实验自身免疫性脑脊髓炎中枢神经系统淋巴细胞渗透的流量细胞计量分析

摘要

本手稿提供了在小鼠中诱导活性实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 的协议。还提出了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中渗透淋巴细胞的方法，以表明淋巴细胞如何参与中枢自身免疫性疾病的发展。

摘要

多发性硬化症（MS）是由环境因素和易感遗传背景共同作用的中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的典型疾病模型，广泛用于研究T淋巴细胞特异性骨髓抗原在中枢素引起炎症反应的发病机制。评估中枢子中的淋巴细胞如何调节疾病的发展是非常重要的。然而，由于难以从大脑中隔离和检测渗透淋巴细胞，测量中枢机中渗透淋巴细胞的数量和质量的方法非常有限。本手稿提供了一个协议，用于从 CNS 中分离、识别和表征渗透淋巴细胞，有助于我们了解淋巴细胞如何参与中枢自免疫性疾病的发展。

引言

作为一种慢性脱髓性疾病，MS影响全球约250万人，缺乏治疗^1。它也被认为是一种自身免疫性疾病，其中明蛋白抗原特异性T淋巴细胞引发炎症反应，导致在CNS²中脱叶和结子损伤。实验自身免疫性脑脊髓炎（EAE）作为^{CNS 3}中典型的自身免疫性脱毛病模型，已被广泛用于研究MS的致病机制。有两种方法可以诱导EE:一种是积极诱导EE，通过免疫动物的脑素成分，另一种是采用转移，通过转移脑原T细胞到^{受体2，4，5。,4,5}对EAE的感知性在不同的动物菌株6中^是不同的。在C57BL/6小鼠中，霉素奥利戈登德细胞蛋白（MOG）35~55挑战诱导一种单相疾病，在CNS中具有广泛的脱霉和炎症，该病在基因靶向小鼠⁷的实验中经常使用。

生成脑电图特异性活性T细胞是EE疾病的发生和发展所需的，是EE和MS的免疫学标志。当MOG 35-55 Ag遇到时，这些T淋巴细胞诱导炎症和诱导效应细胞进入中枢，导致去叶化和轴翁破坏^88，99。在EAE模型中，有充分证据表明神经抗原特异性^CD4+T细胞可以启动和维持神经炎和病理学^3,3，10。根据主要细胞因子的产生，CD4⁺ T淋巴细胞被分为不同的子集:Th1（以产生干扰素-γ）、Th2（以白细胞间4的产生为特征）和Th17（以白细胞间17的产生为特征）。据认为，Th1和Th17细胞的激活有助于诱导，维持和调节炎症消炎在EAE和MS通过分泌效应细胞因子 IFN-γ和IL-17，这能够激活巨噬细胞和招募嗜中性粒细胞到炎症部位加速^病变11。

由于自反应T细胞将BBB穿过到中枢，诱导MS和EE的疾病发展，因此分析CMS中的T细胞非常重要。然而，很少有既定的协议，从中枢¹²分离淋巴细胞。因此，开发了一种优化的方法，用于从大脑中隔离单核细胞，用标记CD45、CD11b、CD3、CD4、INF-g和IL-17分析T淋巴细胞，用于流细胞学。该方法使用MOG35~55辅助结核分 枝杆 菌H37 Ra和百日咳毒素工作溶液（PTX）在小鼠中诱导EE的主动免疫模型。然后，采用机械分离和密度梯度离心方法分离CNS单核细胞。最后，通过染色多个标记来识别大脑中的T淋巴细胞和子集，优化了流式细胞测量门控策略。

研究方案

这里描述的所有方法都经过了上海交通大学基础医学学院动物委员会的批准。

1. 材料的准备

1. 使用MOG35-55的 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 序列从商业来源获得冻干肽。确保肽的纯度为 >95%。在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中准备 10 mg/mL MOG 库存溶液，并储存在 -20°C。
2. 将一个100毫克的M.结核病H37 Ra放入25 mL的完全弗伦德佐剂M. tuberculosis（CFA）和混合中，准备4mg/mL的M.结核病H37 Ra库存溶液。将库存溶液储存在-20°C。
3. 通过将 50 μg PTX 添加到 50 mL 的 PBS 中，制备 1 ng/μL 百日咳毒素工作溶液 （PTX）。将工作溶液储存在-20°C。
4. 将所有抗体（即 FITC 抗小鼠 CD3、PE/Cy7 抗小鼠 CD4、PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD11b、Alexa Fluor700 抗小鼠 CD45.2、PE 抗小鼠 IL-17A 和 APC 抗小鼠 IFN-γ）储存在 4 °C。
5. 通过将 2 mM 乙烯二胺四乙酸 （EDTA） 和 1% 胎儿牛血清 （FBS） 加入 500 mL PBS，使流细胞测量染色 （FCS） 缓冲液。

2. C57BL/6小鼠外壳

1. 在8~12周大时使用雌性C57BL/6只小鼠。
2. 在注射前至少7天适应C57BL/6J小鼠。
3. 在12小时光/暗循环下，在无病原体条件下将小鼠安家在动物设施中，并免费提供水和标准颗粒食品。

3. C57BL/6小鼠免疫

1. 在室温 （RT） 下保留所有库存溶液 15 分钟，以确保完全补液。
2. 用 700 μL PBS 稀释 300 μL 的 MOG-肽库存溶液，用于制备 3 mg/mL 工作溶液。
3. 将 1 mL 的 M. 结核病 H37 Ra 库存溶液和 1 mL 的 MOG35-55 肽工作溶液放入单独的 10 mL 注射器中，然后使用四向停止公鸡乳化至少 10 分钟。在注射前确保完全乳化。
4. 麻醉小鼠在EAE的高峰期与内向注射1%五巴比妥钠（50毫克/千克）。
5. 使用 1 mL 注射器，皮下注射小鼠 100 μL 的 MOG 35×55/CFA 乳液 （300 μg/200 μL） 在两个位点，均在颈部附近的背部。皮下注射对照小鼠200μL的PBS。
6. 在同一天（第 0 天）和免疫后第 2 天 （PI）， 内皮酮注射小鼠 200 μL 的 1 ng/μL PTX 工作溶液。内向内向对照小鼠注射200μL的PBS。
7. 用加热垫把老鼠转移到他们的家笼里。
8. 在注射后，每天以盲性方式检查所有小鼠，以检查表^{11、13所示的神经体征}。 Table 1如果分数比四年级差，对动物实施安乐死。
9. 记录疾病过程中的体重变化。这是EE模型^{11，13中疾病活动的一个有价值的额外措施}。
10. 添加单个小鼠的临床体征第一天，除以组中小鼠的数量;结果是发病。添加单个小鼠 EAE 最高分数的第一天，并除以组中小鼠的数量;结果是峰值。

4. 大脑单细胞悬浮准备

1. 将密度梯度介质以 9:1 的比例稀释，在 15 mL 锥形管中与 PBS 一起产生最终 100% 溶液。
2. 麻醉小鼠在EAE的高峰期与1%的五巴比妥钠（50毫克/千克）内注射和内心内与20 mL的无菌冰冷PBS。使用 20 mL 注射器缓慢而稳定地将 PBS 注射到心脏的左心室并打开右心房，实现此目的。
3. 小心地将颅骨从鼻子切到颈部，然后用 50 mL 锥形管将大脑从颅箱中取出到 10 mL 的 RPMI 中。混合好，以去除粘附的红血球。然后通过吸气去除介质，并添加 10 mL 的 RPMI。
4. 将大脑和介质放在 100 mm 的盘中。用剃刀刀片细切。
5. 将 6 mL 从盘子转移到用干净的移液器进行冰冷的 7 mL 烧结玻璃均质器。避免在移液器中留下大量组织。少量是不可避免的。
6. 先用"松"柱塞研磨大脑，然后使用"紧"柱塞，直到悬浮液均匀，然后倒入预冷的15 mL锥形管中，并冰上保持。
7. 所有样品均质化后，估计体积。将 RPMI 的音量调整为 7 mL。然后将3 mL的冰冷100%基底膜基质放在一个冰冷的15 mL锥形离心管中，并加入7mL的脑均质，产生最终30%密度梯度介质。通过反转混合几次。不要漩涡。
8. 为确保界面清晰，在 RPMI 中小心缓慢地添加 1 mL 的 70% 底板密度梯度介质，并加入 3 mL 移液器。
9. 在 4 °C下以 800 x g 的离心机仅 20 分钟。 将加速度设置为 1，减速设置为 0。离心后，吸气几乎所有的顶部阶段，小心完全删除在顶部的梅林（图1）。
10. 将接口拆下到新的 15 离心管中。使用 RPMI 将音量调节到 10 mL。
11. 在 500 x g 下 离心 10 分钟。离心后，吸上经。将颗粒重新泵报在 ±200 μL 流式细胞测量染色 （FSC） 缓冲液中。然后，颗粒准备污渍的 FACS。

5. 大脑单细胞流动细胞学分析

1. 使用血细胞计和显微镜来计算细胞数。将10 μL的细胞加入10μL的锥蓝，混合好，并将10μL放在血细胞计上，以计算细胞。然后计算倒置显微镜（例如奥林巴斯倒置显微镜）下每个微升的活细胞数。
2. 在RPMI中，大约2 x^{10 6} 个细胞进入96井板的单一井中。
3. 加入500x细胞刺激鸡尾酒加上蛋白质运输抑制剂到井。
4. 在37°C下将盘子孵育在培养箱中4小时。
5. 在RT.丢弃上 流 水液，将细胞以400 x g离心5分钟，并在100μL的FCS缓冲液中重新填充细胞。
6. 用抗小鼠 CD16/CD32 Fc 块 （1:33） 预孵化细胞 4 °C 前 10 分钟，然后染色以阻止非特异性 Fc 中角相互作用。
7. 不洗涤就弄脏细胞表面标记。添加抗小鼠CD45.2（1:200）、抗小鼠CD11b（1:200）、抗小鼠CD3（1:200）和抗小鼠CD4（1:200）抗体。
   注:要确定正向和负性门，应染色每种颜色的荧光减一 （FMO） 和等型控制抗体。
8. 在4°C或冰上孵育板至少30分钟。防止光线。
9. 通过添加 FCS 缓冲区清洗细胞。将 200 μL/孔用于微刺激板。在 RT. 丢弃上一 代时 ，以 400 x g 的离心机 5 分钟。
10. 向每一井添加 200 μL 的细胞内 （IC） 固定缓冲液以固定细胞。确保在溶液中完全重新暂停电池。
11. 在RT.
12. 在RT下以400 x g 离心样品5分钟。丢弃上一杯。
13. 将 200 μL 的 1x 渗透缓冲液添加到每一个井中，并在 RT 时以 400 x g 离心样品 5 分钟。丢弃上一杯。
14. 将颗粒在残留体积中重新暂停，使用 1x 渗透缓冲液将体积调整到约 100 μL。
15. 加入抗小鼠IL-17A（1:200）和抗小鼠 IFN-g（1:200）抗体，以检测细胞内抗原。
16. 在4°C下孵育至少30分钟。 防止光线。
17. 将 100 μL 的 1x 渗透缓冲液添加到每一个井中，并在 RT 时以 400 x g 离心样品 5 分钟。丢弃上一杯。
18. 将染色细胞重新填充在100μL的流动细胞测量染色缓冲液中。
19. 按流式细胞学分析。
    注:调整流式细胞仪上的激光和补偿设置，将样品放在圆度计上，所有事件都按照制造商的建议进行记录。

6. 数据分析

1. 使用 FSC-A 与 FSC-H 和 SSC-A 与 SSC-H 的栅极。
2. 基于大小使用 FSC-A 和 SSC-A 的门活细胞。
3. 接下来，通过CD45+CD11b -细胞上的浇注，识别白细胞^（ 不包括单^核 细胞）。
4. 然后，通过对CD3+CD4+细胞进行浇注，识别CD4T淋巴细胞。
5. 最后，通过分别对 IFN-γ+ 细胞和 IL-17+ 细胞进行浇注来识别 Th1 和 Th17 子集，并使用等型对数控制和 FMO 确定正负总体。

结果

在对C57BL/6小鼠进行免疫接种后，所有小鼠每天进行称重、检查和评分，以发现神经体征。EAE 的代表性临床过程应导致图2A中所示的疾病曲线和图2B中所示小鼠体重的变化。C57BL/6用MOG35-55免疫的小鼠通常在第10-12天左右开始出现疾病症状，并在主动免疫后第15-21天左右达到疾病高峰（图2A）。重量变化是 EAE 模型中的一个有价值的指?...

讨论

本研究提出了在C57BL/6小鼠中使用MOG35-55诱导和监测EE的方案，该模型被认为是MS的典型神经免疫实验动物模型。 EAE可以根据研究的目的，诱导改变小鼠的菌株或用于诱导的蛋白质类型。例如，在SJL小鼠中使用PLP139~151肽可以诱发复发-复发的EE疾病过程，这特别适合评估复发^{15的治疗效果}。此处概述的实验程序也可以应用于其他 EAE 协议⁷。在此模型中，C57BL/6小鼠接?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK