Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

Summary

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Abstract

כאשר פונקציית התא מושפעת מגורמים ספציפיים לנישה בסביבת מיקרו-הסביבה הסלולרית, שיטות לנתח את הלוקליזציה של תאים והגירה יכולות לספק תובנה נוספת בנוגע לתפקוד התא. התאים b-1a הם קבוצת משנה ייחודית של תא B בעכברים לייצר נוגדנים IgM טבעי המגן נגד האפיסקופים ספציפיים חמצון הנובעים במהלך בריאות ומחלות. B-1a הייצור של תא IgM משתנה בהתאם למיקום התא B-1a, ולכן הוא הופך להיות שימושי מבחינה טיפולית כדי למקד את B-1a לוקליזציה לתמיכה נישות של ייצור נוגדנים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה למקד את ה-B-1a תא הגירה מח העצם על ידי retroviral-ביטוי overexpression של C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4). האינדוקציה ג'ין בתאי murine הראשי B יכול להיות מאתגר ובדרך כלל לתשואות יעילות החצייה נמוכה של 10-20% בהתאם לטכניקה. כאן אנו מדגימים כי התמרה ויראלי של התאים הראשוניים B-1a התוצאות 30-40% יעילות התמרה. שיטה זו מנצלת העברת תאים המאמצת של תאים B-1a לתוך עכבר לקוי של הנמען תא כדי להפוך את העברת התאים של התורם B-1a ולוקליזציה ניתן לדמיין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור מבנים retroviral יעיל אחרים ניתן להשתמש בתוך מגוון פונקציונלי שלאחר העברה המאמצת, כולל ניתוח של תא התורם או המחשב המארח של תאים ותפקוד, או ניתוח של גורמים מסיסים מופרש post B-1a העברת תאים. השימוש של תורמים ועכברים הנמען ברורים הבדיל על-ידי CD 45.1 ו-CD 45.2 allotype ואת הנוכחות של עיתונאי GFP בתוך הפלסטלינה הretroviral יעיל אמצע יכול גם לאפשר זיהוי של תאים תורמים אחרים, החיסונית מספיק מודלים של העכבר המכיל את אוכלוסיית התאים האנדוגניים B.

Introduction

מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו תא החיסון ניכר, ובמיוחד B תא, פנוטיic ו טרוגניות פונקציונלי בהתאם לוקליזציה של התא^1,2,3,4,5. B-1a תאים הם אחד כזה אוכלוסיה עם יכולת הטרוגנית לייצר נוגדנים IgM מגן; מח עצם B-1a תאים להפריש באופן קונסטיטוטיבי ולתרום בצורה משמעותית את מגדל פלזמה מטרים⁶, בעוד בתאי הצפק B-1a יש ברמה נמוכה igm הפרשה ב הומאוסטזיס ובמקום זאת ניתן להפעיל דרך קולטן מולדים שיחת כמו (tlr) או cytokine בתיווך איתות כדי להתרבות במהירות, להעביר, ו להפריש igm^7,8,9,10. B-1a בתאי IgM לזהות אפיסקופים ספציפיים לחמצון (OSE) הנמצאים על פתוגנים, תאים אפוטוטיים, ו-LDL תחמוצת, ו-IgM קשירה כדי OSE יכול למנוע דלקת במורד הזרם מחלות כמו טרשת עורקים¹¹. לכן, אסטרטגיות כדי להגדיל את ייצור IgM באמצעות הגדלת הצפק B-1a תא הגירה לאתרים כמו מח העצם עשוי להיות שימושי מבחינה רפואית. עם זאת, חשוב עבור אסטרטגיות כאלה כדי להיות ממוקד ותא סוג ספציפי, כמו תופעות מחוץ ליעד עלול להשפיע באופן שלילי על תפקוד המערכת החיסונית או בריאות.

כאן אנו מתארים שיטה ממוקדת לטווח ארוך הביטוי של CXCR4 ב-murine הראשי B-1a תאים העברה המאמצת הבאים כדי להמחיש את הגירה התא וליצור נוגדנים IgM פונקציונלי (איור 1). מניפולציה גנטית של תאי B ראשי מוגבל על ידי יעילות הזיהום נמוך לעומת העברה של קווי תאים שהפכו שינוי. עם זאת, כאשר קווי תאים שעברו שינוי יכולים לסטות באופן משמעותי מתאים ראשוניים^12,13, השימוש בתאים ראשיים עשוי לספק תוצאות הדוקות יותר לפיזיולוגיה נורמלית. טכניקות מספר תוארו עבור העברת גנים בתאי murine הראשי, כולל התמרה ויראלית, התמרה ויראלית, ליפוגן, או אלקטרופורציה המבוססת על מעבר, אשר יש רמות שונות של יעילות, ארעיות, והשפעה על בריאות התא^13,14,15. השיטה הבאה מנוצל התמרה ויראלי כפי שהוא הניב יעילות העברת גנים נאותה של > 30% בעוד מינימלית להשפיע על הכדאיות התא. וירוס CXCR4-הביע הופק באמצעות המבנה הקודם שתוארו כretroviral יעיל לבנות תא גזע מורטין הנגיף-פנימי הזנה ריבוזומאתר-חלבון פלורסנט ירוק (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, שבו העכבר CXCR4 הגן היה משוכפל משנה⁴. MigR1 (בקרה (Ctl)-gfp) ו-CXCR4-gfp החלקיקים נוצרו באמצעות הזיהום סידן פוספט כפי שמתואר פרוטוקולים שפורסמו בעבר^4,14.

לאחר מכן הותמרה בהצלחה בתאים B-1a והועברו באופן מידי אל לימפוציטים Rag1^-/- עכברים. גם עכברים התורם וגם הנמען הכילו נוקאאוט של הגנים אפוליפופרוטאין E (apoe), אשר תוצאות הצטברות OSE מוגברת טרשת עורקים, ובכך לספק מודל עבור vivo B-1 תא הפעלה ו igm הייצור. יתר על כן, עכברים תורמים ונמענים שונים ב-CD45 allotype; התאים התורמים B-1 הגיעו מתקליטור 45.1 + ApoE^-/- עכברים והועברו לתוך Rag1^- Cd 45.2 + apoe^-/- הנמענים. זה מותר הבידול של 45.1 CD התורם מתקליטור הנמען 45.2 B תאים שלאחר ההעברה ללא צורך להכתים בנוסף עבור סמנים תא B במהלך הניתוח cy, try הזרימה. התוצאות המסופקות כאן להדגים כי ממוקדות CXCR4 overexpression על B-1a תאים מקורביו עם יכולת מוגברת של תאים B-1a לעבור את מח העצם, אשר מקורביו עם פלזמה מוגברת anti-OSE IgM. אנו מספקים בנוסף שיטה להעשרת התאים הפריפריאלית ב -1 באמצעות בחירה שלילית ולהדגים את הדרישה של הפעלת תא B-1 לצורך התמרה יעילה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור מבנים retroviral יעיל אחרים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי יתר חלבון על B-1a תא הגירה, פנוטיפ, או פונקציה. יתר על כן, השימוש CD 45.1 לעומת הבחנה CD 45.2 allotype יכול תיאורטית לאפשר העברה לתוך דגמי murine אחרים מספיק החיסונית המכילים תאים אנדוגניים B.

Protocol

כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת וירג.

1. הפרדה מגנטית והעשרה של תאים בעלי 1 הצפק

1. המתת חסד 12-14-שבוע בן, זכר, CD 45.1⁺apoe^-/- עכבר באמצעות CO₂.
2. לעשות חתך שטחי בבטן באמצעות מספריים כירורגי ישר לקלף את העור האחורי באמצעות מספריים מעוקל לחשוף את הקיר הצפק. החלל הצפק סומק עם 10 מ ל של 37 ° c RPMI-1640 בינונית באמצעות מזרק 10 מ"ל ו 25 גרם מחט. לנער את העכבר כדי לנתק את התאים על ידי אוחז את הזנב והזזת העכבר לצד בצד ביסודיות עבור 15 לאחד.
   הערה: עיסוי צפק לבנה יכול גם למקסם את שחזור התא.
3. לאסוף נוזל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל 25 גרם מחט על ידי ציור למעלה נוזל בצד הימני התחתון של צפק ממש מעל רמת הירך, ליד המעיים. הימנע משיבוש מחסני שומן ואיברים המשמשים כבסיס. להימנע מציור נוזל מהצד השמאלי של העכבר כמו שומן מאונטל יכול בקלות להיגרר לתוך המזרק.
4. פעם אחת ~ 6-7 mL של נוזל נאסף, מוותר על צינור 50 mL ממוקם על קרח. הבא, העלה את העכבר אנכית על ידי החזקת הקיר הצפק מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים כך כל נוזל שנותר נשאר בתחתית חלל הצפק. לעשות חתך קטן בקיר הצפק באמצעות מספריים כירורגי מעל הכבד (לוודא שלא לחתוך את הכבד) ולאסוף את כל נוזל הצפק הנותרים באמצעות זכוכית pipet ו הנורה.
5. בריכת כשלון הצפק תאים מכל התקליטורים 45.1⁺apoe^-/- עכברים (n = 15-20 למעלה) לצינורות חרוטי 50 mL, ולאחסן על הקרח.
   הערה: לחישוב מספר העכברים הדרושים: התאים ב-1a מהווים 5-10% מכלל אוכלוסיית הצפק הכוללת ומפיקות בערך 2.5^{-5 x 10-B-} 1a תאים לכל עכבר בידי מחברים. התמרה של יעילות היא ~ 30 לערך 40%, כפי שמוצג להלן.
6. לספור תאים חיים באמצעות צבע הכדאיות כגון טרילקון כחול ו-הומוציטומטר (לדלל דגימות 1:5 בטריקון כחול ולטעון 10 μL לתוך החדר הומוציטוטומטר). תאי בריכה במרחק של עד 1 x 10⁸ תאים לכל צינור. בתאי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, ולאחר מכן לאחר מכן לאכול supernatant.
7. להשעות עד 1 x 10⁸ תאים 1 מ ל של ANTI-CD16/CD32הנוגדן (טבלה של חומרים) מדולל 1:50 במאגר מאגר (1x פוספט באגירה מלוחים [PBS], 0.5% בסרום פרה אלבומין [bsa], 2 מ"מ edta) על מנת לחסום קולטני Fc. קנה מידה לפי הצורך לפי ספירת תאים. דגירה על הקרח 10 דקות ב 4 ° c.
8. הכינו שילוב מאסטר של 2x של הנוגדנים הביוטילביים (טבלה 1) במאגר ה, עבור דלדול הפחת. 2x מיקס בסיס חשבונות לנפח של הנוזל התאים כבר בזמן הדגירה עם anti-CD16/CD32. לדוגמה, אם התאים מודתים ב-500 μL של מדולל anti-CD16/CD32, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של שילוב מאסטר 2x המכיל 10 μL של biotinylated Ter119, Gr-1, CD23, ולאחר מכן 1.1, ו 25 μL של biotinylated Table 1F4/80 נוגדנים כדי להשיג את הוסף תמהיל בסיס של 2x לתאים והכתם עבור 20 דקות ב-4 ° c.
9. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של מאגר השיטת וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-supernatant.
10. השהה מחדש את התאים האנטי-ביוטין (טבלת חומרים) מדולל במאגר הזמן לפי הריכוז והפרוטוקול המומלצים על ידי היצרן.
11. לשטוף עם 5 מ ל של מאגר שיטת וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאחר מכן השעיית מחדש עד 1 x 10⁸ תאים ב 500 μl של שיטת האגירה.
12. ראשי עמודות בחירה מגנטית (טבלת חומרים) עם 3 מ ל של מאגר השיטת. העבר תאים על עמודות בחירה מגנטי ולאסוף את המושלג המכיל מועשר B-1 תאים בצינור 15 מ ל חרוט על קרח. שטוף את עמודת הבחירה המגנטית עם מאגר שינויים נוסף עד שנפח האחסון הכולל שנאסף הוא 10 mL.
    הערה: סדרת מחלקים של שברים מטוהרים מראש ושלאחר מטוהרים צריך להיות מנותח בנפרד על-ידי cy, לנסות לייעל את יעילות הטיהור על ידי צביעת עבור CD19 + B תאים, F480 + מקרופאגים, ו CD5 + T תאים כפי שמוצג באיור 2.
13. לספור את השבר התא לאחר מטוהרים (the מכיל מועשר B-1 תאים) על ידי ספירת תאים חיים כמו בשלב 1.6, והשעיית מחדש ב-1 x 10⁶ תאים/mL בתוך התרבות B תא בינונית (RPMI-1640, 10% מופעל חום סרום העוברי העובר [fbs], 10 מ"מ hepes, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 50 μg/mL gentamicin, 55 μm β-mercaptoethanol).

2. גירוי תא פריפריאלי 1

1. פצל תאים במאגר עבור שני מצבי התמרה (Ctl-GFP ו-CXCR4-GFP), תוך הגדרה הצידה וציפוי לפחות 10 x 10⁶ תאים עבור שליטה ללא התמרה.
2. צלחת עד 150 μL (150,000 תאים) לתוך 96-היטב לוחיות הקצה התחתון.
3. הוסף 100 ננומטר TLR9 אגוניסט ODN1668 לכל הבארות כדי לעורר את התפשטות התא.
4. מודט עבור 16/18 h ב 37 ° צ', 5% CO₂.

3. התמרה ויראלית של תאי הצפק B

1. צור Ctl-GFP (MigR1) ו-CXCR4-GFP חלקיקים ויראלי באמצעות התרגום סידן פוספט כמתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר¹⁴.
   הערה: זה ייקח מספר ימים, כדי להכין מניות retroviral יעיל ולאחסן את המניות ב-80 ° צ' לפני תחילת פרוטוקול זה.
2. . להפשיר רטרו וירוס על קרח השתמש מיד ולא להקפיא מחדש כמו סיכוייו וירוס מפחיתה באופן משמעותי במהלך הקפאת ההפשרה מחזורים. הוספת Ctl-GFP או CXCR4-GFP retroviral יעיל ב-20:1 ריבוי של זיהום (מוי) לתאים, בנוכחות של 8 μg/mL polybrene טריים β-mercaptoethanol ב 55 μM ריכוז סופי. אל תוסיף מניות ויראליות לתאים שנקבעו בצד לפקד שאינו מיועד לתאי התמרה.
3. לבצע זיהום על ידי תפרידו צלחות ב 800 x g עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לוחיות הדגירה עם רטרו וירוס ב 37 ° צ', 5% CO₂ עבור תוספת 3 h.
5. הקציר ואת התאים הreplate בינונית תא B טרי ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO₂ לילה.

4. תא מיון של תאים בצפק בנפח B-1a

1. הבציר תאים מתורבתים ובריכה לתוך שלושה נפרדים 50 mL שפופרות חרוט עבור כל תנאי: לא מתתמרים, Ctl-GFP התמרה, ו-CXCR4-GFP.
2. לספור תאים חיים כמו בשלב 1.6, אז צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-supernatant.
3. השהה מחדש תאים ב 100,000 תאים/μL במאגר מיון (PBS + 1% BSA) המכיל 1:50 anti-CD16/CD32 נוגדן (טבלת חומרים) כדי לחסום קולטני Fc. דגירה על הקרח 10 דקות ב 4 ° c.
4. להתאים את התאים עבור פקדי פיצוי (~ 30,000 תאים לכל בקרת פיצוי): עבור בלתי מוכתם ושליטה אחת כתם בודד ממדגם ללא התמרה ועבור GFP יחיד בקרת הכתם מדגימות התמרה.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בחרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פקדי כתמים בודדים אם מספר תא שאינו מקבל התמרה נמוך.
5. הכינו שילוב מאסטר של נוגדן 2x המכיל את הנוגדנים הצופפור בתוך מאגר מיון (שולחן 1). הוסף מיקס תבנית בסיס של 2x ללא התמרה, CTL-GFP, ו-CXCR4-GFP דגימות. הוסיפו נוגדנים בודדים. לפקדי כתם אחד דגירה של 20 דקות ב 4 ° c בחשיכה.
   הערה: הראשי 2x מיקס חשבונות עבור נפח של נוזל התאים כבר כאשר מודגדירוג עם anti-CD16/CD32, כמו בשלב 1.8. מרחק של תאים מכל תנאי יכול בנפרד להיות מוכתם עבור CXCR4 כדי לאשר CXCR4 ביטוי יתר.
6. לשטוף דגימות עם 1 מ ל של מאגר מיון ולזן דרך מסנני 70 יקרומטר לתוך צינורות פוליפרופילן.
7. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-לאכול על ידי הסופר. השהה דגימות מחדש ב-50,000 תאים/μL במאגר מיון.
8. לפני מיון התא להכין מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) אוסף צינורות המכילים 1 מ ל של אוסף בינוני (RPMI-1640, 20% חום-מופעל FBS, 10 מ"מ HEPES, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol) עבור כל אוכלוסייה להיות מיון.
9. לפני הפעלת דגימות בסדרן התא להוסיף 2x DAPI (מוכן 1:5000 דילול במאגר מיון) עבור אפליה תא מת.
10. מיון GFP + B-1a תאים לתוך צינורות FACS המכילים בינונית אוסף כמו DAPI^- CD19⁺ gfp⁺ B220^mid-lo CD23^- IGM⁺ CD5⁺ תאים מתוך הדגימות CTL-gfp ו-CXCR4-gfp. השתמש במדגם שאינו התמרה כדי להגדיר את השער GFP + כדי למיין DAPI^- CD19⁺ gfp^- B220^mid-lo CD23^- igm⁺ CD5⁺ לא התמרה-B-1a תאים.
    הערה: לחלופין, ניתן למיין תאים שאינם מתתמרים גם מדגימות CTL-GFP ו-CXCR4-GFP על-ידי בנפרד בתאי B-1a בתוך השבר GFP. התמרה או אי-התמרה תאים B-1b יכול להיות גם ממוין באמצעות אסטרטגיה זו מיון כמו DAPI^- CD19⁺ gfp +^/- B220^mid-lo CD23^- igm^{+ CD5 תאים.}

5. העברה מאמצת

1. לאחר מיון התא, בתאי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ומכה את supernatant בזהירות.
2. השהה תאים מחדש בקור סטרילי 1x PBS ב 1,000 תאים/μL.
3. לRag1 זכר-^/- apoe^- עכברים באמצעות isof, ולהזריק 100 μl (100,000 תאים) לכל עכבר באמצעות ורידי רטרו מסלולית או הזרקת הזנב באמצעות מזרק משובח במיוחד אינסולין. הכנס כמה עכברים באמצעות ה-PBS 1x כפקד.

6. קוונפיקציה של תאים תורמים ו פלזמה IgM

1. בזמן הרצוי לאחר העברה המאמצת, לנתח תאים שהועברו בעכברים הנמען על ידי מח עצם והקציר רקמת הטחול⁴ ו cy, להזרים. מכמת לוקליזציה תא תורם ו CXCR4 overexpression יטוי על ידי כתמים עבור תקליטור 45.1, תקליטור 45.2, ו CXCR4 ולנתח את התוצאות של cy try באמצעות תוכנה כגון Flowjo.
   הערה: עיין בטבלה 1 עבור נוגדנים הנמצאים בשימוש בשלב זה. ודא שלא להשתמש המשלים נוגדן כי זוהר בערוץ fitc כמו gfp יהיה נוכח בתאי תורם התמרה.
2. בידוד פלזמה על ידי הוספת 10 μL של 0.5 M EDTA כדי דם שלם שנאסף באמצעות ניקוב לב בזמן הקרבת בעלי חיים. צנטריפוגה דם שלם ב 7,000 x g ו סדרת מחלקים פלזמה לתוך שונים 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. חנות at-80 ° צ' עד ביצוע ניתוח של גורמים המופרשים כגון IgM על ידי אליסה⁴.

תוצאות

מבט כולל על הפרוטוקול מוענק באיור 1. איור 2 מציג העשרת תאים בעלי הצפק B-1a לאחר דלדול מגנטי של סוגים אחרים של תאי הצפק. לחיות סינגתן תאים בשבר פוסט-דלדול יש שיעור גדול יותר של^{CD19 + B} תאים לעומת F4/80 מקרופאגים, חסרים CD5^hi CD19^- T תאים, ולהכיל תדירות מוגב?...

Discussion

השיטה המסופקת כאן מאפשרת יציבה ויעילה באופן יחסי B-1a משלוח גנטי התא, בהעברה המאמצת vivo, זיהוי ולוקליזציה של תאים מוזרק. תאים זוהו 17 שבועות העברה לאחר התאים ונשמר ביטוי CXCR4 גדל. וירוס בתיווך המסירה הניבה 30-40% יעילות התמרה של הראשונית murine B-1a תאים עם השפעה מינימלית על הכדאיות התא בידינו (

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 micron filter caps	Falcon	352235
anti-biotin microbeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block	Life Technologies	MFCR00
B220 APC	eBioscience	17-0452-83	Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
CD19 APCef780	eBioscience	47-0193-82	Clone: eBio1D3
CD23 biotin	eBioscience	13-0232-81	Clone: B3B4
CD23 PECy7	eBioscience	25-0232-82	Clone: B3B4
CD3e biotin	eBioscience	13-0033-85	Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560580	Clone: A20
CD45.2 BV421	BD Biosciences	562895	Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice	N/A	N/A	Bred in house
CD5 PE	eBioscience	12-0051-83	Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC	eBioscience	17-9991-82	Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus	N/A	N/A	Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin	Life Technologies	MF48015	Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6	Treestar Inc.	License required
Gentamicin	Gibco	15710-064
Gr-1 biotin	eBioscience	13-5931-82	Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum	Gibco	16000-044
HEPES	Gibco	15630-080
IgM PECF594	BD Biosciences	562565	Clone: R6-60.2
Insulin syringes	BD Biosciences	329461
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405
Live/Dead Yellow	Life Technologies	L34968
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
NK1.1 biotin	BD Biosciences	553163	Clone: PK136
Non-essential amino acids	Gibco	11140-050
ODN 1668	InvivoGen	tlrl-1668
PBS	Gibco	14190-144
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Ter119 biotin	eBioscience	13-5921-82	Clone: Ter119