Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Özet

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Özet

Hücre fonksiyonu hücresel mikroortamda niş özgü faktörlerden etkilendiği gibi, hücre lokalizasyonu ve göç incelemek için yöntemler hücre fonksiyonu hakkında daha fazla fikir sağlayabilir. B-1a hücreleri, sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkan oksidasyona özgü epitoplara karşı koruyucu doğal IgM antikorları üreten farelerde benzersiz bir B hücre alt kümesidir. B-1a hücre igM üretimi B-1a hücre konumuna bağlı olarak değişir, ve bu nedenle yüksek antikor üretimini destekleyen nişler b-1a lokalizasyonu hedef terapötik bir açıdan yararlı olur. Burada C-X-C motifi kemokin reseptör4 (CXCR4) retroviral aracılı aşırı ekspresyonu ile kemik iliği B-1a hücre göçünün hedefsini hedefleyen bir yöntem açıklıyoruz. Primer murine B hücrelerinde gen indüksiyonu zorlu olabilir ve genellikle teknik bağlı olarak %10-20 oranında düşük transfeksiyon verimi verir. Burada primer murine B-1a hücrelerinin retroviral transdüksiyonunun %30-40 transdüksiyon verimi ile sonuçladığını gösterdik. Bu yöntem, donör B-1a hücre göçü ve lokalizasyonu görselleştirilebilmek için transduced B-1a hücrelerinin B hücresi eksikliği alıcı farelere benimseyen hücre transferini kullanır. Bu protokol diğer retroviral yapılar için değiştirilebilir ve donör hücre veya konak hücre fenotip ve fonksiyonunun analizi veya B-1a hücre transferi sonrası salgılanan çözünür faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel tahliller sonrası adoptive transfer, kullanılabilir. CD45.1 ve CD45.2 allotipi ile farklılaşan farklı donör ve alıcı farelerin kullanımı ve retroviral plazmid içinde bir GFP muhabirinin varlığı da endojen B hücre popülasyonları içeren diğer, bağışıklık-yeterli fare modellerinde donör hücrelerinin tespitini sağlayabilir.

Giriş

Son çalışmalar önemli bağışıklık hücresi göstermiştir, ve özellikle B hücre, henotypik ve fonksiyonel heterojenite hücre lokalizasyonuna bağlı olarak^1,2,3,4,5. B-1a hücreleri koruyucu IgM antikorları üretmek için heterojen kapasiteye sahip tür bir popülasyondur; kemik iliği B-1a hücreleri igM salgılar ve plazma IgM titreleri^önemliölçüde katkıda 6 , periton B-1a hücreleri homeostaz düşük seviyeli IgM salgısı varken ve bunun yerine doğuştan gelen ücretli reseptör ile aktive edilebilir (TLR) veya sitokin aracılı sinyal hızla çoğalmak için, göç, ve gizli IgM^7,8,,90.¹⁰ B-1a hücreli IgM antikorları patojenlerde, apoptotik hücrelerde ve okside LDL'de bulunan oksidasyona özgü epitoplar (OSE) tanır ve OSE'ye bağlanan IgM, ateroskleroz¹¹gibi hastalıklarda inflamatuar akıntı sinyalini önleyebilir. Bu nedenle, kemik iliği gibi bölgelere peritoneal B-1a hücre göçlerini artırarak IgM üretimini artırma stratejileri terapötik olarak yararlı olabilir. Ancak, bu tür stratejilerin hedef alınması ve hücre tipine özgü olması önemlidir, çünkü hedef dışı etkiler bağışıklık fonksiyonunu veya sağlığını olumsuz etkileyebilir.

Burada primer murine B-1a hücrelerinde CXCR4'ün hedefli ve uzun süreli aşırı ekspresyonu ve hücre göçünü ve fonksiyonel IgM antikor üretimini görselleştirmek için sonraki evlat edinici transfer için bir yöntem açıklıyoruz (Şekil 1). Birincil B hücrelerinin genetik manipülasyonu, dönüştürülmüş hücre hatlarının transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında düşük transfeksiyon verimliliği ile sınırlıdır. Ancak, dönüştürülmüş hücre hatları önemli ölçüde birincil hücrelerden sapma olabilir^12,13, birincil hücrelerin kullanımı daha yakından normal fizyolojisi hizalamak sonuçlar sağlamak olasıdır. Çeşitli teknikler retroviral transdüksiyon, adenoviral transdüksiyon, lipofection, ya da elektroporasyon tabanlı transfeksiyon, verimlilik, geçicilik değişen düzeylerde ve hücre sağlığı üzerinde etkisi^13,,^14,15dahil olmak üzere primer murine B hücrelerinde gen transferi için tanımlanmıştır. Aşağıdaki yöntemde retroviral transdüksiyon ,hücre canlılığını en az düzeyde etkilerken %gt;%30 oranında yeterli gen aktarım verimi vermiştir. CXCR4-ekspres retrovirüs daha önce açıklanan retroviral yapı murine kök hücre virüs-iç ribozomal giriş sitesi-yeşil floresan protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, içine fare CXCR4 gen alt klonlanmış olduğu⁴. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanılarak üretildi^4,14.

Başarılı bir şekilde transebed B-1a hücreleri daha sonra intravenöz lenfosit eksikliği Rag1^-/- farelere transfer edildi. Hem donör hem de alıcı fareler ayrıca apolipoprotein E (ApoE) geninin nakavtını içeriyordu, bu da OSE birikiminin artması ve aterosklerozla sonuçlanarak in vivo B-1 hücre aktivasyonu ve IgM üretimi için bir model sağladı. Ayrıca, donör ve alıcı fareler CD45 allotype farklı; donör B-1 hücreleri CD45.1+ ApoE^-/- farelerden geldi ve Rag1^-/- CD45.2+ ApoE^-/- alıcılarına transfer edildi. Bu, donör CD45.1'in alıcı CD45.2 B hücrelerinden akış sitometrisi analizi sırasında B hücre belirteçleri için ek olarak lekelemeye gerek kalmadan transfer sonrası farklılaşmasına olanak sağladı. Burada verilen sonuçlar, B-1a hücrelerinde hedeflenen CXCR4 aşırı ekspresyonu, B-1a hücrelerinin kemik iliğine geçiş yapma yeteneğini n arttırdığını ve bu da artmış plazma anti-OSE IgM ile ilişkilendirdiğini göstermektedir. Ayrıca negatif seçim yoluyla periton B-1 hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yöntem sağlamak ta ve verimli transdüksiyon için B-1 hücre aktivasyonu gereksinimini göstermektedir. Bu yöntem, protein aşırı ekspresyonunun B-1a hücre göçü, fenotip veya fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için diğer retroviral yapılara uyarlanabilir. Ayrıca, CD45.1 karşı CD45.2 allotype ayrım kullanımı teorik olarak endojen B hücreleri içeren diğer bağışıklık-yeterli murine modelleri ne transfer izin verebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Periton B-1 hücrelerinin manyetik ayrıştırılması ve zenginleşmesi

1. 12−14 haftalık, erkek, CD45.1⁺ApoE^-/- fare CO₂kullanarak ötenazi .
2. Düz cerrahi makas kullanarak karın yüzeysel bir kesim yapmak ve periton duvarı ortaya çıkarmak için kavisli makas kullanarak geri deri soyma. 10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak 10 mL 37 °C RPMI-1640 orta ile floş periton boşluğu. Kuyruğu kavrayarak ve fareyi 15−20 s boyunca iyice yan lara doğru hareket ettirerek hücreleri devre dışı kaldırmak için fareyi çalkalayın.
   NOT: Lavajlı periton masaj da hücre kurtarma maksimize edebilir.
3. 10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak periton sıvısını, peritonumun sağ alt tarafında, kalça seviyesinin hemen üzerinde, bağırsakların yakınında sıvı oluşturarak toplayın. Epidydimal yağ depoları ve altta yatan organları bozmaktan kaçının. Omental yağ kolayca şırınga içine çizilebilir gibi farenin sol tarafında sıvı çizim kaçının.
4. ~6−7 mL sıvı toplandıktan sonra, buz üzerine yerleştirilen 50 mL konik tüpe dağıtın. Daha sonra, kalan sıvının periton boşluğunun alt kısmında kalması için persepskullanarak diyaframın üzerindeki periton duvarını basılı tutarak fareyi dikey olarak yükseltin. Karaciğer üzerinde cerrahi makas kullanarak periton duvarında küçük bir kesim yapmak (karaciğer kesmek için değil emin olun) ve bir cam pipet ve ampul kullanarak kalan periton sıvısı toplamak.
5. Tüm CD45.1⁺ApoE^-/- farelerden (n = 15−20) 50 mL konik tüplere havuz periton yıkama hücreleri ve buz üzerinde depolayın.
   NOT: Gerekli fare sayısının hesaplanmasıiçin: B-1a hücreleri toplam periton popülasyonunun %5−10'unu oluşturur ve yazarların ellerinde fare başına yaklaşık 2,5−5 x 10⁵ B-1a hücresi verir. Transdüksiyon verimliliği aşağıda gösterildiği gibi ~%30−40'dır.
6. Trippan mavisi ve hemositometre gibi canlı lık boyası kullanarak canlı hücreleri sayın (seyreltik numuneler 1:5 trippan mavisinde ve hemositometre odasına 10°L yükleyin). Havuz hücreleri tüp başına 1 x 10⁸ hücreye kadar. 4 °C'de 5 dk için 400 x g'de santrifüj hücreleri, daha sonra süpernatant aspire edilir.
7. Fc reseptörlerini engellemek için⁸ 1 mL anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içinde 1:50'ye kadar 1x fosfat tamponlu salin [PBS], %0,5 büyükbaş serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) seyreltilmiş olarak yeniden askıya alın. Hücre sayısına göre gerektiği gibi ölçeklendirin. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.
8. Tükenmesi için ispat tamponunda biyotinylated antikorların(Tablo 1)2x ana karışımını hazırlayın. 2x ana karışım, anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvının hacmini hesaplar. Örneğin, hücreler 500 μL'lik seyreltilmiş anti-CD16/CD32'de kuluçkaya yatsalar, tablo 1'deverilen son konsantrasyonları elde etmek için 10 μL biyotinylated Ter119, Gr-1, CD23 ve NK1.1 antikoriçeren 500 μL 2x ana karışımı ekleyin. Hücrelere 2x ana karışımı ekleyin ve 4 °C'de 20 dk için leke.
9. 4 °C'de 5 dk 400 x g'de 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile hücreleri yıkayın ve süpernatant aspire edin.
10. Anti-biotin mikroboncukları(Malzeme Tablosu)ile hücreleri resuspend ve inkübül, üretici tarafından önerilen konsantrasyon ve protokole göre test tamponu ile seyreltilir.
11. 4 °C'de 5 dk 400 x g'da 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatant aspire edin ve 500 μL'lik bir arabellekte 1 x 10⁸ hücreye kadar yeniden askıya alın.
12. 3 mL'lik sayma arabelleği ile asal manyetik seçim sütunları(Malzeme Tablosu). Hücreleri astarlı manyetik seçim sütunlarına aktarın ve buzun üzerindeki 15 mL konik tüpte zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüenttop. Toplanan toplam hacim 10 mL olana kadar manyetik seçim sütununa ek bir çalışma arabelleği yle yıkayın.
    NOT: Önceden saflaştırılmış ve arınmış hücre fraksiyonlarının bir aliquot ayrı ayrı CD19 + B hücreleri, F480 + makrofajlar ve CD5 + T hücreleri için boyama tarafından saflaştırma verimliliği için akış sitometri tarafından ayrı ayrı analiz edilmelidir Şekil 2'degösterildiği gibi .
13. 1.6'daki gibi canlı hücreleri sayarak arınmış hücre fraksiyonu (zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüent) saymak, ve B hücre kültürü orta sında 1 x 10⁶ hücre/mL'de (RPMI-1640, %10 ısı yalıtımlı fetal sığır serumu [FBS], 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol).

2. Periton B-1 hücre stimülasyonu

1. İki transduced koşullar (Ctl-GFP ve CXCR4-GFP) için bölünmüş havuzlu hücreler, bir kenara ayarı ve transeformasyonsuz kontrol için en az 10 x 10⁶ hücreleri kaplama.
2. 96 kuyulu yuvarlak alt plakalara her biri 150 μL'ye (150.000 hücre) kadar plaka koyun.
3. Hücre çoğalmasını uyarmak için tüm kuyulara 100 nM TLR9 agonist ODN1668 ekleyin.
4. 37 °C'de 16−18 saat, %5 CO_2'dekuluçka .

3. Periton B hücrelerinin retroviral transdüksiyonu

1. Ctl-GFP (MigR1) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanarak üretin¹⁴.
   NOT: Bu işlem birkaç gün sürer, bu nedenle retroviral stokları hazırlayın ve titretleyin ve bu protokolü başlatmadan önce -80 °C'de aliquots saklayın.
2. Buz üzerinde çözülme retrovirüs stokları. Hemen kullanın ve virüs titresi donma-çözülme döngüleri sırasında önemli ölçüde azalır gibi yeniden donma yok. Ctl-GFP veya CXCR4-GFP retroviral süpernatantlarını hücrelere 20:1'de 8 μg/mL polibren ve 55 μM son konsantrasyonda taze β-mercaptoethanol varlığında enfeksiyon (MOI) çokluğuyla ekleyin. Transeolmayan kontrol için ayrılan hücrelere viral stoklar eklemeyin.
3. Oda sıcaklığında 90 dk için 800 x g'de santrifüj plakaları ile spenfeksiyon yapın.
4. 37 °C'de retrovirüslü kuluçka plakaları, ek 3 saat için %5 CO_2.
5. Taze B hücresi orta ve kuluçka hücreleri hasat ve replate 37 °C, 5% CO₂ gecede.

4. Transekin periton B-1a hücrelerinin hücre sıralaması

1. Kültürlenmiş hücreleri ve havuzu her durum için üç ayrı 50 mL konik tüpe ayırın: transere, Ctl-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced.
2. 1.6 adımdaki gibi canlı hücreleri sayın, 400 x g'de 4 000 x g'de 4 °C'de 5 dk ve aspire süpernatant.
3. Fc reseptörlerini engellemek için 1:50 anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içeren sıra tampon (PBS + %1 BSA) 100.000 hücre/μL'deki hücreleri yeniden askıya alın. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.
4. Telafi kontrolleri için Aliquot hücreleri (kompanzasyon kontrolü başına~30.000 hücre): transeedilmemiş numuneden lekesiz ve tek leke kontrolleri aliquot ve transduced numunelerden GFP tek leke kontrolü aliquot için.
   NOT: Transeme edilemeyen hücre sayısı düşükse, ticari olarak kullanılabilen kompanse boncuklar tek leke kontrolleri için alternatif olarak kullanılabilir.
5. Sıra tampon florofor konjuge antikorlar içeren bir 2x antikor ana karışımı hazırlayın(Tablo 1). Transe, CTL-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced örneklerine 2x ana karışım ekleyin. Tek leke kontrolleri için bireysel antikorlar ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 20 dk kuluçka.
   NOT: 2x ana karışım, 1.8 adımda olduğu gibi anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvı nın hacmini hesaplar. CXCR4 aşırı ekspresyonunu onaylamak için cxcr4 için her koşuldan bir hücre aliquot ayrı ayrı boyanabilir.
6. Numuneleri 1 mL tür tamponla yıkayın ve 70 μm filtreler den polipropilen tüplere süzün.
7. 4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj ve aspire süpernatant. 50.000 hücre/μL'deki numuneleri sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
8. Hücre sıralamadan önce 1 mL toplama ortamı içeren etiketli floresan aktif hücre sıralama (FACS) toplama tüpleri (RPMI-1640, Her popülasyon için %20 ısı yalıtımlı FBS, 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamisin, 55 μM β-mercaptoetanol) sıralanır.
9. Hücre ayırıcısında örnekleri çalıştırmadan önce ölü hücre ayrımcılığı için 2x DAPI (sıra tampon1:5000 seyreltme olarak hazırlanan) ekleyin.
10. GFP+ B-1a hücrelerini DAPI^- CD19⁺ GFP⁺ B220^mid-lo CD23^- IgM⁺ CD5⁺ CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden toplama ortamı içeren FACS tüpleri halinde sıralayın. GFP+ kapısını ayarlamak ve DAPI - CD19⁺ GFP^{- -} B220^mid-lo CD23^- IgM⁺ CD5⁺ transduced olmayan B-1a hücrelerini sıralamak için transize olmayan örneği kullanın.
    NOT: Alternatif olarak, transeedilemeyen hücreler de CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden GFP fraksiyonu içindeki B-1a hücrelerini ayrı ayrı ayırarak sıralanabilir. Transduced veya non-transduced B-1b hücreleri de DAPI olarak bu sıralama stratejisi kullanılarak sıralanabilir^- CD19⁺ GFP^+/- B220^mid-lo CD23^- IgM⁺ CD5^- hücreleri.

5. Evlat edinme transferi

1. Hücre ayrıştırma sonra, 4 °C'de 5 dakika 400 x g santrifüj hücreleri ve aspire supernatant dikkatle.
2. Soğuk steril 1x PBS'deki hücreleri 1.000 hücre/μL'de yeniden askıya alın.
3. Anestezi erkek Rag1^-/- ApoE^-/- fareler isoflurane kullanarak ve bir ultra-ince insülin şırınga kullanarak intravenöz retro-orbital veya kuyruk damar enjeksiyonu ile fare başına 100 μL (100.000 hücre) enjekte. Kontrol olarak birkaç fareye 1x PBS enjekte edin.

6. Donör hücrelerin ve plazma IgM'nin nicelleştirilmesi

1. İstenilen zamanda post-adoptive transfer, kemik iliği ve dalak doku hasat⁴ ve akış sitometri ile alıcı farelerde transfer hücreleri analiz. CD45.1, CD45.2 ve CXCR4 için boyama yaparak donör hücre lokalizasyonu ve CXCR4 aşırı ekspresyonu ölçün ve Flowjo gibi bir yazılım kullanarak akış sitometri sonuçlarını analiz edin.
   NOT: Bu adımda kullanılan antikorlar için Tablo 1'e bakınız. Transedonör hücrelerde GFP mevcut olacağından, FITC kanalındaki floresan bir antikor eşleği kullanmamaya devam edin.
2. Hayvan kurban sırasında kardiyak delinme ile toplanan tam kana 0,5 M EDTA'nın 10 μL'sini ekleyerek plazmayı izole edin. 7.000 x g ve aliquot plazmada santrifüj tam kan ayrı 1.5 mL santrifüj tüpler içine. ELISA⁴tarafından IgM gibi salgılanan faktörlerin analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokolegenel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2, diğer periton hücre tiplerinin manyetik tükenmesi sonrasında periton B-1a hücrelerinin zenginleşmesini gösterir. Tükenme sonrası fraksiyondaki canlı tekli hücreler F4/80⁺ makrofajlara göre CD19+ B hücrelerinin daha büyük bir oranına sahiptir, CD5^hi CD19^- T hücrelerinden yoksundur ve ön tükenme fraksiyonuna göre CD19⁺ CD5^orta B...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada sağlanan yöntem, kararlı ve nispeten verimli primer B-1a hücre gen idamı, in vivo adoptive transferi ve enjekte edilen hücrelerin tanımlanması ve lokalizasyonu sağlar. Hücreler hücre transferi sonrası 17 hafta saptandı ve artmış CXCR4 ekspresyonu tutuldu. Retrovirüs aracılı doğum, elelerimizdeki hücre canlılığı üzerinde en az etkiye sahip primer murine B-1a hücrelerinin %30-40 transdüksiyon verimi elde etti(Şekil 4e). Bu retroviral enfeksiyon, adenoviral en...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 micron filter caps	Falcon	352235
anti-biotin microbeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block	Life Technologies	MFCR00
B220 APC	eBioscience	17-0452-83	Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
CD19 APCef780	eBioscience	47-0193-82	Clone: eBio1D3
CD23 biotin	eBioscience	13-0232-81	Clone: B3B4
CD23 PECy7	eBioscience	25-0232-82	Clone: B3B4
CD3e biotin	eBioscience	13-0033-85	Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560580	Clone: A20
CD45.2 BV421	BD Biosciences	562895	Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD5 PE	eBioscience	12-0051-83	Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC	eBioscience	17-9991-82	Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin	Life Technologies	MF48015	Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6	Treestar Inc.	License required
Gentamicin	Gibco	15710-064
Gr-1 biotin	eBioscience	13-5931-82	Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum	Gibco	16000-044
HEPES	Gibco	15630-080
IgM PECF594	BD Biosciences	562565	Clone: R6-60.2
Insulin syringes	BD Biosciences	329461
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405
Live/Dead Yellow	Life Technologies	L34968
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
NK1.1 biotin	BD Biosciences	553163	Clone: PK136
Non-essential amino acids	Gibco	11140-050
ODN 1668	InvivoGen	tlrl-1668
PBS	Gibco	14190-144
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Ter119 biotin	eBioscience	13-5921-82	Clone: Ter119