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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l'analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.

Abstract

Poiché la funzione cellulare è influenzata da fattori specifici della nicchia nel microambiente cellulare, i metodi per sezionare la localizzazione e la migrazione delle cellule possono fornire ulteriori informazioni sulla funzione cellulare. Le cellule B-1a sono un sottoinsieme di cellule B univoco nei topi che producono anticorpi IgM naturali protettivi contro gli epitopi specifici dell'ossidazione che sorgono durante la salute e la malattia. La produzione di IgM a cellule B-1a varia a seconda della posizione delle cellule B-1a, e quindi diventa utile da un punto di vista terapeutico indirizzare la localizzazione B-1a a nicchie a sostegno della produzione di anticorpi ad alta. Qui descriviamo un metodo per indirizzare la migrazione delle cellule B-1a al midollo osseo per sovraespressione retrovirale del recettore chemiochina C-X-C 4 (CXCR4). L'induzione genica nelle cellule murine B primarie può essere difficile e in genere produce basse efficienze di trasfezione del 10-20% a seconda della tecnica. Qui dimostriamo che la trasduzione retrovirale delle cellule murine B-1a primarie si traduce in un'efficienza di trasduzione del 30-40%. Questo metodo utilizza il trasferimento di cellule adottive di cellule B-1a trasdotte in topi destinatari carenti di cellule B in modo che sia possibile visualizzare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a del donatore B-1a. Questo protocollo può essere modificato per altri costrutti retrovirali e può essere utilizzato in diversi saggi funzionali di trasferimento post-adozione, compresa l'analisi della cellula donor o della funzione della cellula ospite, o l'analisi di fattori solubili secreti dopo il trasferimento di cellule B-1a. L'uso di distinti topi donatori e riceventi differenziati da allotipi CD45.1 e CD45.2 e la presenza di un reporter GFP all'interno del plasmide retrovirale potrebbero anche consentire il rilevamento di cellule donatrici in altri modelli murini immunosufficienti contenenti popolazioni di cellule B endogene.

Introduzione

Recenti studi hanno dimostrato una notevole cellula immunitaria, e in particolare cellule B, fenotipica e eterogeneità funzionale a seconda della localizzazione cellulare1,2,3,4,5. Le cellule B-1a sono una di queste popolazioni con capacità eterogenea di produrre anticorpi IgM protettivi; Le cellule del midollo osseo B-1a secernono IgM in modo costitutivo e contribuiscono in modo significativo al plasma IgM titers6, mentre le cellule peritoneali B-1a hanno una secrezione IgM di basso livello all'omeostasi e possono invece essere attivate attraverso il recettore innato del toll-like (TLR) o la segnalazione di citokine mediata a proliferare rapidamente, migrare, e secernere IgM7,8,9,10. Gli anticorpi IgM delle cellule B-1a riconoscono gli epitopi specifici dell'ossidazione (OSE) presenti su patogeni, cellule apoptotiche e LDL ossidati, e il legame IgM all'OSE possono prevenire la segnalazione a valle in malattie come l'aterosclerosi infiammatoria11. Pertanto, le strategie per aumentare la produzione di IgM attraverso l'aumento della migrazione cellulare B-1a peritoneale a siti come il midollo osseo possono essere terapeuticamente utili. Tuttavia, è importante che tali strategie siano mirate e specifiche del tipo di cellula, poiché gli effetti off-target possono avere un impatto negativo sulla funzione o sulla salute del sistema immunitario.

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione mirata e a lungo termine di CXCR4 nelle cellule primarie murine B-1a e il successivo trasferimento adottivo per visualizzare la migrazione delle cellule e la produzione funzionale di anticorpi IgM (Figura 1). La manipolazione genetica delle cellule B primarie è limitata da basse efficienze di trasfezione rispetto alla trasfezione di linee cellulari trasformate. Tuttavia, poiché le linee cellulari trasformate possono deviare significativamente dalle cellule primarie12,13, è probabile che l'uso di cellule primarie fornisca risultati più strettamente allineati alla fisiologia normale. Sono state descritte diverse tecniche per il trasferimento genico nelle cellule primarie del murino B, tra cui trasduzione retrovirale, trasduzione adenovirale, lipofezione o trasfezione basata sull'elettroporazione, che hanno diversi livelli di efficienza, transitorietà e impatto sulla salute cellulare13,14,15. Il seguente metodo ha utilizzato la trasduzione retrovirale in quanto ha prodotto un'adeguata efficienza di trasferimento genico di >30%, con un impatto minimo sulla vitalità cellulare. Il retrovirus espresso CXCR4 è stato generato utilizzando il costrutto retrovirale descritto in precedenza per il virus della cellula staminale murine, l'ingresso interno del sito-proteina fluorescente verde (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in cui il gene CXCR4 del topo era sub-clonato4. Le particelle retrovirali MigR1 (control(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP sono state generate utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio, come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza4,14.

Le cellule B-1a trasdotte con successo sono state poi trasferite per via endovenosa nei topi Rag1-/-mitragliati carenti di linfocite. Sia i topi donatori che quelli riceventi contenevano inoltre l'eliminazione del gene dell'apolipoproteina E (ApoE), che si traduce in un aumento dell'accumulo di OSE e dell'aterosclerosi, fornendo così un modello per l'attivazione cellulare B-1 in vivo e la produzione di IgM. Inoltre, i topi donatori e ricittori differivano nell'allotipo CD45; Le cellule del donatore B-1 provenivano datopi CD45.1 e sono stati trasferiti neidestinatari Rag1-/- CD45.2. Ciò ha permesso la differenziazione del donatore CD45.1 dalle cellule CD45.2 B del ricevente dopo il trasferimento senza la necessità di macchiare ulteriormente i marcatori di cellule B durante l'analisi della citometria di flusso. I risultati forniti qui dimostrano che la sovraespressione mirata di CXCR4 sulle cellule B-1a si associa alla maggiore capacità delle cellule B-1a di migrare verso il midollo osseo, che associa a un aumento del plasma anti-OSE IgM. Forniamo inoltre un metodo per l'arricchimento delle cellule B-1 peritoneali attraverso la selezione negativa e dimostriamo il requisito dell'attivazione delle cellule B-1 per una trasduzione efficiente. Questo metodo può essere adattato per altri costrutti retrovirali per studiare l'effetto della sovraespressione proteica sulla migrazione, sul fenotipo o sulla funzione delle cellule B-1a. Inoltre, l'uso della distinzione di allotipo CD45.1 rispetto a CD45.2 potrebbe teoricamente consentire il trasferimento in altri modelli murini immunosufficienti contenenti cellule B endogene.

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Protocollo

Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia.

1. Separazione magnetica e arricchimento delle cellule B-1 peritoneali

  1. Eutanasia un topo di 12-14 settimane, maschio, CD45.1-ApoE-/- utilizzando CO2.
  2. Fare un taglio superficiale nell'addome utilizzando forbici chirurgiche dritte e staccare la pelle utilizzando forbici curve per esporre la parete peritoneale. Sciacquare la cavità peritoneale con un mezzo RPMI-1640 da 37 ml utilizzando una siringa da 10 mL e un ago da 25 G. Agitare il mouse per disinserire le cellule afferrando la coda e muovendo il mouse da un lato all'altro accuratamente per 15-20 s.
    NOTA: Massaggiare il peritoneo lavaged può anche massimizzare il recupero cellulare.
  3. Raccogliere il liquido peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL e un ago da 25 G elaborando il liquido nella parte inferiore destra del peritoneo appena sopra il livello dell'anca, vicino all'intestino. Evitare di interrompere depositi di grasso epidydimici e organi sottostanti. Evitare di disegnare liquido dal lato sinistro del mouse come il grasso omentale può essere facilmente attratto nella siringa.
  4. Una volta raccolti 6,7 mL di liquido, erogare in un tubo conico da 50 mL posto sul ghiaccio. Successivamente, elevare il mouse verticalmente tenendo la parete peritoneale sopra il diaframma utilizzando pinze in modo che qualsiasi liquido rimanente rimanga nella parte inferiore della cavità peritoneale. Fare un piccolo taglio nella parete peritoneale utilizzando forbici chirurgiche sopra il fegato (assicurarsi di non tagliare il fegato) e raccogliere qualsiasi fluido peritoneale rimanente utilizzando un tubo di vetro e bulbo.
  5. In pool le cellule di lavaggio peritoneali di tutti i topi CD45.1-ApoE-/- (n - 15-20) in tubi conici da 50 mL, e conservate sul ghiaccio.
    NOTA: Per calcolare il numero di topi necessari: le cellule B-1a costituiscono il 5-10% della popolazione peritoneale totale e producono circa 2,5 x 5 x 105 cellule B-1a per topo nelle mani degli autori. L'efficienza della trasduzione è del 30-40%, come mostrato di seguito.
  6. Contare le cellule vive utilizzando un colorante di viabilità come il blu trypan e un emocitometro (campioni diluiti 1:5 in blu trypan e caricare 10 L nella camera emocitometrica). Celle da biliardo fino a 1 x 108 celle per tubo. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, quindi aspirare supernatant.
  7. Risospendere fino a 1 x 108 cellule in 1 mL di anticorpo anti-CD16/CD32 (Tabella dei materiali) diluito 1:50 nel buffer di analisi (1x fosfato bufferta salina [PBS], 0.5% bovine siero albumin [BSA], 2 mM EDTA) al fine di bloccare i recettori Fc. Ridimensionare in base alle esigenze in base al numero di celle. Incubare sul ghiaccio per 10 min a 4 gradi centigradi.
  8. Preparare un mix master 2x degli anticorpi biotinylati (Tabella 1) in buffer di saggio per l'esaurimento. Il master mix 2x rappresenta il volume del liquido in cui si trovano già le cellule durante l'incubazione con anti-CD16/CD32. Ad esempio, se le cellule sono incubate in 500 gradi di anticorpi diluiti anti-CD16/CD32, aggiungere 500 l di 2x master mix contenenti 10 l di Ter119 biomutato, Gr-1, CD23 e NK1.1 e 25 l degli anticorpi biotinylati F4/80 per ottenere le concentrazioni finali date nella tabella 1. Aggiungete 2x master mix alle celle e colorate per 20 min a 4 gradi centigradi.
  9. Lavare le cellule con 5 mL di tampone di analisi e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato.
  10. Risospendere e incubare le cellule con microsfere anti-biotina (Tabella dei materiali) diluite nel buffer di analisi in base alla concentrazione e al protocollo raccomandati dal produttore.
  11. Lavare con 5 mL di tampone di analisi e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare supernatante e risospendere fino a 1 x 108 celle in 500 : L di buffer di assay.
  12. Prime colonne di selezione magnetica (Tabella dei materiali) con 3 mL di buffer di analisi. Trasferire le cellule su colonne di selezione magnetica innescate e raccogliere l'eluente contenente cellule B-1 arricchite in un tubo conico da 15 mL sul ghiaccio. Lavare la colonna di selezione magnetica con buffer di analisi aggiuntivo fino a quando il volume complessivo raccolto è di 10 mL.
    NOTA: un'aliquota delle frazioni cellulari pre-purificate e post-purificate deve essere analizzata separatamente dalla citometria di flusso per l'efficienza di purificazione mediante la colorazione per le celle CD19 e B, i macrofagi F480 e le celle T CD5, come illustrato nella Figura 2.
  13. Contare la frazione di cella post-purificata (l'eluente contenente celle B-1 arricchite) contando le celle vive come nel passaggio 1.6, e risospendere a 1 x 106 cellule/mL nel mezzo di coltura cellulare B (RPMI-1640, 10% siero bovino fetale inattivato dal calore [FBS], 10 m HEPES, 1x aminoacidi non essenziali, 1 mM di pyruvate di sodio, 50 g/mL gentamicin, 55M -mercaptoetanolo).

2. Stimolazione cellulare B-1 peritoneale

  1. Dividi cellule raggruppate per le due condizioni trasdotte (Ctl-GFP e CXCR4-GFP), mettendo da parte e placcando almeno 10 x 106 celle per un controllo non transddetto.
  2. Piastra fino a 150 l (150.000 cellule) per bene in piastre rotonde-basso 96-pozzo.
  3. Aggiungere 100 nM TLR9 agonisto ODN1668 a tutti i pozzi per stimolare la proliferazione cellulare.
  4. Incubare per 16/18 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.

3. Trasduzione retrovirale delle cellule B peritoneali

  1. Generare particelle retrovirali Ctl-GFP (MigR1) e CXCR4-GFP utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza14.
    NOTA: Questo richiederà diversi giorni, in modo da preparare e titer scorte retrovirali e memorizzare aliquote a -80 c prima di iniziare questo protocollo.
  2. Scongelare le scorte di retrovirus sul ghiaccio. Utilizzare immediatamente e non ricongelare come titer virus diminuisce significativamente durante i cicli di congelamento-disgelo. Aggiungere acelle la supernessificatrice retrovirale Ctl-GFP o CXCR4-GFP a 20:1 molteplicità di infezione (MOI), in presenza di 8 polibrene sg/mL e di mercaptoetanolo fresco di mercaptoetanolo a 55 m di concentrazione finale. Non aggiungere scorte virali alle cellule accantonanti per il controllo non transciso.
  3. Eseguire la spinfezione da piastre centrifugaa a 800 x g per 90 min a temperatura ambiente.
  4. Incubare piastre con retrovirus a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 per altri 3 h.
  5. Raccogliere e rifare le cellule nel mezzo di cellule B fresche e incubare a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 durante la notte.

4. Smistamento cellulare di cellule B-1a trasdotte

  1. Raccogliere cellule coltivate e pool in tre tubi conici da 50 mL separati per ogni condizione: non trasstanza, Ctl-GFP transdotta e CXCR4-GFP trasdotta.
  2. Contare le cellule vive come nel passo 1.6, quindi centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato.
  3. Risospendere le celle a 100.000 celle/l nel buffer di ordinamento (PBS - 1% BSA) contenenti anticorpi 1:50 anti-CD16/CD32 (Tabella dei materiali) per bloccare i recettori Fc. Incubare sul ghiaccio per 10 min a 4 gradi centigradi.
  4. Cellule per i controlli di compensazione (30.000 cellule per controllo retributivo): per controlli incontaminati e monotura da campioni non trasdotti e per il controllo delle macchie singole GFP da campioni dotteddotti di d'azione.
    NOTA: i perline di compensazione disponibili in commercio possono essere utilizzati in alternativa per i controlli a macchia singola se il numero di cellulare non transdotti è basso.
  5. Preparare una miscela master di 2x anticorpi contenenti gli anticorpi coniugati con fluoroforo nel buffer di ordinamento (Tabella 1). Aggiungere 2x master mix a campioni trasdotti non transdotti, CTL-GFP e campioni trasdotti CXCR4-GFP. Aggiungere singoli anticorpi ai controlli delle macchie singole. Incubare per 20 min a 4 gradi centigradi al buio.
    NOTA: il master mix 2x tiene conto del volume di liquido in cui si trovano già le cellule durante l'incubazione con anti-CD16/CD32, come nel passaggio 1.8. Un aliquota di cellule da ogni condizione può essere colorato separatamente per CXCR4 per confermare la sovraespressione CXCR4.
  6. Lavare i campioni con 1 mL di tampone di tipo e filtrare attraverso filtri da 70 m in tubi di polipropilene.
  7. Centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato. Risospendere i campioni a 50.000 celle/L nel buffer di ordinamento.
  8. Prima dello smistamento delle celle preparare tubi di raccolta con attivazione della fluorescenza (FACS) contenenti 1 mL di mezzo di raccolta (RPMI-1640, 20% di FBS disattivazione del calore, 10 m HEPES, 1x aminoacidi non essenziali, 1 mM di pydium pyruvate, 50 g/mL gentamicin, 55 m-mercaptoonol) per ogni popolazione da deordinare.
  9. Prima di eseguire campioni sulla selezionatrice di celle aggiungere 2x DAPI (preparato come 1:5000 diluizione nel buffer di ordinamento) per la discriminazione delle cellule morte.
  10. Ordinare le cellule B-1a in tubi FACS contenenti il supporto di raccolta come DAPI- CD19- BFP- B220mid-lo CD23- IgM- CD5- cellule dei campioni CTL-GFP e CXCR4-GFP. Utilizzare il campione non trasseguito per impostare il gate GFP e per ordinare DAPI- CD19- GFP- B220mid-lo CD23- IgM- CD5- cellule B-1a non trasdotte.
    NOTA: In alternativa, le cellule non transdotte possono anche essere ordinate dai campioni CTL-GFP e CXCR4-GFP grattuando separatamente le cellule B-1a all'interno della frazione GFP. Le cellule B-1b trasdotte o non trasdotte possono anche essere smistati utilizzando questa strategia di ordinamento come DAPI- CD19- GFP-/- B220mid-lo CD23- IgM- CD5- cellule.

5. Trasferimento adottivo

  1. Dopo lo smistamento delle cellule, centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare supernatante con attenzione.
  2. Risospendere le cellule a freddo sterile 1x PBS a 1.000 celle/L.
  3. Anestesizzare maschio Rag1-/- ApoE-/- topi che utilizzano isoflurane e iniettare 100 L (100,000 cellule) per topo tramite iniezione di vena retro-orbitale o coda per via endovenosa o vena posteriore utilizzando una siringa di insulina ultra-fine. Iniettare alcuni topi con 1x PBS come controllo.

6. Quantificazione delle cellule donatrici e del plasma IgM

  1. Al momento desiderato trasferimento post-adozione, analizzare le cellule trasferite nei topi destinatari con midollo osseo e tessuto della milza raccolto4 e citometria di flusso. Quantifica la localizzazione delle cellule donatorie e la sovraespressione CXCR4 colorando CD45.1, CD45.2 e CXCR4 e analizza i risultati della citometria di flusso utilizzando un software come Flowjo.
    NOTA: Vedere la Tabella 1 per gli anticorpi utilizzati in questo passaggio. Assicurarsi di non utilizzare un controcatenare coniugato che fluoresce nel canale FITC come GFP sarà presente sulle cellule donatrici trasdotte.
  2. Isolare il plasma aggiungendo 10 DiVi di 0,5 M EDTA al sangue intero raccolto tramite puntura cardiaca al momento del sacrificio animale. Centrifugare il sangue intero a 7.000 x g e il plasma sifezza in tubi di centrifuga tural separati da 1,5 mL. Conservare a -80 gradi centigradi fino a eseguire l'analisi di fattori secreti come IgM di ELISA4.

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Risultati

Una panoramica del protocollo è data figura 1. La figura 2 mostra l'arricchimento delle cellule B-1a peritoneali dopo l'esaurimento magnetico di altri tipi di cellule peritoneali. Le cellule singlet vive nella frazione post-deplezione hanno una percentuale maggiore di cellule B CD19 e B rispetto a F4/80- macrofagi, mancano di cellule CD5hi CD19- T e contengono una frequenza maggiore di cellule Cd19 - CD5medie B-1a ris...

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Discussione

Il metodo qui fornito consente la somministrazione stabile e relativamente efficiente del gene delle cellule B-1a primarie, il trasferimento adottivo in vivo e l'identificazione e localizzazione delle cellule iniettate. Le cellule sono state in grado di essere rilevate 17 settimane di trasferimento post-cella e mantenuto una maggiore espressione CXCR4. La consegna mediata da retrovirus ha prodotto un'efficienza di trasduzione del 30-40% delle cellule primarie del murino B-1a con un impatto minimo sulla vitalità cellular...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 di P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) e R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye è stato supportato dalla borsa di studio pre-dottorato dell'American Heart Association 16PRE30300002 e 5T32AI007496-20. Ringraziamo Joanne Lannigan, Mike Solga e Claude Chew dell'University of Virginia Flow Cytometry Core per la loro eccellente assistenza tecnica.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
70 micron filter capsFalcon352235
anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc blockLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Clone: eBio1D3
CD23 biotineBioscience13-0232-81Clone: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Clone: B3B4
CD3e biotineBioscience13-0033-85Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Clone: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- miceN/AN/ABred in house
CD5 PEeBioscience12-0051-83Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirusN/AN/AGenerated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotinLife TechnologiesMF48015Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.License required
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 biotineBioscience13-5931-82Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serumGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Clone: R6-60.2
Insulin syringesBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein Animal Health029405
Live/Dead YellowLife TechnologiesL34968
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 biotinBD Biosciences553163Clone: PK136
Non-essential amino acidsGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Sodium pyruvateGibco11360-070
Ter119 biotineBioscience13-5921-82Clone: Ter119

Riferimenti

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