뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

요약

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

초록

세포 기능이 세포 미세 환경의 틈새 특이적 요인에 의해 영향을 받므로 세포 국소화 및 이동을 해부하는 방법은 세포 기능에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. B-1a 세포는 건강과 질병 도중 발생하는 산화 특이적 에피토프에 대하여 보호천연 IgM 항체를 생성하는 마우스에 있는 유일한 B 세포 서브세트입니다. B-1a 세포 IgM 생산은 B-1a 세포 위치에 따라 다르며, 따라서 높은 항체 생산을 지지하는 틈새 시장까지 B-1a 국소화를 표적으로 하는 치료적 관점에서 유용하게 된다. 여기서 우리는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4(CXCR4)의 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 골수로B-1a 세포 이동을 표적으로 하는 방법을 설명한다. 1 차적인 murine B 세포에 있는 유전자 유도는 도전적일 수 있고 전형적으로 기술에 따라서 10-20%의 낮은 형혈 성 효율성을 산출합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 성 환전이 30-40% 형질전환 효율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 기증자 B-1a 세포 이동 및 국소화가 가시화될 수 있도록 B 세포 결핍 수용자 마우스로 변환된 B-1a 세포의 입양 세포 전달을 이용합니다. 이 프로토콜은 다른 레트로바이러스 구성을 위해 변형될 수 있으며, 기증자 세포 또는 숙주 세포 표현형 및 기능의 분석, 또는 B-1a 세포 전달 후 분비된 수용성 인자의 분석을 포함하여 다양한 기능성 분석사에서 사용될 수 있다. CD45.1 및 CD45.2 동형및 레트로바이러스 플라스미드 내에 GFP 리포터의 존재에 의해 분화된 뚜렷한 공여자 및 수용인자 마우스의 사용은 또한 내인성 B 세포 집단을 포함하는 다른, 면역 이충분한 마우스 모델에서 공여자 세포의 검출을 가능하게 할 수 있었다.

서문

최근 연구는 상당한 면역 세포, 특히 B 세포, 특히 세포 국소화에 따라 자형질 및 기능적 이질성을^{입증했다1,2,,3,,4,5.5} B-1a 세포는 보호 IgM 항체를 생성하는 이기종 용량을 가진 하나의 그러한 집단; 골수 B-1a 세포는 IgM을 분비하고 혈장 IgM 타이터^6에크게 기여하며, 복막 B-1a 세포는 항상성에서 낮은 수준의 IgM 분비를 가지며 대신 선천적 톨-유사 수용체(TLR) 또는 사이토카인 매개 신호를 통해^7,8,9,활성화될 수 있으며, 70 , 70 , 70 , 70 ,⁷⁰. B-1a 세포 IgM 항체는 병원균, 세포자멸 세포 및 산화된 LDL에 존재하는 산화 특이적 에피토프(OSE)를 인식하고, OSE에 결합하는 IgM은 죽상동맥경화증 과 같은 질병에서 염증성 하류 신호를 방지할 수 있다^11. 따라서, 골수와 같은 부위로의 후막 B-1a 세포 이동을 증가시켜 IgM 생산을 증가시키는 전략이 치료적으로 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 전략에 대 한 중요 한 대상 및 세포 유형 특정, 오프 타겟 효과 면역 기능 또는 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

여기서 우리는 1차 뮤린 B-1a 세포에서 CXCR4의 표적화 및 장기 과발현에 대한 방법을 설명하고 세포 이동 및 기능적 IgM 항체 생산을 시각화하기 위한 후속 입양 전달을설명한다(도 1). 1 차적인 B 세포의 유전 조작은 형질전환된 세포주의 형질전환에 비해 낮은 형광 효율성에 의해 제한됩니다. 그러나, 형질전환된 세포주들이^{1차 세포(12,,13)로부터}현저하게 이탈할 수 있기 때문에, 1차 세포의 사용은 정상 생리학에 보다 밀접하게 부합하는 결과를 제공할 가능성이 높다. 몇몇 기술은 레트로바이러스 전달, 아데노바이러스 전달, 지방흡입, 또는 세포 건강에 미치는 영향의 다양한 수준을 가지는 전기천공 기반 형질감염을 포함하는 1차 뮤린 B 세포에서유전자 전달을 위해 기술되었다^13,,14,,15. 다음 방법은 레트로바이러스 전달을 활용하여 세포 생존율에 최소한의 영향을 미치면서 >30%의 적절한 유전자 전달 효율을 산출하였다. 앞서 설명한 레트로바이러스 를 사용하여 생성된 CXCR4-뮤린 줄기세포 바이러스-내부 리보솜 진입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP; MigR1)^16,마우스 CXCR4 유전자가 서브^{클로론된 4.} MigR1(대조군(Ctl)-GFP) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자는 이전에 발표된 프로토콜^4,,14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형질감염을 사용하여 생성되었다.

성공적으로 변환된 B-1a 세포를 정맥내 림프구 결핍^Rag1-/- 마우스로 옮겼다. 기증자 및 수용자 마우스 는 또한 아포리포프로테인 E (ApoE) 유전자의 녹아웃을 포함, 이는 증가 OSE 축적 및 동맥 경화증의 결과, 따라서 생체 내 B-1 세포 활성화 및 IgM 생산을위한 모델을 제공. 더욱이, 기증자 및 수용자 마우스는 CD45 동형에서 달랐다; 공여자 B-1 세포는 CD45.1+^ApoE-/- 마우스로부터 왔고^Rag1-/- CD45.2+^ApoE-/- 수용자로 옮겨졌다. 이는 유세포분석 동안 B 세포 마커에 대한 추가적인 얼룩을 가할 필요 없이 수용자 CD45.2 B 세포로부터 의 기증자 CD45.1의 분화를 허용했다. 여기에 제공된 결과는 B-1a 세포에 대한 표적 CXCR4 과발현이 B-1a 세포의 증가된 능력과 연관되어 골수로 이동하는 것을 보여 주며, 이는 증가된 혈장 항 OSE IgM과 연관되어 있다. 우리는 또한 부정적인 선택을 통해 후막 B-1 세포의 농축을위한 방법을 제공하고 효율적인 전달을위한 B-1 세포 활성화의 요구 사항을 입증합니다. 이 방법은 B-1a 세포 이동, 표현형 또는 기능에 대한 단백질 과발현의 효과를 연구하기 위해 다른 레트로바이러스 구조에 적응될 수 있다. 더욱이, CD45.1 대 CD45.2 동형 구별의 사용은 이론적으로 내인성 B 세포를 포함하는 그밖 면역 충분한 뮤린 모형으로 전송을 허용할 수 있었습니다.

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프로토콜

모든 동물 프로토콜은 버지니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 자성 분리 및 각막 B-1 세포의 농축

1. _CO2를사용하여 12-14 주 된, 남성, CD45.1⁺ApoE^-/- 마우스를 안락사 .
2. 직선 수술 가위를 사용하여 복부에 피상적 인 컷을 확인하고 복막 벽을 노출 곡선 가위를 사용하여 다시 피부를 껍질. 10 mL 주사기 및 25 G 바늘을 사용하여 37 °C RPMI-1640 배지의 10 mL로 복강을 플러시합니다. 꼬리를 잡고 15-20s에 대한 철저하게 옆으로 마우스를 이동하여 세포를 분리하기 위해 마우스를 흔들어.
   참고: 용암된 맥티노름을 마사지하면 세포 회복을 극대화할 수 있습니다.
3. 10 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용하여 후막 유체를 수집하여 내장 근처의 엉덩이 수준 바로 위의 후막 의 오른쪽 하단에 유체를 끌어 서. 상피 지방 창고와 기본 장기를 방해하지 마십시오. 오멘탈 지방이 주사기에 쉽게 유입될 수 있기 때문에 마우스의 왼쪽에서 액체를 그리지 마십시오.
4. 6~7mL의 유체가 수집되면 얼음 위에 놓인 50 mL 원엽 튜브로 분배합니다. 다음으로, 포인을 사용하여 격막 위의 복막 벽을 잡고 마우스를 수직으로 들어 올리면 남은 유체가 복강의 바닥에 남아 있게 됩니다. 간 위의 수술 가위를 사용하여 각막 벽에 작은 컷을 만들고 (간을 절단하지 않도록하십시오) 유리 파이프와 전구를 사용하여 남아있는 각액을 수집하십시오.
5. 모든 CD45.1⁺ApoE^-/- 마우스(n = 15−20)에서 50 mL 원뿔형 튜브로 풀 퍼미토네워시 아웃 세포를 넣고 얼음 위에 보관합니다.
   참고 : 필요한 마우스의 수를 계산하기 위해 : B-1a 세포는 전체 복막 인구의 5-10 %를⁵ 구성하고 저자의 손에 마우스 당 약 2.5-5 x 10 B-1a 세포를 산출한다. 전율 효율은 아래와 같이 ~ 30-40%입니다.
6. 트라이판 블루 및 혈세포계와 같은 생존 용염료를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다 (트리판 블루에서 샘플을 1:5로 희석하고 10 μL을 혈세포계 챔버에 로드). 튜브 당 최대 1 x 10⁸ 셀에서 풀 셀. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리세포를 흡인한 다음 흡인한다.
7. 안티 CD16/CD32항체(재료표)의1mL에 최대 1 x 10^8세포를 재중단하여 1:50을 분석 버퍼(1x 인산완충식염수[PBS], 0.5% 소 혈청 알부민[BSA], 2 mMEDTA)로 희석하여 수용체를 차단하였다. 셀 수에 따라 필요에 따라 배율을 조정합니다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
8. 고갈을 위한 분석 완충액에서 생체티니티화된항체(표 1)의2x 마스터 믹스를 준비한다. 2x 마스터 믹스는 안티 CD16/CD32로 인큐베이팅할 때 세포가 이미 있는 액체의 부피를 차지합니다. 예를 들어, 세포가 희석된 항 CD16/CD32의 500 μL에서 인큐베이팅하는 경우, 생물질화된 Ter119, Gr-1, CD23 및 NK1.1 항체의 10 μL을 포함하는 2x 마스터 믹스의 500 μL을 추가하고, Table 125 μL의 생체측F4/80 항체를 최종 농도를 달성한다. 세포에 2x 마스터 믹스를 넣고 4°C에서 20분 동안 얼룩을 제거합니다.
9. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 완충제 및 원심분리기를 5 mL로 세척하고 흡인상피제를 흡입한다.
10. 제조업체가 권장하는 농도 및 프로토콜에 따라 분석 버퍼로 희석된 항바이오틴 마이크로비드(Tableof Materials)로세포를 재중단 및 배양한다.
11. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 버퍼와 원심분리기를 세척합니다. 흡위제 및 분석 버퍼의 500 μL에서 최대 1 x 10⁸ 세포를 재중단한다.
12. 분석 버퍼의 3 mL와 주요 자기 선택 열(재료의 표). 프라이밍 된 자기 선택 컬럼에 세포를 전달하고 얼음에 15 mL 원엽 튜브에서 농축 된 B-1 세포를 포함하는 용리액을 수집합니다. 수집된 전체 부피가 10 mL가 될 때까지 추가분석 버퍼로 자기 선택 컬럼을 세척한다.
    참고: 사전 정제 및 후 정제 된 세포 분획의 aliquot는 그림 2에도시 된 바와 같이 CD19+ B 세포, F480+ 대식세포 및 CD5+ T 세포에 대한 염색에 의해 정제 효율을 위한 유세포측정에 의해 별도로 분석되어야 한다.
13. 1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 계수하여 정제 후 세포 분획(농축된 B-1 세포를 함유하는 용리액)을 카운트하고, B 세포 배양 배지에서 1 x 10⁶ 세포 / mL에서 다시 중단 (RPMI-1640, 10 % 열 불활성화 태아 소 혈청 [FBS], 10 mM HEPES, 1x 비 필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루바테, 50 μg / mL 젠타미신, 55 μM-β 메르카포에탄.

2. 복막 B-1 세포 자극

1. 두 개의 트랜스듀싱 된 조건 (Ctl-GFP 및 CXCR4-GFP)에 대한 분할 풀화 된 세포를 따로 설정하고 비 변환 된 제어를 위해 적어도 10 x 10⁶ 셀을 도금합니다.
2. 96 웰 라운드 바닥 플레이트에 잘 당 150 μL (150,000 셀)까지 플레이트.
3. 세포 증식을 자극하기 위해 모든 우물에 100 nM TLR9 작용제 ODN1668을 추가합니다.
4. 37 °C에서 16-18 시간 동안 배양, 5 %_CO2.

3. 복막 B 세포의 레트로 바이러스 성 전환

1. 이전에 발표된 프로토콜^14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형혈을 이용한 Ctl-GFP(MigR1) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자를 생성한다.
   참고 : 이것은 며칠이 걸릴 것이므로이 프로토콜을 시작하기 전에 -80 °C에서 aliquots를 준비하고 역류하여 저장하십시오.
2. 얼음에 레트로 바이러스 주식을 해동. 즉시 사용하고 동결 해동 주기 동안 바이러스 적재자가 크게 감소함에 따라 다시 동결하지 마십시오. Ctl-GFP 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스 초월제를 세포에 감염(MOI)의 복합성(MOI)으로 추가하여, 55μM 최종 농도에서 8 μg/mL 폴리브레인 및 신선한 β-메르카포에탄올이 존재합니다. 비변환 된 제어를 위해 따로 설정 된 세포에 바이러스 성 주식을 추가하지 마십시오.
3. 실온에서 90 분 동안 800 x g에서 원심 분리 플레이트로 스프 감염을 수행하십시오.
4. 37°C에서 레트로바이러스가 있는 플레이트를 배양하고, 5%_CO2를 추가로 3시간 동안 배양한다.
5. 신선한 B 세포 배지에서 세포를 수확하고 재플레이트하고 37°C, 5%_CO2에서 밤새 배양한다.

4. 트랜스듀싱 된 각막 B-1a 세포의 세포 분류

1. 배양된 세포를 수확하고 각 조건에 대해 3개의 분리된 50 mL 원추형 튜브로 풀: 비형화, Ctl-GFP 변환, 및 CXCR4-GFP 변환.
2. 1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 카운트한 다음, 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 하고 흡인상상체를 흡인한다.
3. Fc 수용체를 차단하기 위해 1:50 항 CD16/CD32항체(재료표)를함유하는 100,000개의 세포/μL을 정렬 버퍼(PBS + 1% BSA)에서 재중단한다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
4. 보상 제어를 위한 Aliquot 세포 (보상 대조군 당 ~ 30,000 셀): 비형질화 된 샘플에서 비 스테인드 및 단일 얼룩 제어 알리쿼트 및 변환 된 샘플에서 GFP 단일 얼룩 제어 aliquot.
   참고: 비형질 세포 수가 낮은 경우 상업적으로 이용 가능한 보상 비드는 단일 얼룩 제어에 사용할 수 있습니다.
5. 플루오로포폴을 함유하는 2x 항체 마스터 믹스를 정렬 완충액으로준비한다(표 1). 비변환, CTL-GFP 변환 및 CXCR4-GFP 변환 샘플에 2x 마스터 믹스를 추가합니다. 단일 얼룩 컨트롤에 개별 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
   참고 : 2x 마스터 믹스는 1.8 단계에서와 같이 안티 CD16 / CD32로 인큐베이팅 할 때 세포가 이미있는 액체의 양을 차지합니다. 각 조건에서 세포의 aliquot는 CXCR4과발현을 확인하기 위해 CXCR4에 대해 별도로 염색될 수 있다.
6. 1 mL의 버퍼로 샘플을 세척하고 70 μm 필터를 통해 폴리 프로필렌 튜브로 변형시.
7. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 흡인하여 흡인한다. 정렬 버퍼에서 50,000 셀/μL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.
8. 세포 선별 에 앞서 표지형 형광 활성화 세포 선별(FACS) 수집 튜브1 mL을 함유하는 포집 배지(RPMI-1640) 20% 열 불활성화 FBS, 10 mM HEPES, 1x 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루브, 50 μg/mL 겐타미신, 55μM β-메르카포에탄올) 각 집단에 대해 분류되어야 한다.
9. 셀 선별기에서 샘플을 실행하기 전에 죽은 셀 판별에 대해 2x DAPI(정렬 버퍼에서 1:5000 희석으로 제조)를 추가합니다.
10. GFP+ B-1a 세포를 DAPI-CD19+ GFP^{- +} B220^미드로 CD23-CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터의^{+ 세포-} DAPI로서 수집 배지를 포함하는 FACS 튜브로 정렬한다.^{- +} 비형 변환 샘플을 사용하여 GFP+ 게이트를 설정하고 DAPI-CD19+^- GFP- B220^미드로 CD23-IgM^{+ +} CD5+ 비형 변환 된 B-1a 세포를 정렬합니다.^{- - +}
    참고: 대안적으로, 비형 전환 된 세포는 또한 GFP- 분획 내에서 B-1a 세포를 별도로 게이팅하여 CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터 분류될 수 있다. 트랜스듀싱 또는 비-트랜스듀싱 된 B-1b 세포는 또한 DAPI^{-CD19 +} GFP^+/- B220^미드로 CD23^- IgM⁺ CD5^- 세포로서 이 정렬 전략을 사용하여 정렬 될 수있다.

5. 입양 이전

1. 세포 선별 후, 원심분리세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 조심스럽게 흡인한다.
2. 1,000 세포/μL에서 차가운 멸균 1x PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.
3. 이소플루란을 사용하여 수컷^{Rag1-/- ApoE-/-} 마우스를 마취시키고 초미세 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 내 레트로 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스 당 100 μL (100,000 세포)를 주입합니다. 대조군으로 1x PBS를 가진 몇몇 마우스를 주입하십시오.

6. 공여자 세포 및 혈장 IgM의 정량화

1. 원하는 시간 에서 입양 후 전송, 골수 및 비장 조직^수확에 의해 수용자 마우스에서 전송 된 세포를 분석 4 및 유세포 분석. CD45.1, CD45.2 및 CXCR4에 대한 염색을 통해 공여체 세포 국소화 및 CXCR4 과발현을 정량화하고 Flowjo와 같은 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.
   참고: 이 단계에서 사용되는 항체는 표 1을 참조하십시오. GFP가 형질전환 공여자 세포상에 존재할 때 FITC 채널에서 형광이 존재하는 항체 컨쥬게이트를 사용하지 않도록 한다.
2. 동물 희생 시 심장 천자를 통해 수집된 전혈에 0.5 M EDTA의 10 μL을 첨가하여 혈장을 분리하였다. 7,000 x g에서 전혈을 분리된 1.5 mL 원심분리관으로 분리하여 원심분리기. ELISA^4에의한 IgM과 같은 분비 인자의 분석을 수행 할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

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결과

프로토콜의 개요는 그림 1에있습니다. 그림 2는 다른 각막 세포 유형의 자기 고갈 후 후막 B-1a 세포의 농축을 표시합니다. 고갈 후 분획에서 살아있는 단일 세포는 F4/80+ 대식세포에 비해⁺ CD19+ B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5^hi CD19-T 세포가 결여되고, CD19+^{CD5 미드} B-1a 세포의 증가된 주파수를 함유하고 있다.^{- +}

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토론

여기에 제공된 방법은 안정적이고 비교적 효율적인 1차 B-1a 세포 유전자 전달, 생체 내 입양 전달, 주입된 세포의 식별 및 국소화를 가능하게 한다. 세포는 세포 전이 후 17주 동안 검출될 수 있었고 증가된 CXCR4 발현을 유지하였다. 레트로바이러스 매개 전달은 우리의 손에 있는 세포 생존에 최소한의 충격으로 1 차 적인 murine B-1a 세포의 30-40% transduction 효율성을 산출했습니다(그림 4e...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 micron filter caps	Falcon	352235
anti-biotin microbeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block	Life Technologies	MFCR00
B220 APC	eBioscience	17-0452-83	Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
CD19 APCef780	eBioscience	47-0193-82	Clone: eBio1D3
CD23 biotin	eBioscience	13-0232-81	Clone: B3B4
CD23 PECy7	eBioscience	25-0232-82	Clone: B3B4
CD3e biotin	eBioscience	13-0033-85	Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560580	Clone: A20
CD45.2 BV421	BD Biosciences	562895	Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD5 PE	eBioscience	12-0051-83	Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC	eBioscience	17-9991-82	Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin	Life Technologies	MF48015	Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6	Treestar Inc.	License required
Gentamicin	Gibco	15710-064
Gr-1 biotin	eBioscience	13-5931-82	Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum	Gibco	16000-044
HEPES	Gibco	15630-080
IgM PECF594	BD Biosciences	562565	Clone: R6-60.2
Insulin syringes	BD Biosciences	329461
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405
Live/Dead Yellow	Life Technologies	L34968
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
NK1.1 biotin	BD Biosciences	553163	Clone: PK136
Non-essential amino acids	Gibco	11140-050
ODN 1668	InvivoGen	tlrl-1668
PBS	Gibco	14190-144
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Ter119 biotin	eBioscience	13-5921-82	Clone: Ter119