR4-exprimant a été généré à l’aide de la protéine fluorescente ribosomal-verte de la construction rétrovirale décrite précédemment par le virus des cellules souches murines (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, dans lequel la souris CXCR4 gène a été sous-cloné4. Les particules rétrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) et CXCR4-GFP ont été générées à l’aide de la transfection de phosphate de calcium telle qu’elle a été décrite dans les protocoles4,14précédemment publiés.

Les cellules de B-1a transdurées avec succès ont ensuite été transférées par voie intraveineuse dansrag1-/- souris lymphocytes-déficientes. Les souris de donneur et de destinataire ont en outre contenu le knock-out du gène E (ApoE) d’apolipoprotein, qui a comme conséquence l’accumulation et l’athérosclérose accrues d’OSE, fournissant ainsi un modèle pour l’activation in vivo de cellules B-1 et la production d’IgM. En outre, les souris de donneur et de destinataire différaient dans l’allotype de CD45 ; Les cellules B-1 du donneur provenaient de CD45.1MD ApoE-/- des souris et ont été transférées dans Rag1-/- CD45.2 ApoE-/- receveurs. Ceci a permis la différenciation du CD45.1 de donneur des cellules CD45.2 B destinataire après le transfert sans avoir besoin de tache en outre pour des marqueurs de cellules B pendant l’analyse de cytométrie d’écoulement. Les résultats fournis ici démontrent que la surexpression ciblée de CXCR4 sur les cellules de B-1a associe à la capacité accrue des cellules de B-1a de migrer vers la moelle osseuse, qui associe à l’augmentation de l’anti-OSE IgM plasmatique. Nous fournissons en outre une méthode pour l’enrichissement des cellules péritonéales B-1 par la sélection négative et démontrons l’exigence de l’activation de cellules B-1 pour la transduction efficace. Cette méthode peut être adaptée à d’autres constructions rétrovirales pour étudier l’effet de la surexpression des protéines sur la migration, le phénotype ou la fonction des cellules B-1a. En outre, l’utilisation de CD45.1 contre la distinction d’allotype de CD45.2 pourrait théoriquement permettre le transfert dans d’autres modèles murins immuno-suffisants contenant des cellules B endogènes.

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Protocole

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie.

1. Séparation magnétique et enrichissement des cellules péritonéales B-1

  1. Euthanasiez une souris de 12 à 14 semaines, mâle,+CD45.1 -ApoE-/- souris utilisant le CO2.
  2. Faire une coupe superficielle dans l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux droits et éplucher la peau à l’aide de ciseaux incurvés pour exposer la paroi péritonéale. Rincer la cavité péritonéale avec 10 ml de milieu RPMI-1640 de 10 ml à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 25 G. Secouez la souris pour désengager les cellules en saisissant la queue et en déplaçant la souris d’un côté à l’autre à fond pendant 15 à 20 s.
    REMARQUE : Le massage du péritoine lavé peut également maximiser la récupération cellulaire.
  3. Recueillir du liquide péritonéal à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 25 G en traçant du liquide sur le côté inférieur droit du péritoine juste au-dessus du niveau de la hanche, près des intestins. Évitez de perturber les dépôts de graisse épidydimal et les organes sous-jacents. Évitez de tirer du liquide du côté gauche de la souris car la graisse omentale peut facilement être entraînée dans la seringue.
  4. Une fois que 6 à 7 ml de liquide sont collectés, distribuez-les dans un tube conique de 50 ml placé sur la glace. Ensuite, élever la souris verticalement en tenant la paroi péritonéale au-dessus du diaphragme à l’aide de forceps de sorte que tout fluide restant reste au fond de la cavité péritonéale. Faire une petite coupure dans la paroi péritonéale à l’aide de ciseaux chirurgicaux au-dessus du foie (assurez-vous de ne pas couper le foie) et de recueillir tout liquide péritonéal restant à l’aide d’un tuyauterie en verre et une ampoule.
  5. Piscine des cellules de lavage péritonéales de tous les CD45.1-/- souris (n 15-20) en tubes coniques de 50 ml, et stocker sur la glace.+
    REMARQUE : Pour calculer le nombre de souris nécessaires : les cellules B-1a représentent 5 à 10 % de la population péritonéale totale et produisent environ 2,5 à 5 x 10cellules B-1a par souris dans les mains des auteurs. L’efficacité de la transduction est de 30 à 40 %, comme indiqué ci-dessous.
  6. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un colorant de viabilité comme le bleu trypan et un hémocytomètre (diluer les échantillons 1:5 en bleu trypan et charger 10 l dans la chambre de l’hémocytomètre). Cellules de piscine jusqu’à 1 x 108 cellules par tube. Cellules de centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC, puis supernatant d’aspiration.
  7. Resuspendez jusqu’à 1 x10 8 cellules dans 1 ml d’anticorps anti-CD16/CD32 (Tableau des matériaux) dilué 1:50 dans tampon d’essai (1x phosphate tamponné saline [PBS], 0,5% album de sérumine bovine [BSA], 2 mM EDTA) afin de bloquer les récepteurs Fc. Échelle au besoin en fonction du nombre de cellules. Incuber sur la glace pendant 10 min à 4 oC.
  8. Préparer un mélange principal 2x des anticorps biotinylés(tableau 1) dans un tampon d’essai pour l’épuisement. Le mélange de maître 2x explique le volume du liquide dans lequel les cellules sont déjà en incuber avec l’anti-CD16/CD32. Par exemple, si les cellules couvent dans 500 L d’anti-CD16/CD32 dilués, puis ajouter 500 L de 2x master mix contenant 10 L d’anticorps biotinylés Ter119, Gr-1, CD23 et NK1.1, et 25 L d’anticorps F4/80 biotinylés pour atteindre les concentrations finales données dans le tableau 1. Ajouter le mélange principal 2x aux cellules et tacher pendant 20 min à 4 oC.
  9. Laver les cellules avec 5 ml de tampon d’essai et de centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et supernatant aspiré.
  10. Les cellules de résuspendance et d’incubation avec des microbilles anti-biotine(tableau des matériaux) diluées dans le tampon d’analyse selon la concentration et le protocole recommandés par le fabricant.
  11. Laver avec 5 ml de tampon d’essai et de centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant et la résuspendance jusqu’à 1 x10 8 cellules dans 500 l de tampon d’essai.
  12. Colonnes de sélection magnétique principale(Tableau des matériaux) avec 3 ml de tampon d’essai. Transférer les cellules sur des colonnes de sélection magnétique apprêtée et recueillir l’eluent contenant des cellules B-1 enrichies dans un tube conique de 15 ml sur glace. Laver la colonne de sélection magnétique avec tampon d’analyse supplémentaire jusqu’à ce que le volume global recueilli est de 10 ml.
    REMARQUE : Un aliquot des fractions cellulaires pré-purifiées et post-purifiées devrait être analysé séparément par cytométrie de débit pour l’efficacité de purification en colorant pour les cellules CD19 B, les macrophages F480 et les lymphocytes T CD5MD comme le montre la figure 2.
  13. Comptez la fraction cellulaire post-purifiée (l’eluent contenant des cellules B-1 enrichies) en comptant les cellules vivantes comme à l’étape 1.6, et résout à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de la culture cellulaire B (RPMI-1640, Sérum bovin foetal inactivé à la chaleur de 10 % [FBS], 10 mM HEPES, 1x acides aminés non essentiels, 1 mM pyruvate de sodium, 50 g/mL gentamicine, 55 M-mercaptoethanol).

2. Stimulation cellulaire peritonéal B-1

  1. Fractionner les cellules mises en commun pour les deux affections transduites (Ctl-GFP et CXCR4-GFP), tout en mettant de côté et en placageant au moins 10 x 106 cellules pour un contrôle non transduit.
  2. Plaque jusqu’à 150 l (150 000 cellules) par puits en plaques de fond rond de 96 puits.
  3. Ajoutez 100 nM TLR9 agoniste ODN1668 à tous les puits pour stimuler la prolifération cellulaire.
  4. Incuber pour 16-18 h à 37 oC, 5% de CO2.

3. Transduction rétrovirale des cellules péritonéales B

  1. Générer des particules rétrovirales Ctl-GFP (MigR1) et CXCR4-GFP à l’aide de la transfection de phosphate de calcium telle que décrite dans les protocoles14précédemment publiés.
    REMARQUE : Cela prendra plusieurs jours, alors préparez et iterez les stocks rétroviraux et entreposez les aliquots à -80 oC avant de commencer ce protocole.
  2. Dégel des stocks de rétrovirus sur la glace. Utilisez immédiatement et ne régelez pas que le virus titer diminue considérablement pendant les cycles de gel-dégel. Ajouter les supernatants rétroviraux Ctl-GFP ou CXCR4-GFP à 20:1 multiplicité d’infection (MOI) aux cellules, en présence de polybrene de 8 g/mL et de mercaptoethanol frais à 55 M de concentration finale. N’ajoutez pas de stocks viraux aux cellules mises de côté pour le contrôle non transduit.
  3. Effectuer la spinfection par plaques centrifuges à 800 x g pendant 90 minutes à température ambiante.
  4. Plaques incubate avec rétrovirus à 37 oC, 5% de CO2 pour un supplément de 3 h.
  5. Récoltez et replatez les cellules dans le milieu frais des cellules B et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit.

4. Tri cellulaire des cellules péritonéniques transduites B-1a

  1. Récoltez les cellules cultivées et la piscine en trois tubes coniques distincts de 50 ml pour chaque condition : non transductés, Ctl-GFP transduits et CXCR4-GFP transducés.
  2. Comptez les cellules vivantes comme dans l’étape 1.6, puis la centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et le supernatant aspiré.
  3. Résuspendez les cellules à 100 000 cellules/L en mémoire tampon (PBS et 1% BSA) contenant 1:50 anticorps anti-CD16/CD32(Tableau des matériaux)afin de bloquer les récepteurs Fc. Incuber sur la glace pendant 10 min à 4 oC.
  4. Cellules d’Aliquot pour des contrôles de compensation (30.000 cellules par contrôle de compensation) : pour les contrôles non souillés et les contrôles de la tache unique de l’échantillon non transduit et pour l’aliquot de contrôle des taches uniques GFP à partir d’échantillons transduits.
    REMARQUE : Les perles de compensation disponibles dans le commerce peuvent être utilisées alternativement pour des contrôles de tache simples si le nombre de cellules non transduites est faible.
  5. Préparer un mélange de maître d’anticorps 2x contenant les anticorps fluorophore-conjugués dans le tampon de tri(tableau 1). Ajoutez le mélange principal 2x aux échantillons transductés non transduits, CTL-GFP et CXCR4-GFP transductés. Ajouter des anticorps individuels aux contrôles de la tache unique. Incuber pendant 20 min à 4 oC dans l’obscurité.
    REMARQUE : Le mélange principal 2x explique le volume de liquide dans lequel les cellules sont déjà en incuber avec l’anti-CD16/CD32, comme à l’étape 1.8. Un aliquot de cellules de chaque condition peut être taché séparément pour CXCR4 pour confirmer la surexpression CXCR4.
  6. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon de tri et filtrer à travers 70 m filtres dans des tubes de polypropylène.
  7. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et supernatant d’aspiration. Résuspendez des échantillons à 50 000 cellules/L en mémoire tampon.
  8. Avant le tri cellulaire, préparer des tubes de tri cellulaires activés par la fluorescence (FACS) contenant 1 ml de moyen de collecte (RPMI-1640, 20 % de FBS inactivés à la chaleur, 10 mM HEPES, 1x acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 g/mL gentamicine, 55 m-mercaptoethanol) pour chaque population à trier.
  9. Avant d’exécuter des échantillons sur le trieur cellulaire ajouter 2x DAPI (préparé comme 1:5000 dilution dans le tampon de tri) pour la discrimination des cellules mortes.
  10. Trier les cellules GFP B-1a dans des tubes FACS contenant des cellules de collecte moyennes comme DAPI- CD19- GFP- B220mi-lo CD23- IgMET CD5- cellules des échantillons CTL-GFP et CXCR4-GFP. Utilisez l’échantillon non transduit pour définir la porte GFP ET trier les cellules B-1a non transduites deCD19 + - B220mi-lo - IgMet CD5.+
    REMARQUE : Alternativement, les cellules non transduites peuvent également être triées à partir des échantillons CTL-GFP et CXCR4-GFP en gifiant séparément les cellules B-1a dans la fraction GFP. Les cellules B-1b transduites ou non transduites peuvent également être triées à l’aide de cette stratégie de tri sous le titre DAPI- CD19- GFP-/- B220mid-lo CD23- IgM- CD5- cells.

5. Transfert d’adoption

  1. Après le tri cellulaire, les cellules de centrifugeuses à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et le supernatant aspiré avec soin.
  2. Resuspendent les cellules dans le PBS stérile froid 1x à 1.000 cellules/L.
  3. Anesthésiez les souris mâles Rag1-/- ApoE-/- souris utilisant l’isoflurane et injectent 100 l (100 000 cellules) par souris par injection intraveineuse rétro-orbitale ou veine de queue à l’aide d’une seringue à insuline ultra-fine. Injectez quelques souris avec 1x PBS comme un contrôle.

6. Quantification des cellules de donneur et de plasma IgM

  1. Au moment souhaité du transfert post-adoptif, analyser les cellules transférées chez les souris receveures par la moelle osseuse et la récolte de tissu de rate4 et la cytométrie d’écoulement. Quantifier la localisation des cellules de donneurs et la surexpression de CXCR4 en colorant pour CD45.1, CD45.2, et CXCR4 et analyser les résultats de cytométrie de flux à l’aide d’un logiciel tel que Flowjo.
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les anticorps utilisés dans cette étape. Assurez-vous de ne pas utiliser un anticorps conjugué que les fluoresces dans le canal FITC comme GFP seront présents sur les cellules de donneur transduction.
  2. Isoler le plasma en ajoutant 10 ll de 0,5 M EDTA au sang entier recueilli par perforation cardiaque au moment du sacrifice des animaux. Centrifuge du sang entier à 7.000 x g et plasma d’aliquot dans des tubes séparés de centrifugeuse de 1,5 mL. Conserver à -80 oC jusqu’à l’analyse des facteurs sécrétés tels que IgM par ELISA4.

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Résultats

Un aperçu du protocole est donné à la figure 1. La figure 2 affiche l’enrichissement des cellules péritonéales B-1a après épuisement magnétique d’autres types de cellules péritonéales. Les cellules de singlet vivantes dans la fraction post-épuisement ont une plus grande proportion de cellules CD19 B par rapport auxmacrophages F4/80, n’ont pas de CD5salut CD19- cellules T, et contiennent une fréquence accrue de c...

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Discussion

La méthode fournie ici permet l’administration stable et relativement efficace du gène primaire de cellules B-1a, le transfert adoptif in vivo, et l’identification et la localisation des cellules injectées. Les cellules ont pu être détectées 17 semaines après le transfert de cellules et ont conservé l’expression accrue de CXCR4. La livraison négociée par rétrovirus a donné une efficacité de transduction de 30 à 40 % des cellules B-1a murines primaires ayant un impact minimal sur la viabilité cellulai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projet 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), et R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye a été soutenu par American Heart Association Boursier pré-doctoral 16PRE30300002 et 5T32AI007496-20. Nous remercions Joanne Lannigan, Mike Solga et Claude Chew de l’Université de Virginie Flow Cytometry Core pour leur excellente assistance technique.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
70 micron filter capsFalcon352235
anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc blockLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Clone: eBio1D3
CD23 biotineBioscience13-0232-81Clone: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Clone: B3B4
CD3e biotineBioscience13-0033-85Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Clone: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD5 PEeBioscience12-0051-83Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotinLife TechnologiesMF48015Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.License required
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 biotineBioscience13-5931-82Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serumGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Clone: R6-60.2
Insulin syringesBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein Animal Health029405
Live/Dead YellowLife TechnologiesL34968
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 biotinBD Biosciences553163Clone: PK136
Non-essential amino acidsGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Sodium pyruvateGibco11360-070
Ter119 biotineBioscience13-5921-82Clone: Ter119

Références

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