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Resumo

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Resumo

Como a função celular é influenciada por fatores específicos de nicho no microambiente celular, métodos para dissecar a localização e migração celular podem fornecer mais informações sobre a função celular. As células B-1a são um subconjunto exclusivo de células B em camundongos que produzem anticorpos IgM naturais protetores contra epítopos específicos de oxidação que surgem durante a saúde e a doença. A produção de IgM celular B-1a difere dependendo da localização celular B-1a e, portanto, torna-se útil do ponto de vista terapêutico para direcionar a localização B-1a para nichos que apoiam a alta produção de anticorpos. Aqui descrevemos um método para direcionar a migração celular B-1a para a medula óssea por superexpressão mediada retroviral do receptor de quimiocina C-X-C 4 (CXCR4). A indução genética em células murinas primárias B pode ser desafiadora e normalmente produz baixa eficiência de transfecção de 10-20%, dependendo da técnica. Aqui demonstramos que a transdução retroviral das células murinas primárias B-1a resulta em 30-40% de eficiência de transdução. Este método utiliza a transferência celular adotiva de células B-1a transduzidas em camundongos receptores deficientes de células B para que o doador B-1a a migração celular e a localização possam ser visualizadas. Este protocolo pode ser modificado para outros construtos retrovirais e pode ser usado em diversos ensaios funcionais pós-transferência adotiva, incluindo análise de fenótipo e função de células doadoras ou hospedeiras, ou análise de fatores solúveis secretados pós transferência celular B-1a. O uso de camundongos doadores e receptores distintos diferenciados por alótipo CD45.1 e CD45.2 e a presença de um repórter GFP dentro do plasmídeo retroviral também poderia permitir a detecção de células doadoras em outros modelos de camundongos imunes suficientes contendo populações de células B endógenas.

Introdução

Estudos recentes demonstraram células imunes consideráveis, e especificamente células B, heterogeneidade fenotípica e funcional, dependendo da localização celular1,,2,,3,,4,,5. As células B-1a são uma dessas populações com capacidade heterogênea de produzir anticorpos IgM protetores; as células B-1a da medula óssea secretam O IgM de forma constitutiva e contribuem significativamente para os títulos de IgM plasmático6, enquanto as células peritoneal B-1a têm secreção IgM de baixo nível na homeostase e, em vez disso, podem ser ativadas através de receptor inata semelhante ao pedágio (TLR) ou sinalização mediada por citocinas para proliferar rapidamente, migrar e segregar IgM7,8,9,10. Os anticorpos IgM de células B-1a reconhecem epítopos específicos de oxidação (OSE) presentes em patógenos, células apoptóticas e LDL oxidado, e a ligação IgM à OSE pode prevenir a sinalização inflamatória a jusante em doenças como aterosclerose11. Portanto, estratégias para aumentar a produção de IgM através do aumento da migração de células peritoneal B-1a para locais como a medula óssea podem ser terapeuticamente úteis. No entanto, é importante que tais estratégias sejam direcionadas e específicas do tipo celular, pois efeitos fora do alvo podem impactar negativamente a função imunológica ou a saúde.

Aqui descrevemos um método de superexpressão direcionada e de longo prazo do CXCR4 em células murinas primárias B-1a e posterior transferência adotiva para visualizar a migração celular e a produção funcional de anticorpos IgM(Figura 1). A manipulação genética das células B primárias é limitada por baixas eficiências de transfecção em comparação com a transfecção de linhas celulares transformadas. No entanto, como as linhas celulares transformadas podem se desviar significativamente das células primárias12,13, o uso de células primárias provavelmente fornecerá resultados que se alinham mais à fisiologia normal. Várias técnicas foram descritas para transferência genética em células murinas primárias B, incluindo transdução retroviral, transdução adenoviral, lipofecção ou transfecção à base de eletroporação, que têm diferentes níveis de eficiência, transitoriedade e impacto na saúde celular13,,14,,15. O método a seguir utilizou a transdução retroviral, pois produziu eficiência adequada de transferência genética de >30% ao mesmo tempo em que impactou minimamente a viabilidade celular. O retrovírus expresso em CXCR4 foi gerado usando o retroviral descrito anteriormente pelo vírus da célula-tronco murina-proteína fluorescente ribossômica (MSCV-IRES-GFP); MigR1)16, no qual o gene CXCR4 do mouse foi subsla clonado4. As partículas retrovirais MigR1 (controle(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP foram geradas usando transfecção fosfato de cálcio, conforme descrito nos protocolos publicados anteriormente4,,14.

As células B-1a transduzidas com sucesso foram então transferidas por via intravenosa para rag1 deficiente de linfócitos./- camundongos. Ambos os camundongos doadores e receptores também continham o nocaute do gene apolipoproteína E (ApoE), que resulta em aumento do acúmulo de OSE e aterosclerose, fornecendo assim um modelo para ativação celular In vivo B-1 e produção de IgM. Além disso, os camundongos doadores e receptores diferem no aótipo CD45; as células B-1 doadoras vieram de cd45.1+ ApoE-/- camundongos e foram transferidas para rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- receptores. Isso permitiu a diferenciação do CD45.1 do doador das células CD45.2 B receptoras após a transferência sem a necessidade de coloração adicional para marcadores de células B durante a análise da citometria de fluxo. Os resultados aqui fornecidos demonstram que a superexpressão CXCR4 direcionada em células B-1a associa-se ao aumento da capacidade das células B-1a de migrar para a medula óssea, que se associa ao aumento do plasma anti-OSE IgM. Além disso, fornecemos um método para o enriquecimento de células Peritoneal B-1 através da seleção negativa e demonstramos a exigência de ativação celular B-1 para transdução eficiente. Este método pode ser adaptado para outros construtos retrovirais para estudar o efeito da superexpressão proteica na migração celular B-1a, fenótipo ou função. Além disso, o uso da distinção de alótipo CD45.1 versus CD45.2 poderia teoricamente permitir a transferência para outros modelos míopes imunes que contenham células B endógenas.

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Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.

1. Separação magnética e enriquecimento de células Peritoneal B-1

  1. Eutanize um rato de 12 a 14 semanas, masculino, CD45.1+ApoE-/- mouse usando CO2.
  2. Faça um corte superficial no abdômen usando uma tesoura cirúrgica reta e descasque a pele usando uma tesoura curva para expor a parede peritoneal. Flush peritoneal cavity com 10 mL de 37 °C RPMI-1640 médio usando uma seringa de 10 mL e agulha de 25 G. Agite o mouse para desengatar as células segurando a cauda e movendo o mouse de lado a lado completamente para 15-20 s.
    NOTA: A massagem do peritônio lavado também pode maximizar a recuperação celular.
  3. Colete fluido peritônio usando uma seringa de 10 mL e agulha de 25 G, elaborando fluido no lado inferior direito do peritônio logo acima do nível do quadril, perto dos intestinos. Evite interromper depósitos de gordura epididimal e órgãos subjacentes. Evite tirar fluido do lado esquerdo do mouse, pois a gordura omental pode ser facilmente atraída para dentro da seringa.
  4. Uma vez que ~6-7 mL de fluido é coletado, dispense em um tubo cônico de 50 mL colocado no gelo. Em seguida, eleve o rato verticalmente segurando a parede peritoneal acima do diafragma usando fórceps para que qualquer fluido restante permaneça na parte inferior da cavidade peritoneal. Faça um pequeno corte na parede peritoneal usando uma tesoura cirúrgica acima do fígado (certifique-se de não cortar o fígado) e colete qualquer fluido peritoneal restante usando uma tubulação de vidro e lâmpada.
  5. Agrupar células de lavagem peritoneal de todos os CD45.1+ApoE-/- ratos (n = 15-20) em tubos cônicos de 50 mL e armazenar no gelo.
    NOTA: Para calcular o número de camundongos necessários: as células B-1a compreendem 5-10% da população peritoneal total e produzem cerca de 2,5-5 x 105 células B-1a por rato nas mãos dos autores. A eficiência da transdução é de ~30-40%, como mostrado abaixo.
  6. Conte células vivas usando um corante de viabilidade, como o azul tripano e um hemótmetro (diluir amostras 1:5 em azul trypan e carregar 10 μL na câmara hemócica). Células da piscina em até 1 x 108 células por tubo. Centrífugas a 400 x g por 5 min a 4 °C, depois aspiram supernasce.
  7. Resuspend até 1 x 108 células em 1 mL de anticorpo anti-CD16/CD32(Tabela de Materiais) diluído 1:50 no tampão de ensaio (1x fosfato tampão salino tampão [PBS], 0,5% de albumina de soro bovino [BSA], 2 mM EDTA) a fim de bloquear receptores de soro fc. Escala conforme necessário com base na contagem celular. Incubar no gelo por 10 min a 4 °C.
  8. Prepare uma mistura mestre de 2x dos anticorpos biotinilados(Tabela 1) no tampão de ensaio para esgotamento. O mix mestre de 2x explica o volume do líquido em que as células já estão quando incubam com anti-CD16/CD32. Por exemplo, se as células estiverem incubando em 500 μL de anti-CD16/CD32 diluídos, em seguida, adicione 500 μL de mistura mestre de 2x contendo 10 μL de ter119 biotinilado, Gr-1, CD23 e NK1.1 anticorpos, e 25 μL de anticorpo f4/80 biotinilado para alcançar as concentrações finais dadas na Tabela 1. Adicione 2x mistura mestre às células e manche por 20 min a 4 °C.
  9. Lave as células com 5 mL de tampão de ensaio e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernadante.
  10. Resuspend e incubar células com microesferas anti-biotina(Tabela de Materiais) diluídas no tampão de ensaio conforme a concentração e protocolo recomendado pelo fabricante.
  11. Lave com 5 mL de tampão de ensaio e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar supernante e resuspend até 1 x 108 células em 500 μL de tampão de ensaio.
  12. Principais colunas de seleção magnética(Tabela de Materiais)com 3 mL de tampão de ensaio. Transfira células para colunas de seleção magnética e colete o eluent contendo células B-1 enriquecidas em um tubo cônico de 15 mL no gelo. Lave a coluna de seleção magnética com tampão de ensaio adicional até que o volume total coletado seja de 10 mL.
    NOTA: Uma alíquota das frações celulares pré-purificadas e pós-purificadas deve ser analisada separadamente pela citometria de fluxo para eficiência de purificação por coloração para células CD19+ B, macrófagos F480+ e células T CD5+, como mostrado na Figura 2.
  13. Conte a fração celular pós-purificada (o eluent contendo células B-1 enriquecidas) contando células vivas como na etapa 1.6, e resuspend em 1 x 106 células/mL em meio de cultura celular B (RPMI-1640, 10% soro bovino fetal inativado por calor [FBS], 10 mM HEPES, 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM piruvato de sódio, 50 μg/mL gentamicina, 55 μM β-mercaptoethanol).

2. Estimulação celular Peritoneal B-1

  1. Células agrupadas divididas para as duas condições transduzidas (Ctl-GFP e CXCR4-GFP), enquanto separam e emplacam pelo menos 10 x 106 células para um controle não transduzido.
  2. Placa até 150 μL (150.000 células) por poço em placas de fundo redondo de 96 poços.
  3. Adicione 100 nM TLR9 agonista ODN1668 a todos os poços para estimular a proliferação celular.
  4. Incubar por 16-18 h a 37 °C, 5% DE CO2.

3. Transdução retroviral de células B peritoneal

  1. Gerar partículas retrovirais CTL-GFP (MigR1) e CXCR4-GFP usando transfecção fosfato de cálcio, conforme descrito nos protocolos publicados anteriormente14.
    NOTA: Isso levará vários dias, então prepare e prepare estoques retrovirais e armazene alíquotas a -80 °C antes de iniciar este protocolo.
  2. Descongele os estoques de retrovírus no gelo. Use imediatamente e não congele de forma significativa, pois o título de vírus diminui significativamente durante os ciclos de congelamento. Adicione os supernantes retrovirais Ctl-GFP ou CXCR4-GFP a 20:1 multiplicidade de infecção (MOI) às células, na presença de 8 μg/mL de polibrene e β-mercaptoethanol fresco a 55 μM de concentração final. Não adicione estoques virais às células reservadas para o controle não transduzido.
  3. Realize a spinfection por placas centrifugadoras a 800 x g por 90 min à temperatura ambiente.
  4. Incubar placas com retrovírus a 37 °C, 5% de CO2 por mais 3 h.
  5. Colher e relatar células em meio de célula B fresca e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.

4. Triagem celular de células peritoneal transduzidas B-1a

  1. Colher células cultivadas e agrupar-se em três tubos cônicos separados de 50 mL para cada condição: não transduzidos, ctl-GFP transduzidos e CXCR4-GFP transduzidos.
  2. Conte células vivas como na etapa 1.6, depois centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernadante.
  3. Células resuspend a 100.000 células/μL em buffer de classificação (PBS + 1% BSA) contendo 1:50 anticorpos anti-CD16/CD32(Tabela de Materiais) a fim de bloquear receptores Fc. Incubar no gelo por 10 min a 4 °C.
  4. Células de alíquota para controles de compensação (~30.000 células por controle de compensação): para controles de manchas não manchados e únicos aliquot de amostra não transduzida e para alíquota de controle de retraída única GFP a partir de amostras transduzidas.
    NOTA: As contas de compensação disponíveis comercialmente podem ser usadas para controles de uma única mancha se o número de celular não transduzido for baixo.
  5. Prepare uma mistura mestre de anticorpos de 2x contendo os anticorpos conjugados fluoróteo em tampão de classificação(Tabela 1). Adicione 2x de mistura mestre a amostras transduzidas não transduzidas, CTL-GFP e CXCR4-GFP transduzidas. Adicione anticorpos individuais a controles de manchas únicos. Incubar por 20 min a 4 °C no escuro.
    NOTA: O mix mestre de 2x contabiliza o volume de líquido em que as células já estão ao incubar com anti-CD16/CD32, como na etapa 1.8. Uma alíquota de células de cada condição pode ser manchada separadamente para cxcr4 para confirmar a superexpressão CXCR4.
  6. Lave amostras com 1 mL de tampão de tipo e coe através de filtros de 70 μm em tubos de polipropileno.
  7. Centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernanato. Resuspend amostras a 50.000 células/μL em buffer de classificação.
  8. Antes da triagem celular, prepare tubos de coleta de células ativados por fluorescência (FACS) com 1 mL de meio de coleta (RPMI-1640, FBS inativados pelo calor de 20%, 10 mM HEPES, 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM piruvato de sódio, 50 μg/mL gentamicina, 55 μM β-mercaptoetanol) para cada população a ser classificada.
  9. Antes de executar amostras no classificador de células adicione 2x DAPI (preparado como diluição de 1:5000 em buffer de classificação) para discriminação celular morta.
  10. Classifique as células GFP+ B-1a em tubos FACS contendo meio de coleta como DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ células das amostras CTL-GFP e CXCR4-GFP. Use a amostra não transduzida para definir o portão GFP+ e para classificar as células DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ células B-1a não transduzidas.
    NOTA: Alternativamente, as células não transduzidas também podem ser classificadas a partir das amostras CTL-GFP e CXCR4-GFP, gating separadamente células B-1a dentro da fração GFP. Células B-1b transduzidas ou não transduzidas também podem ser classificadas usando essa estratégia de tipo como CÉLULAS DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5 - células.

5. Transferência adotiva

  1. Após a triagem celular, as células centrífugas a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspiram supernasce cuidadosamente.
  2. Células resuspendas em 1x PBS estéril a frio a 1.000 células/μL.
  3. Anestesiar rag1 macho-/- ApoE-/- camundongos usando isoflurano e injetar 100 μL (100.000 células) por rato através de injeção retro-orbital ou veia traseira intravenosa usando uma seringa de insulina ultrafina. Injete alguns ratos com 1x PBS como controle.

6. Quantificação de células doadoras e IgM plasmática

  1. No momento desejado pós-transferência adotiva, analise as células transferidas em camundongos receptores por colheita de tecido de medula óssea e baço4 e citometria de fluxo. Quantifique a localização celular do doador e a superexpressão do CXCR4 por coloração para CD45.1, CD45.2 e CXCR4 e analise os resultados da citometria de fluxo usando um software como o Flowjo.
    NOTA: Consulte a tabela 1 para os anticorpos utilizados nesta etapa. Certifique-se de não usar um anticorpo conjugado que fluoresce no canal FITC como GFP estará presente em células doadoras transduzidas.
  2. Isole o plasma adicionando 10 μL de 0,5 M EDTA ao sangue inteiro coletado via punção cardíaca no momento do sacrifício animal. Centrifugar sangue inteiro a 7.000 x g e aliquot plasma em tubos de centrífugas separados de 1,5 mL. Armazenar a -80 °C até realizar a análise de fatores secretados como IgM por ELISA4.

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Resultados

Uma visão geral do protocolo é dada na Figura 1. A Figura 2 apresenta enriquecimento de células peritoneal B-1a após esgotamento magnético de outros tipos de células peritoneal. Células singlet vivas na fração pós-esgotamento têm uma maior proporção de células B CD19+ em comparação com F4/80+ macrófagos, não possuem células CD5hi CD19- T e contêm uma frequência aumentada de células CD19+ CD5m...

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Discussão

O método aqui fornecido permite a entrega de genes primários B-1a estáveis e relativamente eficientes, transferência adotiva in vivo e identificação e localização de células injetadas. As células foram capazes de ser detectadas 17 semanas de transferência pós-célula e retiveram o aumento da expressão CXCR4. A entrega mediada pelo retrovírus rendeu 30-40% de eficiência de transdução das células principais murinas B-1a com impacto mínimo na viabilidade celular em nossas mãos(Figura...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projeto 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) e R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye foi apoiada pela bolsa de pré-doutorado da American Heart Association 16PRE30300002 e 5T32AI007496-20. Agradecemos a Joanne Lannigan, Mike Solga e Claude Chew do Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade da Virgínia por sua excelente assistência técnica.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
70 micron filter capsFalcon352235
anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc blockLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Clone: eBio1D3
CD23 biotineBioscience13-0232-81Clone: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Clone: B3B4
CD3e biotineBioscience13-0033-85Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Clone: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD5 PEeBioscience12-0051-83Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotinLife TechnologiesMF48015Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.License required
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 biotineBioscience13-5931-82Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serumGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Clone: R6-60.2
Insulin syringesBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein Animal Health029405
Live/Dead YellowLife TechnologiesL34968
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 biotinBD Biosciences553163Clone: PK136
Non-essential amino acidsGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Sodium pyruvateGibco11360-070
Ter119 biotineBioscience13-5921-82Clone: Ter119

Referências

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